任建偉，周祖邦，馬雯娟，楊大雄，任醫(yī)群，張芝，牛彥強(qiáng)，曹雷

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）發(fā)病率和死亡率目前居全球癌癥譜第三位和第二位，并呈平行增長(zhǎng)勢(shì)態(tài)，加劇了全球疾病負(fù)擔(dān)[1]。其中高達(dá)50%患者合并肝轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移灶大多不能一線手術(shù)切除[2-3]，我國(guó)CRC肝轉(zhuǎn)移的主要治療理念是積極化療、積極手術(shù)，包括新輔助治療和轉(zhuǎn)化治療的目的都是獲取適宜的手術(shù)機(jī)會(huì)，但化療藥物的毒副作用、耐藥性及手術(shù)難度大等問題一直困擾著我們[4]。隨著腫瘤免疫療法的不斷突破，越來越多的證據(jù)表明，局部熱消融與免疫檢查點(diǎn)阻斷治療相結(jié)合的癌癥治療方法前景廣闊[5]。程序性死亡配體1（PD-L1）是重要的免疫檢查點(diǎn)，PD-L1的抗體阻斷可以激活抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而使部分癌癥患者獲得緩解[6]。微波消融（microwave ablation,MWA）作為一種自身優(yōu)勢(shì)明顯的熱消融方式，近年來在CRC肝轉(zhuǎn)移治療中演變迅速，尤其對(duì)≤3 cm的病灶能提供與手術(shù)相仿的效果[7-8]。盡管熱消融治療存在一定優(yōu)勢(shì)，但總體而言較高的復(fù)發(fā)率仍是一個(gè)治療難題[9]。研究顯示[10]，PD-L1表達(dá)與CRC肝轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后相關(guān)，但具體治療選擇的預(yù)后價(jià)值還需進(jìn)一步研究。本研究通過檢測(cè)PD-L1在CRC原發(fā)灶中的表達(dá)水平，分析其與臨床特征的關(guān)系，以及對(duì)肝轉(zhuǎn)移MWA術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值，為CRC肝轉(zhuǎn)移患者的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2019年4月—2021年3月于甘肅省人民醫(yī)院超聲科行MWA治療的CRC肝轉(zhuǎn)移患者28例作為研究對(duì)象。其中男20例，女8例；年齡29～72歲，中位年齡58歲；原發(fā)灶位置：直腸19例，結(jié)腸9例；肝轉(zhuǎn)移出現(xiàn)時(shí)間（同時(shí)、異時(shí)[4]）：異時(shí)22例，同時(shí)6例；肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目：?jiǎn)伟l(fā)15例，多發(fā)13例；肝轉(zhuǎn)移瘤最大徑：≤3 cm 19例，>3 cm 9例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前未接受放療和化療；（2）原發(fā)病灶行根治性手術(shù)切除，術(shù)后經(jīng)病理確診為CRC；（3）無論同時(shí)或異時(shí)肝轉(zhuǎn)移都符合《中國(guó)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷和綜合治療指南（2020版）》，且肝功能Child-Pugh分級(jí)為A或B級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有其他腫瘤；（2）臨床病理及隨訪資料不完整者。本研究經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 PD-L1蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)及判讀標(biāo)準(zhǔn) 試劑：PD-L1（SP263）抗體試劑及DAB染色液均購(gòu)自西安元鼎體外診斷試劑有限公司。檢測(cè)方法：使用CRC石蠟包埋標(biāo)本，4 μm厚度切片，在羅氏全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀上進(jìn)行染色，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行，染色結(jié)束后清洗、封片，顯微鏡觀察。

檢測(cè)PD-L1在腫瘤細(xì)胞（TC）和腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中（TIC）的表達(dá)情況，PD-L1蛋白定位于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)所觀察指標(biāo)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。分別計(jì)算PD-L1染色陽性TC/TIC在整張片的TC/TIC總數(shù)中所占的百分比，≥5%定義為陽性表達(dá)，<5%為陰性表達(dá)[11]。

1.2.2 CRC肝轉(zhuǎn)移病灶MWA治療及術(shù)后隨訪 儀器：超聲診斷儀LOGIQ E9（美國(guó)GE公司），造影劑為聲諾維（上海Bracco公司），微波消融儀（南京維京九洲醫(yī)療器械研發(fā)中心）。本研究病例MWA操作由介入超聲科經(jīng)驗(yàn)豐富的高年資醫(yī)師完成，常規(guī)使用超聲定位并引導(dǎo)消融，術(shù)后行超聲造影，確認(rèn)病灶是否消融完全，必要時(shí)行補(bǔ)充消融。

術(shù)后通過電子病例、門診記錄及電話等方式，每3個(gè)月對(duì)患者復(fù)發(fā)情況進(jìn)行隨訪，并記錄患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存期（RFS），末次隨訪時(shí)間為2021年12月31日。復(fù)發(fā)的定義：增強(qiáng)影像學(xué)檢查提示靶病灶最大徑至少增加20%或出現(xiàn)新病灶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用χ2或Fisher精確檢驗(yàn)分析不同PD-L1表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系，Kaplan-Meier計(jì)算累積無復(fù)發(fā)生存率及繪制曲線，Log rank檢驗(yàn)進(jìn)行不同PD-L1表達(dá)的無復(fù)發(fā)生存分析。Cox回歸分析CRC肝轉(zhuǎn)移患者M(jìn)WA術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1在CRC原發(fā)灶TC和TIC中的表達(dá)

