張人丹，趙春艷，姚佳欣，胡先華，母波

0 引言

胰腺癌是一種臨床癥狀隱匿、惡性程度高且死亡率高的消化道惡性腫瘤。據(jù)最新臨床文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，目前胰腺癌仍然是惡性腫瘤里五年生存率最低的腫瘤，僅為10%[1]。胰腺癌的治療方法仍以根治性手術(shù)切除為主，但是胰腺癌往往發(fā)現(xiàn)較晚，患者確診時(shí)，因腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移或不可手術(shù)切除而喪失手術(shù)機(jī)會[2]。近年來在其他腫瘤治療中取得良好效果的靶向治療、免疫治療等在胰腺癌的臨床試驗(yàn)中效果仍不明顯。因此，迫切需要尋求新的生物標(biāo)志物和新的靶向位點(diǎn)，探究其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

OASL是一種蛋白質(zhì)編碼基因，編碼59kDa的蛋白質(zhì)，故又稱p59OASL。它位于12q24.31，有7個(gè)外顯子，主要在骨髓、胃和肺中表達(dá)，與OAS1、OAS2和OAS3一起形成干擾素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)保守家族。有報(bào)道指出，OASL基因可能是維持肺癌細(xì)胞對ac-Roots敏感度的決定性調(diào)節(jié)因子之一，并可能與耐藥性的發(fā)展有關(guān)[3]。本研究在對TCGA數(shù)據(jù)庫中OASL基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，對胰腺癌細(xì)胞株panc-1敲減和過表達(dá)OASL，探討其對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。希望能為胰腺癌的臨床診治尋找到新的靶向標(biāo)志物，優(yōu)化診治方案，延長患者的生存期。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人類胰腺癌panc-1細(xì)胞購自中國上海中科院細(xì)胞庫。敲減panc-1細(xì)胞OASL基因的shRNA以及過表達(dá)OASL基因的慢病毒均購買于上海吉凱基因科技有限公司。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（貨號：PM150210）、胎牛血清（貨號：164210-50）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胰酶（貨號：SH30042.01）、雙抗（貨號：SV30010）購自美國Hyclone公司，Lipo8000?轉(zhuǎn)染試劑（貨號：C0533）、嘌呤霉素（貨號：ST551）、RIPA裂解液（貨號：P0013B）、10% Tris-Gly預(yù)制膠（貨號：P0455S）、PVDF膜（貨號：FFP32）、兔抗人GAPDH多克隆抗體（貨號：AF1186）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號：A0208）、MTT試劑（貨號：ST316）均購自上海碧云天生物科技公司，傷口愈合插件（貨號：80209）購自德國Ibidi公司，兔抗人OASL多克隆抗體（貨號：821065）購自成都正能生物，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Fermentas（貨號：K1622）、PowerUp SYBR Green預(yù)混液（貨號：A25742）均購自美國Thermo Scientific公司，qPCR引物均購自北京擎科生物科技有限公司。GAPDH引物序列：正義：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反義：5’-GGCTGTTGTCATACTICICATGG-3’；OASL引物序列：正義：5’-CTGATGCAGGAACTGTATAGCAC-3’，反義：5’-CACAGCOTCTAGCACCTCTT-3’。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)方法分析OASL與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系 本研究利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析不同疾病狀態(tài)（腫瘤或正常）下OASL基因的表達(dá)情況及生存分析。在數(shù)據(jù)庫中選取Single Gene Analysis，輸入基因名稱：OASL，再分別點(diǎn)擊Boxplots和Stage Plots，在Datasets Selection中選擇PAAD；在Survival中選擇Survival Plots，在Methods中分別選擇Overall Survival和Disease Free Survival。

