由笑穎, 楊海亮, 劉軒赫, 鄭海玲, 周 旸,

(1.浙江理工大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院(國(guó)際絲綢學(xué)院),杭州 310018; 2.中國(guó)絲綢博物館,杭州 310002)

皮革是皮質(zhì)文物的主要部分。皮革是經(jīng)脫毛和鞣制等物理、化學(xué)加工工序所得到的不易腐爛的動(dòng)物皮[1]。人類(lèi)早在遠(yuǎn)古時(shí)期就開(kāi)始對(duì)皮革進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用,皮革制品廣泛應(yīng)用于人類(lèi)生活、生產(chǎn)中。皮革的使用在中國(guó)有著悠久的歷史,主要應(yīng)用于生產(chǎn)生活、軍事文化和宗教祭祀等方面[2]。中國(guó)各地考古發(fā)掘工作出土的皮質(zhì)文物種類(lèi)繁多,諸如帳篷、皮服、皮鞋、皮手套、皮囊、皮甲胄、皮盾牌等,極具地方特色[3]。早在春秋時(shí)期,齊國(guó)一部官書(shū)——《考工記》就記述了齊國(guó)關(guān)于手工業(yè)各個(gè)工種的設(shè)計(jì)規(guī)范和制造工藝[4]。早年湖北隨縣擂鼓墩一號(hào)墓出土的大量戰(zhàn)國(guó)初年的皮甲胄,是研究當(dāng)時(shí)最新科技成果及最高工藝水平的典型代表[5]。而國(guó)外皮質(zhì)文物主要包括羊皮紙、羊皮書(shū)和羊皮卷等,羊皮紙?jiān)欢瘸蔀橄ＥD和拉丁國(guó)家及整個(gè)近東和中東地區(qū)的首選書(shū)寫(xiě)材料,直到公元13世紀(jì),羊皮紙仍然是歐洲拜占庭和斯拉夫地區(qū)的優(yōu)秀寫(xiě)作材料[6-7]。這些珍貴的皮質(zhì)文物是人類(lèi)在認(rèn)識(shí)和改造自然過(guò)程中留下的寶貴財(cái)富,記載著人類(lèi)歷史的發(fā)展,見(jiàn)證了社會(huì)文明的進(jìn)步,它們對(duì)于研究古代皮革制作工藝、歷史自然環(huán)境、文化發(fā)展水平有著重要意義。

由于皮革是一種天然高分子材料,出土文物往往會(huì)受到埋藏環(huán)境的影響,膠原蛋白分解形成不同程度的糟朽降解,使得一些常規(guī)檢測(cè)分析方法如表面分析、光譜分析、波譜分析、色譜分析、熱分析等難以進(jìn)行物種鑒別,或者檢測(cè)鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確[8]。如文物皮革由于內(nèi)部水分和脂質(zhì)大量流失,膠原纖維嚴(yán)重變形,顆粒層毛孔消失,難以使用表面顯微鏡觀察進(jìn)行鑒別;紅外光譜表征缺乏特異性,難以可靠鑒定同類(lèi)型材質(zhì)[9],且對(duì)于皮質(zhì)文物來(lái)說(shuō),只能表征皮革一級(jí)構(gòu)象,材質(zhì)如果老化嚴(yán)重,紅外吸收的強(qiáng)度會(huì)大幅減弱,導(dǎo)致影響檢測(cè)結(jié)果。也有其他技術(shù)方法應(yīng)用于蛋白類(lèi)文物的物種鑒別,如使用DNA分析方法鑒別紡織品中的動(dòng)物毛纖維物種來(lái)源[10],但由于皮質(zhì)文物經(jīng)歷降解老化后DNA極度脆弱,可提取的內(nèi)源性DNA降低到檢測(cè)水平以下,導(dǎo)致此法難以實(shí)行。相比較而言,皮質(zhì)文物中的膠原蛋白降解比DNA緩慢得多,膠原蛋白的主要結(jié)構(gòu)保存得更為穩(wěn)定,而蛋白質(zhì)組學(xué)分析作為一種新興檢測(cè)方法,具有靈敏度高,特異性強(qiáng)的特點(diǎn),能更加精準(zhǔn)有效地對(duì)皮質(zhì)文物進(jìn)行檢測(cè)鑒別[11-12]。本文從蛋白質(zhì)組學(xué)理論基礎(chǔ)出發(fā),對(duì)古代皮質(zhì)文物的物種鑒別方面的方法做總結(jié),以期為同行提供參考。

