閆廣寧，喻玲，賴續(xù)文，葉丹麗，王蔚，王卓才

0 引言

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青春期，具有局部侵襲和早期肺轉移的傾向。新輔助化療聯(lián)合手術切除可將5年生存率最高提至70%，但其余患者死于轉移和復發(fā)[1]。近年來腫瘤免疫療法為惡性腫瘤的治療提供了新的手段，在多種惡性腫瘤中取得了良好療效，其中CTLA-4和PD-1兩種免疫檢查點分子是研究熱點之一。CTLA-4是一種1型跨膜糖蛋白，主要在活化的T細胞上表達，CTLA-4相對CD28以更高的親和力競爭性結合B7，降低T細胞增殖能力和細胞因子的分泌[2-3]。PD-1在T細胞、B細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞中表達，在T細胞耗竭中起關鍵作用。PD-1在腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）上的表達可以導致腫瘤免疫耐受[4]。中和性抗體拮抗以上兩種分子可以在多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用。本文檢測了骨肉瘤中CTLA-4和PD-1的表達，分析其與臨床病理特征和預后的關系，為骨肉瘤免疫治療的靶點選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集本院2007—2016年初診初治并明確診斷的58例骨肉瘤患者，臨床病理學特征包括性別、年齡、發(fā)病部位、切除方式、術前化療、腫瘤最大直徑及Ennecking分期等，見表1。病理診斷經(jīng)2名以上副高以上職稱病理醫(yī)師復診確認。

表1 58例骨肉瘤患者的臨床病理特征Table 1 Clinicopathological characteristics of 58 osteosarcoma patients

1.2 免疫組織化學實驗

所有含骨標本經(jīng)脫鈣（質軟標本除外）、4%中性福爾馬林固定后石蠟包埋。免疫組織化學實驗經(jīng)過烤片、脫蠟、3%雙氧水封閉、EDTA高壓修復后，按照Envision法孵育抗體。一抗為CTLA-4（1:250，兔抗人，購自英國Abcam公司）和PD-1（1:200，小鼠抗人，購自加拿大GenomeMe公司）。二抗、抗體稀釋劑及DAB顯色劑均購自丹麥DAKO公司。

1.3 結果判讀

CTLA-4和PD-1均定位于細胞膜，出現(xiàn)完整的棕黃色膜染色判定為陽性細胞。隨機選取5個高倍鏡視野，按陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比計分：<3%為陰性（0分），≥3%～10%為1分，≥10%～<25%為2分，≥25%為3分。陽性細胞著色程度計分：陰性為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強陽性為3分。將上述兩項評分相乘作為最終結果：0～2分為陰性表達，3～9分為陽性表達。本實驗經(jīng)兩位資深病理醫(yī)師雙盲閱片。

1.4 隨訪

所有患者術后及化療結束后皆進行門診隨訪、電子病歷和電話追蹤?？偵嫫冢∣S）是指從手術后第一天至死亡或失訪時間；無病生存期（DFS）是指從腫瘤切除后到腫瘤復發(fā)或轉移的時間。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS25.0軟件進行統(tǒng)計分析。當進行生存分析時，采用Kaplan-Meier檢驗法，使用Log rank檢驗生存曲線差異。兩離散變量分析采用列聯(lián)表卡方檢驗或Fisher精確檢驗。多因素分析采用Cox比例風險模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-1及CTLA-4表達與骨肉瘤患者臨床病理特征的關系

PD-1表達于大部分骨肉瘤標本中，其中陽性表達31例（53.4%）。股骨比其他原發(fā)部位PD-1陽性比例更高（P=0.017）。接受過新輔助化療的患者PD-1陽性比例明顯高于未接受過的患者（P=0.036）。PD-1陽性患者腫瘤復發(fā)率顯著高于陰性患者（P=0.007）。PD-1陽性患者腫瘤轉移發(fā)生率顯著高于陰性患者（P=0.046）。PD-1表達與其他臨床病理數(shù)據(jù)比較無明顯差異。CTLA-4在骨肉瘤中表達較弱，其中陽性19例（32.8%）。CTLA-4陽性患者Ennecking分期較陰性患者更晚，但差異的統(tǒng)計學意義不顯著（P=0.051）。CTLA-4與其他臨床病理數(shù)據(jù)間比較無明顯差異，見圖1、表2。

表2 PD-1和CTLA-4表達水平與骨肉瘤患者的臨床病理參數(shù)的相關性 (n(%))Table 2 Correlation of PD-1 or CTLA-4 expression with clinicopathological characteristics of osteosarcoma patients (n(%))

圖1 PD-1和CTLA-4在骨肉瘤中的表達情況Figure 1 Expression of PD-1 and CTLA-4 in osteosarcoma

PD-1和CTLA-4雙陽性12例（20.7%），雙陰性20例（34.5%），單陽性26例（44.8%）。PD-1和CTLA-4雙陽性表達患者腫瘤復發(fā)率顯著高于雙陰性及單陽性組（P=0.035）。雙陽性表達患者腫瘤轉移率顯著高于雙陰性及單陽性組（P=0.047）。其他臨床病理數(shù)據(jù)間比較差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

2.2 PD-1與CTLA-4的表達與骨肉瘤患者預后的關系

本組中失訪12例，死亡27例，術后復發(fā)18例，遠處轉移29例，總生存率約53.4%。生存曲線分析顯示PD-1陰性患者的DFS及OS均顯著長于陽性患者（P=0.020;P=0.022）。CTLA-4陰性患者的DFS顯著長于陽性患者（P=0.014），但兩者OS沒有明顯差異。PD-1和CTLA-4的雙陰性組的預后最好，雙陽性組的預后最差，差異有統(tǒng)計學意義（DFS:P=0.005;OS:P=0.024），見圖3。