CRC肝轉(zhuǎn)移患者原發(fā)灶中，PD-L1在TC中的陽性表達(dá)為14.3%（4/28），在TIC中為46.4%（13/28），且主要表達(dá)在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，見圖1。

圖1 PD-L1在CRC原發(fā)灶TC(A)和TIC(B)中的陽性表達(dá)(IHC ×200)Figure 1 Positive PD-L1 expression in TCs(A) and TICs(B)of primary CRC (IHC ×200)

2.2 不同PD-L1蛋白表達(dá)與CRC肝轉(zhuǎn)移患者臨床特征的關(guān)系

CRC肝轉(zhuǎn)移患者中，原發(fā)灶TIC中PD-L1表達(dá)在肝轉(zhuǎn)移瘤最大徑間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在年齡、性別、原發(fā)灶位置、肝轉(zhuǎn)移出現(xiàn)時(shí)間、轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；原發(fā)灶TC中的PD-L1表達(dá)在年齡、性別、原發(fā)灶位置、肝轉(zhuǎn)移出現(xiàn)時(shí)間、轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目、轉(zhuǎn)移瘤最大徑間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 CRC肝轉(zhuǎn)移患者原發(fā)灶TC和TIC中PD-L1的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 (n=28)Table 1 Relation between PD-L1 expression in TCs and TICs of primary loci and clinical features of patients with CRC liver metastasis (n=28)

2.3 不同PD-L1表達(dá)對(duì)CRC肝轉(zhuǎn)移患者M(jìn)WA術(shù)后復(fù)發(fā)的影響

28例患者均得以有效隨訪，隨訪時(shí)間2～30個(gè)月，中位隨訪12個(gè)月，隨訪過程中18例患者出現(xiàn)消融后復(fù)發(fā)。CRC原發(fā)灶TC中的PD-L1陽性表達(dá)患者中位無復(fù)發(fā)生存時(shí)間為10個(gè)月，陰性表達(dá)患者為12個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2A。CRC原發(fā)灶TIC中的PD-L1陽性表達(dá)患者中位無復(fù)發(fā)生存時(shí)間為8個(gè)月，陰性表達(dá)患者為18個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2B。

圖2 TC(A)和TIC(B)中PD-L1陽/陰性表達(dá)患者的RFSFigure 2 RFS of patients with positive or negative PD-L1 expression in TC(A) and TIC(B)

2.4 Cox回歸分析影響CRC肝轉(zhuǎn)移患者M(jìn)WA術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素

單因素分析顯示，原發(fā)灶TIC中PD-L1表達(dá)、肝轉(zhuǎn)移瘤最大徑均是影響CRC肝轉(zhuǎn)移患者M(jìn)WA術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素（P<0.05），多因素分析顯示，原發(fā)灶TC中PD-L1、原發(fā)灶TIC中PD-L1、肝轉(zhuǎn)移瘤最大徑均不是MWA術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P>0.05），見表2。

表2 影響CRC肝轉(zhuǎn)移患者M(jìn)WA術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素分析Table 2 Multivariate analysis of recurrence after MWA in patients with CRC liver metastasis

3 討論

CRC的發(fā)生、發(fā)展涉及十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，其機(jī)制尚未完全明確，研究[12]顯示，腫瘤免疫微環(huán)境從中扮演著重要角色，在所有階段都暗示了腫瘤細(xì)胞與免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的相互作用，預(yù)先存在的免疫參數(shù)可能與患者的生存相關(guān)。PD-1/PD-L1信號(hào)通路是腫瘤免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的熱門靶點(diǎn)，CRC肝轉(zhuǎn)移部分患者已從中獲益[13]。熱消融治療不僅可以殺死癌細(xì)胞，還能誘發(fā)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，已廣泛應(yīng)用于治療原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性肝惡性腫瘤。目前局部熱消融聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)阻斷治療是一個(gè)非常活躍的腫瘤研究領(lǐng)域，意在發(fā)揮兩者的免疫協(xié)同作用，且相繼顯露出一定的潛力[14]。一項(xiàng)關(guān)于CRC肝轉(zhuǎn)移的臨床試驗(yàn)表明[15]，熱消融治療誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)非常頻繁，且單一手段還不足以阻止腫瘤進(jìn)展。因此，本研究探索PD-L1免疫靶點(diǎn)和局部熱消融之間的聯(lián)系，為今后其在CRC肝轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