利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫 (http://kmplot.com/analysis/) 評估OASL的表達(dá)與胰腺癌患者總生存期（OS）和無復(fù)發(fā)生存期（RFS）的關(guān)系。在該平臺中點(diǎn)擊pan-cancer RNA-seq，Gene symbol中輸入目的基因OASL，Split patients中選擇Auto select best cutoff，Cancer中選擇Pancreatic ductal adenocarcinoma，Survival分別選擇OS和RFS。從TCGA數(shù)據(jù)庫中檢索胰腺癌患者的臨床資料，用R語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。調(diào)整后的P值<0.05和|log2（倍數(shù)變化）| >1被定義為閾值。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 細(xì)胞培養(yǎng)：人類胰腺癌panc-1細(xì)胞使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

shRNA轉(zhuǎn)染：當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，覆蓋培養(yǎng)皿約90%面積時(shí)，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，胰蛋白酶消化細(xì)胞，再加入完全培養(yǎng)基配制成細(xì)胞懸液，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，當(dāng)每孔細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入2 ml新鮮的完全培養(yǎng)基。取一個(gè)EP管，按照說明書以每孔加入125 μl Opti-MEM，再加入2.5 μg質(zhì)粒，最后加入4 μl Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑（質(zhì)粒用量（μg）和Lipo8000?（μl）的用量比例為1:1.6）配置好混合液。每孔加入125 μl轉(zhuǎn)染試劑—質(zhì)?；旌衔?，輕輕混勻。放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。加入含嘌呤霉素（Puromycin）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞。

慢病毒轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的panc-1 細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到20%～30%時(shí)，按照說明書推薦的MOI值（MOI=10），加入稀釋為1×108TU/ml濃度的病毒和HitransG P液。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h后，更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。加入含嘌呤霉素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)分組：將shRNA轉(zhuǎn)染所獲得的OASL基因穩(wěn)定低表達(dá)的panc-1細(xì)胞株命名為KD-OASL組，轉(zhuǎn)染的陰性對照的panc-1細(xì)胞株命名為KD-NC組。將病毒轉(zhuǎn)染所獲得的OASL基因穩(wěn)定高表達(dá)的panc-1細(xì)胞株命名為OE-OASL組，轉(zhuǎn)染的陰性對照的panc-1細(xì)胞株命名為OE-NC組。

1.2.3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，提取RNA。采用20 μl體系反轉(zhuǎn)錄。按順序在EP管中加入cDNA模板3 μg、Oligo(dT)18Primer 1 μl、Random Hexamer Primer 1 μl、RNA free ddH2O配滿12 μl?；靹?，1 000 r/min，短暫離心10 s，65℃孵育5 min，冰上冷卻，1 000 r/min，離心10 s，再冰上冷卻。按順序加入5× Reaction Buffer 4 μl、RiboLock RNase Inhibitor 1 μl、10 mmol/L dNTP Mix 2 μl、ReverAidTMReverse Transcriptase 1 μl。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 60 min，75℃ 5min。使用10 μl體系進(jìn)行RT-qPCR。每組加入cDNA 2 μl，PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 5 μl，F(xiàn)orward Primer 0.2 μl，Reverse Primer 0.2 μl，ddH2O 2.6 μl。反應(yīng)條件為：50℃ 120 s，95℃ 120 s，95℃ 15 s，57℃15 s，72℃ 60 s，95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s，37℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，轉(zhuǎn)染效率用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) RIPA與蛋白酶抑制劑按照100:1的比例混勻，用于裂解細(xì)胞。取適量提取的蛋白，與5× SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液以4:1的體積比例混勻，60℃煮15 min。取10% Tris-Gly預(yù)制膠，在各泳道中加入25 μg蛋白進(jìn)行電泳。用0.45 μm PVDF膜轉(zhuǎn)膜后，將膜放入5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。再加入稀釋好的一抗，4℃緩慢搖動孵育過夜。加入稀釋好的二抗，室溫在搖床上緩慢搖動孵育1 h。將配好的化學(xué)發(fā)光液滴在PVDF膜上，在熒光成像儀內(nèi)進(jìn)行成像檢測。Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.2.5 MTT實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，在24、48、72、96、120 h分別加入MTT試劑，每孔10 μl，置于培養(yǎng)箱孵育4 h，吸去上清液，小心不要吸掉孔底部形成的深紫色產(chǎn)物formazan，每孔再加入100 μl DMSO，將96孔板放在搖床上緩慢搖動30 min，待formazan結(jié)晶完全溶解后，于酶標(biāo)儀595 nm處檢測各組細(xì)胞的吸光度值。