1 皮質(zhì)文物的結(jié)構(gòu)組成

皮質(zhì)文物的主要部分是皮革,皮革是由生皮經(jīng)過(guò)不同的鞣制方法加工而成[13]。生皮由毛層和皮層組成,皮層包括表皮層、真皮層和皮下組織。在制革過(guò)程中,由于表皮層和皮下組織會(huì)阻礙處理劑向真皮層滲透,通常在加工前將表皮層和皮下組織去除。因此,真皮層是皮革的主體。

真皮層的主要結(jié)構(gòu)是膠原纖維,膠原纖維的成分是膠原蛋白,動(dòng)物皮中的膠原蛋白以Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白為主,組成這些膠原蛋白的元素有C、H、O、N、S。微觀上,構(gòu)成膠原蛋白的多肽鏈以“Gly-X-Y”結(jié)構(gòu)形式的重復(fù)排列為特征,其中甘氨酸含量最高,幾乎占了整個(gè)膠原蛋白氨基酸含量的1/3,且通常X為脯氨酸(Pro),Y為羥脯氨酸(Hyp),這兩種氨基酸是膠原蛋白的特征氨基酸[14-15]。如圖1所示,膠原蛋白由2條α1鏈和1條α2鏈組成三股螺旋結(jié)構(gòu)[16],肽鏈之間形成氫鍵,氫鍵是維持膠原分子三股螺旋結(jié)構(gòu)的主要作用力[17],這樣的結(jié)構(gòu)使得膠原蛋白具有很強(qiáng)的拉伸性能[18]。而后單根膠原纖維側(cè)向聚集形成纖維束,纖維束縱橫交織,形成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),使皮革具有優(yōu)良的強(qiáng)度和延展性。

圖1 膠原纖維結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of collagen fibers

但是,古代皮質(zhì)文物存放至今,包括經(jīng)由鞣制處理的皮革和未經(jīng)鞣制的羊皮紙等,由于受到不穩(wěn)定的儲(chǔ)存環(huán)境的影響,皮質(zhì)早已發(fā)生劣化,如圖2所示。皮革中的水分和脂質(zhì)流失,膠原蛋白發(fā)生氧化和水解,分子鏈間的氫鍵受到破壞,分子的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞,膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)變,膠原纖維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)難以維持,表現(xiàn)在外觀上則是表面顏色發(fā)黑,手感變硬,皮革也變得易脆易裂易損壞。正是這些微觀、宏觀上的變化,導(dǎo)致使用傳統(tǒng)方法對(duì)古代皮質(zhì)文物進(jìn)行物種鑒別變得十分困難,而事實(shí)上,在21世紀(jì)初蛋白質(zhì)組學(xué)就首次應(yīng)用于考古動(dòng)物纖維,自從將蛋白質(zhì)組學(xué)引入考古和文化遺產(chǎn)研究以來(lái),蛋白質(zhì)組學(xué)分析對(duì)越來(lái)越多的古代基質(zhì)和材料進(jìn)行了更好的表征[19],特別是在鑒定其起源物種方面。