PD-L1是B7家族共刺激/共抑制分子的成員，可表達(dá)于包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型，腫瘤細(xì)胞表面PD-L1可與效應(yīng)T細(xì)胞上的受體PD-1結(jié)合，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞活性，使得腫瘤細(xì)胞逃避免疫攻擊得以生存發(fā)展[16]。目前關(guān)于PD-L1的免疫檢測(cè)結(jié)果的判讀尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究CRC原發(fā)灶TC和TIC的PD-L1陽性率與部分相關(guān)研究[17-18]結(jié)果大致相同，且表現(xiàn)出一定的臨床意義。

研究發(fā)現(xiàn)[19]，CRC中PD-L1的陽性表達(dá)與良好的預(yù)后相關(guān)。但在本研究中CRC肝轉(zhuǎn)移患者TC的PD-L1陽性率僅為14.3%，不僅提示著患者預(yù)后不良，而且針對(duì)PD-L1靶點(diǎn)的免疫治療方法將嚴(yán)重受阻。研究顯示[18,20]，CRC肝轉(zhuǎn)移灶PD-L1表達(dá)水平高于原發(fā)灶，肝轉(zhuǎn)移灶的微環(huán)境可能存在更強(qiáng)的免疫抑制。本研究由于條件限制，未能檢測(cè)肝轉(zhuǎn)移灶的PD-L1表達(dá)，但發(fā)現(xiàn)了原發(fā)灶TIC的PD-L1表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移瘤最大徑相關(guān)，分析可能是肝轉(zhuǎn)移灶TC和TIC的PD-L1存在較高的表達(dá)，使免疫微環(huán)境形成了較強(qiáng)的抑制，從而間接影響了肝轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)狀況。CRC原發(fā)灶TIC的PD-L1表達(dá)可能間接影響肝轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)狀況。

局部熱消融術(shù)，對(duì)于無法獲得根治性切除的肝惡性腫瘤已成為安全有效的替代療法[21]，主要包括微波消融（MWA）和射頻消融（RFA）。與RFA相比，MWA具有消融面積大、瘤內(nèi)溫度高、手術(shù)時(shí)間短、“熱沉”效應(yīng)低等優(yōu)勢(shì)[22]。超聲技術(shù)是臨床常用的熱消融引導(dǎo)方式，Qin等[23]關(guān)于超聲引導(dǎo)下MWA治療CRC肝轉(zhuǎn)移經(jīng)驗(yàn)回顧，總共治療411個(gè)病灶，99.27%的病灶完全消融，表明是一種安全有效的方法。另有研究顯示[24]，不充分局部熱消融會(huì)造成殘留病灶加速生長(zhǎng)及越早復(fù)發(fā)。腫瘤大小已被證明是影響熱消融術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素[25]，在本研究同樣有所體現(xiàn)，肝轉(zhuǎn)移瘤最大徑成為CRC肝轉(zhuǎn)移MWA術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。盡管我們?cè)贛WA術(shù)后即可行超聲造影確認(rèn)消融是否完全，但不同術(shù)者水平存在差異，尤其對(duì)于體徑較大的肝轉(zhuǎn)移瘤，很難做到微觀意義的完全消融。故CRC肝轉(zhuǎn)移瘤體徑較大者若行單一局部MWA治療，術(shù)后存在復(fù)發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，不足以達(dá)到預(yù)期的治療效果。一項(xiàng)生物實(shí)驗(yàn)表明[26]，在MWA治療不充分的條件下，通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，與抗PD-L1阻斷抗體相結(jié)合帶來了明顯的免疫協(xié)同效應(yīng)，不僅阻止了局部腫瘤進(jìn)展，還抑制了現(xiàn)有的轉(zhuǎn)移。本研究中，CRC肝轉(zhuǎn)移MWA術(shù)后1年無復(fù)發(fā)率為53.6%，結(jié)果稍低于全球CRC肝轉(zhuǎn)移MWA術(shù)后無復(fù)發(fā)水平[7]，但總體而言仍展現(xiàn)出較高復(fù)發(fā)的弊端，亟需一種策略來改變現(xiàn)狀。CRC原發(fā)灶TIC的PD-L1表達(dá)是影響肝轉(zhuǎn)移灶MWA術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，以及與患者累積無復(fù)發(fā)生存時(shí)間相關(guān)。如此印證了本文前面所述，預(yù)先存在的免疫參數(shù)可能會(huì)影響患者的預(yù)后和生存，但CRC原發(fā)灶TIC的PD-L1表達(dá)和肝轉(zhuǎn)移灶MWA術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本研究由于MWA術(shù)后中位隨訪時(shí)間較短，僅觀察到4例死亡，故未進(jìn)行患者生存時(shí)間分析。且為小樣本量的回顧性研究，故仍需更多的研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)。

綜合本研究，CRC肝轉(zhuǎn)移患者原發(fā)灶TIC的PD-L1表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移瘤的進(jìn)展有關(guān)，可能增加肝轉(zhuǎn)移MWA術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。提示局部熱消融聯(lián)合PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制治療的策略可能具有一定的應(yīng)用價(jià)值。因此，可以對(duì)CRC肝轉(zhuǎn)移患者將局部熱消融與PD-L1的抗體阻斷治療予以合理結(jié)合，以期最大限度提高治療效果，從而改善患者預(yù)后。