1.2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞分別接種6孔板中，每孔300個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入2 ml DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約10天，待長出肉眼可見的克隆，去掉培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用4%的多聚甲醛對細(xì)胞固定15 min，吸棄4%的多聚甲醛，加入0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去染液，晾干，拍照。使用 Image J 軟件計(jì)數(shù)各組克隆數(shù)。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞分別接種于傷口愈合插件中，每孔3×104個(gè)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長至孔底90%以上面積時(shí)，取出小室插件，PBS清洗2次，加入無血清培養(yǎng)基，分別在0、12、24、36、48 h拍照，用Image J軟件計(jì)算劃痕面積。

1.2.8 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基制備成濃度為每毫升1×105個(gè)細(xì)胞懸液，取出Transwell小室放入24孔板，向每個(gè)小室的上室加入200 μl重懸的細(xì)胞懸液，下室加入600 μl含10%FBS的完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用PBS清洗小室2次，加入4%的多聚甲醛固定15 min，吸棄4%的多聚甲醛，再加入0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去染液，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，晾干后在顯微鏡下觀察，拍照。使用Imaging J軟件計(jì)數(shù)各組細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

One-way ANOVA分析OASL基因在胰腺癌腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達(dá)差異；Log rank檢驗(yàn)分析OASL基因表達(dá)與胰腺癌患者臨床預(yù)后的相關(guān)性；t檢驗(yàn)分析OASL基因差異表達(dá)；所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次。應(yīng)用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用表示，兩組計(jì)量資料之間比較采用t檢驗(yàn)，三組及以上計(jì)量資料采用單因素方差分析。GraphPad Prism 9和Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理和繪圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OASL表達(dá)差異分析

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，OASL在腫瘤組織中高表達(dá)，見圖1A～B。并且，OASL基因在胰腺癌Ⅰ期表達(dá)量較低，而在Ⅱ～Ⅳ期中OASL基因表達(dá)顯著升高，見圖1C，說明OASL的表達(dá)與胰腺癌的不同病理分期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00262）。

圖1 OASL基因過表達(dá)后與腫瘤增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of proteins related to tumor proliferation,migration,and invasion after the overexpression of OASL gene

2.2 不同OASL表達(dá)的患者生存分析

分析發(fā)現(xiàn)，OASL高表達(dá)的胰腺癌患者OS明顯短于低表達(dá)患者（P<0.05），而OASL表達(dá)量與患者的DFS無關(guān)（P=0.63），見圖2A～B。Kaplan-Meier plotter評估發(fā)現(xiàn)，OASL的表達(dá)與胰腺癌患者的OS和RFS均相關(guān)（P=0.001,P=0.03），見圖2C～D。

圖2 GEPIA(A,B)和Kaplan-Meier plotter(C,D)中胰腺癌患者OASL表達(dá)量與總生存期、無病生存期和無復(fù)發(fā)生存期的關(guān)系Figure 2 Relationship between OASL expression and OS,DFS and RFS of patients with pancreatic cancer in GEPIA(A,B) and Kaplan-Meier plotter(C,D) database

2.3 OASL表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

根據(jù)OS的最佳閾值將TCGA數(shù)據(jù)庫中胰腺癌患者（n=174）分為高OASL表達(dá)組和低OASL表達(dá)組。結(jié)果顯示，兩組OASL的表達(dá)與患者年齡、TNM分期、殘留腫瘤、生活狀況等有關(guān)（P<0.05），見表1。