圖2 PD-1表達或CTLA-4表達與骨肉瘤患者預后的相關性Figure 2 Correlation of PD-1 or CTLA-4 expression with survival time of osteosarcoma patients

圖3 PD-1和CTLA-4共同表達情況與骨肉瘤患者生存期的相關性Figure 3 Correlation of double positive expression of PD-1 and CTLA-4 with survival time of osteosarcoma patients

2.3 骨肉瘤患者預后的獨立危險因素

經(jīng)單因素分析及查閱文獻后，我們認為手術方式、新輔助化療、Ennecking分期、腫瘤最大徑可能是影響患者預后的重要因素，因此將以上因素及PD-1和CTLA-4共表達情況納入Cox多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)Ennecking分期和PD-1、CTLA-4 共表達情況是DFS 的獨立危險因素（P=0.032,P=0.008），見表4，而在OS中則不是（P=0.101），見表5。

表4 各變量與骨肉瘤患者DFS的Cox回歸分析Table 4 Cox regression analysis of factors predicting DFS of osteosarcoma patients

表5 各變量與骨肉瘤患者OS的Cox回歸分析Table 5 Cox regression analysis of factors predicting OS of osteosarcoma patients

3 討論

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，常規(guī)治療方式是根治切除和化療的綜合治療，仍有部分患者發(fā)生復發(fā)或肺轉移，導致術后生存率顯著下降[4]。目前腫瘤免疫治療領域取得了重大突破，免疫檢查點抑制劑在多種實體瘤治療中有較好療效，但在骨肉瘤等軟組織腫瘤的研究才剛剛起步[5]。

PD-1是免疫檢查點分子之一，主要表達于T細胞。PD-1參與免疫抑制，在T細胞耗竭中起關鍵作用，導致腫瘤免疫受抑，進而促進腫瘤進展[6-7]。PD-L1和PD-L2是PD-1的主要配體，有研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤中PD-L1表達量與腫瘤轉移和死亡率有關[8-10]。但PD-L1抑制劑是否可以使晚期患者獲益尚有爭議[11]。本組接受新輔助化療后，骨肉瘤中PD-1的表達升高，提示化療藥物對腫瘤的毒性作用可能引起了免疫微環(huán)境的變化。根治術后復發(fā)的患者PD-1表達升高，推測可能與腫瘤免疫逃逸有關，提示免疫細胞的活性受抑使監(jiān)視殘留腫瘤細胞的功能失效，提升了腫瘤復發(fā)率[12]。本研究中PD-1陽性與腫瘤轉移有顯著關聯(lián)（P<0.05），推測PD-1信號參與了骨肉瘤細胞的轉移，與其他腫瘤研究一致[13]。另外股骨患者PD-1表達明顯高于脛骨及其他部位，PD-1表達是否與腫瘤部位有關還需要大宗樣本分析。生存分析表明，PD-1陽性表達患者的生存期和無病生存期較短，提示了PD-1陽性在骨肉瘤中是預后指標之一。

CTLA-4主要在活化的T細胞上表達，可以抑制腫瘤免疫反應并促進腫瘤進展[14-15]。在其他腫瘤研究中都發(fā)現(xiàn)CTLA-4的表達上調(diào)，且與不良預后相關[16]。CTLA-4單抗最先應用于治療惡性黑色素瘤，取得了不錯的療效，但與PD-1抑制劑治療黑色素瘤相比，其療效稍差而毒性較高，并且與PD-1療法已被應用于多種惡性腫瘤治療不同，CTLA-4單抗的應用仍然限制在惡性黑色素瘤之中，而在其他腫瘤中效果不佳[17-18]。本組CTLA-4表達較弱，且與患者Ennecking分期有一定關聯(lián)（P=0.051），分期較晚的患者CTLA-4表達比例較高，提示CTLA-4抑制免疫細胞功能，促進腫瘤生長。生存分析發(fā)現(xiàn)CTLA-4與OS關系不密切，但陽性表達的患者DFS更短，提示CTLA-4可能影響腫瘤復發(fā)及轉移，這與其他腫瘤的研究一致[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-1/PD-L1會上調(diào)CTLA-4表達，進而造成治療抵抗[4]，聯(lián)用PD-1和CTLA-4抑制劑療效更好，在動物實驗中得到印證[3,19-20]。本組PD-1和CTLA-4雙陽性的患者發(fā)生術后復發(fā)和轉移的比例遠高于雙陰性或單陽性的患者，提示PD-1和CTLA-4在骨肉瘤復發(fā)轉移中可能存在協(xié)同作用。因此，PD-1和CTLA-4聯(lián)合檢測是預測患者復發(fā)轉移風險較好的指標。生存分析中發(fā)現(xiàn)，無論是OS還是DFS，雙陽性患者的預后較差，而雙陰性預后則較好，并且是患者DFS的獨立危險因素。由此推測，PD-1和CTLA-4的雙重阻斷可能對骨肉瘤有更好的治療效果，與文獻一致[20]。

綜上所述，本組檢測骨肉瘤樣本中PD-1和CTLA-4表達，發(fā)現(xiàn)其與骨肉瘤患者臨床病理及預后有相關性，并且PD-1和CTLA-4的雙陽性表達患者預后不良，聯(lián)用PD-1單抗和CTLA-4單抗相比單一免疫療法，可能對骨肉瘤患者療效更好且更易于控制不良反應。本研究探索了預測骨肉瘤患者預后的相關指標，并為骨肉瘤免疫治療提供了依據(jù)。