表1 TCGA中胰腺癌患者OASL表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 (n(%))Table 1 Association between OASL expression and clinicopathological parameters in patients with pancreatic cancer in TCGA database (n(%))

2.4 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率

將用shRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用嘌呤霉素持續(xù)篩選，經(jīng)過擴(kuò)增后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率均高于80%；通過慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)OASL的panc-1細(xì)胞，各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高于80%，見圖3A。

2.5 RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染細(xì)胞中OASL基因表達(dá)

與胰腺癌panc-1細(xì)胞和KD-NC細(xì)胞相比，KDOASL細(xì)胞OASL基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)顯著降低（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.001;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.001）；與胰腺癌panc-1細(xì)胞和OE-NC細(xì)胞相比，OE-OASL細(xì)胞的OASL在分子水平的表達(dá)顯著增加（OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.006;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.006），見圖3B。

2.6 Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中OASL基因在蛋白水平的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)證明，在蛋白水平上KD-OASL細(xì)胞OASL的表達(dá)顯著降低（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.009;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.008），OE-OASL細(xì)胞的OASL表達(dá)明顯增高（OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.005;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.006），見圖3C。

圖3 細(xì)胞熒光(A)、RT-qPCR(B)和Western blot實(shí)驗(yàn)(C)檢測OASL敲減和過表達(dá)效率Figure 3 Knockdown and overexpression efficiency determined by cell-fluorescence(A),RT-qPCR(B),and Western blot analysis(C)

2.7 MTT實(shí)驗(yàn)檢測OASL基因?qū)?xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示：KD-OASL細(xì)胞的增殖能力顯著低于panc-1和KD-NC細(xì)胞，48 h時(shí)開始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.031;KDOASL組vs.KD-NC組，P=0.033），而OE-OASL細(xì)胞的增殖能力與panc-1細(xì)胞和OE-NC細(xì)胞相比明顯增高（48 h時(shí),OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.045;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.044），見圖4A。

2.8 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測OASL基因?qū)σ认侔┘?xì)胞克隆能力的影響

與panc-1和KD-NC相比，KD-OASL的集落形成能力顯著降低（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.006;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.006），OE-OASL細(xì)胞集落形成能力顯著提高（OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.008;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.007），見圖4B，結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)一致。

圖4 MTT法(A)和平板克隆法(B)檢測KD-OASL和OE-OASL的增殖能力Figure 4 Proliferation ability of KD-OASL and OE-OASL detected by MTT(A) and plate-cloning(B) assay

2.9 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測OASL基因?qū)σ认侔┘?xì)胞遷移能力的影響

與panc-1細(xì)胞和KD-NC細(xì)胞相比，KD-OASL細(xì)胞的遷移能力被顯著抑制（48 h時(shí),KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.004;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.003），而OE-OASL細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)（48 h時(shí),OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.004;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.003），見圖5A，說明OASL基因與panc-1細(xì)胞的遷移能力呈顯著正相關(guān)性。

2.10 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測OASL基因?qū)σ认侔┘?xì)胞遷移能力的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KD-OASL細(xì)胞組穿過的細(xì)胞數(shù)明顯少于panc-1細(xì)胞組和KD-NC細(xì)胞組（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.009;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.010），而OE-OASL細(xì)胞組穿過的細(xì)胞數(shù)顯著增加（OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.006;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.005），見圖5B。這說明OASL基因能影響胰腺癌panc-1細(xì)胞的遷移能力。

圖5 劃痕(A)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)(B)檢測KD-OASL和OE-OASL的遷移能力Figure 5 Migration ability of KD-OASL and OE-OASL detected by scratch assay(A) and Transwell experiments(B)

2.11 Western blot檢測增殖、遷移相關(guān)蛋白的變化情況

結(jié)果顯示，在KD-OASL組中p-STAT3的表達(dá)顯著提高（均P=0.003），而STAT3（KD-OASL組vs.panc-1組，P=0.019;KD-OASL組vs.KD-NC組，P=0.013）、BAK（均P=0.003）的表達(dá)水平顯著降低，見圖6A，OE-OASL細(xì)胞組中卻顯示相反的結(jié)果，p-STAT3的表達(dá)被抑制（均P=0.004），STAT3（均P=0.019）和BAK（OE-OASL組vs.panc-1組，P=0.001;OE-OASL組vs.OE-NC組，P=0.002）表達(dá)水平明顯增高，見圖6B。

圖6 OASL基因敲減(A)和過表達(dá)(B)后與腫瘤增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)Figure 6 Expression of proteins related to tumor proliferation,migration,and invasion after knockdown(A) and overexpression(B) of OASL gene

3 討論

胰腺癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，診斷和治療難度較大。其中約90%是起源于導(dǎo)管上皮的導(dǎo)管腺癌[4]。近年，雖然關(guān)于胰腺癌的治療得到了廣泛的發(fā)展，包括手術(shù)治療、放射治療、化療以及基因治療等。但因?yàn)槿狈μ囟ǖ陌Y狀和早期標(biāo)志物，85%的患者在確診時(shí)已是局部晚期和（或）發(fā)生轉(zhuǎn)移?；颊咝g(shù)后5年生存率僅15%～20%[5-8]。常規(guī)化療藥物存在非特異性分布的局限性，導(dǎo)致生物利用度差、血液清除速度快、在體液中的溶解度相對較差[9-10]。因此，尋找具有胰腺癌高效性、特異性的生物標(biāo)志物及治療方法非常重要。

Zhang等[11]的研究指出OAS1在胰腺癌中高表達(dá)，而OAS1的高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)。有報(bào)道指出，OASL基因可能是維持肺癌細(xì)胞對acRoots敏感度的決定性調(diào)節(jié)因子之一，并可能與耐藥性的發(fā)展有關(guān)[4]。然而OASL基因表達(dá)與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系鮮有報(bào)道。

KRAS作為胰腺癌突變最高的基因，涉及包括STAT3在內(nèi)的多條信號通路影響胰腺癌的發(fā)生發(fā)展[12-16]。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription,STAT）家族的一員，它以非活化的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，該蛋白具有與酪氨酸磷酸化信號通路偶聯(lián)的功能。該家族能與DNA結(jié)合，由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b以及STAT6組成[17]。p-STAT3是活化的STAT3，與靶基因啟動子上特異的DNA反應(yīng)元件結(jié)合，影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及浸潤，從而影響腫瘤的發(fā)展[18-19]。研究指出，STAT3與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在腫瘤組織中STAT3被異常持續(xù)激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[20]。已有大量研究證實(shí)STAT3與胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、血管生成等過程有關(guān)[21]。BAK是位于STAT3下游的BCL-2家族的一員，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，并且是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)定位在線粒體上的促凋亡蛋白成員[22]。BAK廣泛分布于多種腫瘤中。有研究指出，BAK可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[23-25]。因此本研究希望通過探索OASL與STAT3信號通路的聯(lián)系，嘗試找到OASL基因參與胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移改變的一些新的機(jī)制。

本研究利用質(zhì)粒和慢病毒構(gòu)建了OASL穩(wěn)定低表達(dá)和過表達(dá)的胰腺癌panc-1細(xì)胞株，然后檢測KD-OASL細(xì)胞株和OE-OASL細(xì)胞株的細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力的變化，以及這些生物學(xué)行為變化相關(guān)的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，OASL敲減后細(xì)胞增殖減慢，克隆形成能力減弱，遷移能力降低，敲低株中STAT3、BAK的表達(dá)被抑制，而p-STAT3的表達(dá)水平顯著提高；過表達(dá)OASL的效果相反，提示OASL可能通過STAT3信號通路影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。本研究為探索OASL調(diào)控胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為改變所涉及通路及具體作用機(jī)制提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，也為制定相應(yīng)的治療策略、改善患者預(yù)后奠定了基礎(chǔ)。