圖2 劣化的皮質(zhì)文物Fig.2 Deteriorated cortical cultural relics

2 皮質(zhì)文物蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

正如DNA一樣,蛋白質(zhì)具有龐大的信息庫(kù),攜帶著生命活動(dòng)的重要信息。1995年Wasinger等首次提出“蛋白質(zhì)組”的概念,蛋白質(zhì)組是指由一個(gè)基因組,或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門(mén)研究蛋白質(zhì)的科學(xué),包括蛋白質(zhì)的識(shí)別、量化和蛋白質(zhì)的修飾研究[20],蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容主要包括兩個(gè)方面,即蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和蛋白質(zhì)的功能模式[21]。蛋白質(zhì)表達(dá)模式研究是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基礎(chǔ)內(nèi)容,包括蛋白質(zhì)氨基酸序列分析、空間結(jié)構(gòu)的解析及特定條件下某一材料細(xì)胞或組織中所有蛋白質(zhì)的表征問(wèn)題。近年來(lái),針對(duì)古代蛋白質(zhì)檢測(cè)提出了“古蛋白質(zhì)組學(xué)(Pale-proteomics)”的概念[22],與其他蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域相比,古蛋白質(zhì)組學(xué)面臨著樣品珍貴量少、樣品劣化分解等挑戰(zhàn)。同時(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn),在古代皮質(zhì)文物物種來(lái)源鑒別上十分有優(yōu)勢(shì)。蛋白質(zhì)組學(xué)主要的檢測(cè)過(guò)程分為三部分:蛋白質(zhì)組的提取和分離、生物質(zhì)譜檢測(cè)及蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比與分析。

2.1 皮質(zhì)文物蛋白質(zhì)組的微量提取方法

蛋白質(zhì)本身具有高度的生物特征性,不同生物、組織所具有的蛋白質(zhì)組具有明顯差異,皮質(zhì)文物中的膠原蛋白即便是經(jīng)過(guò)數(shù)千年的埋藏、糟朽,其降解后的肽鏈片段、小分子仍具有特異性,是作為生物物種檢測(cè)鑒定的重要依據(jù)。從試驗(yàn)待測(cè)樣品中提取蛋白質(zhì)是進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析的先決條件,膠原蛋白提取的效率與純度會(huì)對(duì)后續(xù)的檢測(cè)鑒定產(chǎn)生重大影響。因此,使用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)皮質(zhì)文物進(jìn)行物種鑒定,首先的步驟就是從皮質(zhì)文物中進(jìn)行膠原蛋白的提取。目前常見(jiàn)的膠原蛋白提取方法包括酸提取法[23]、堿提取法[24]、鹽提取法[25]、酶提取法[26]和復(fù)合提取法[27],都是針對(duì)現(xiàn)代皮革廢料再利用及明膠工業(yè)生產(chǎn),并不適合珍貴稀少的古代樣品。從皮質(zhì)文物中提取膠原蛋白需要開(kāi)發(fā)一種小樣本量的分析方法,目前,一些國(guó)外的研究已經(jīng)研發(fā)了微損甚至無(wú)損地從古代文物中獲取蛋白質(zhì)的方式,表1對(duì)主要方法進(jìn)行了總結(jié)歸納。

表1 微損/無(wú)損的膠原蛋白提取方法Tab.1 Micro/non-destructive collagen extraction methods

2.1.1 微損研磨法

微損研磨法相對(duì)而言操作比較簡(jiǎn)便,是對(duì)皮革文物損傷較小的膠原蛋白提取方法,Kumazawa等[28]將傳統(tǒng)堿提取法與研磨法對(duì)比,使用銼刀從鱷魚(yú)皮表帶邊緣削銼100 μg粉末使用0.5 μg胰蛋白酶水解,提取的蛋白質(zhì)成功進(jìn)行了表征,這說(shuō)明樣品的微量提取對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性并沒(méi)有產(chǎn)生影響。其實(shí)早前Caroline等[29]就研發(fā)了一種較為成熟的專(zhuān)用于微量提取樣品中蛋白質(zhì)的商業(yè)試劑盒,使用一次性合成樹(shù)脂充分研磨樣品的1%三氟乙酸酸化水溶液,再輔助使用超聲裝置來(lái)提取蛋白質(zhì),這種合成樹(shù)脂十分精細(xì),可將樣品損失降到最低。這種通過(guò)研磨從皮質(zhì)文物中獲得蛋白質(zhì)的方法,適合對(duì)各類(lèi)皮革文物進(jìn)行膠原蛋白的提取。

2.1.2 功能化薄膜黏附法

功能化薄膜黏附法指的是一種使用功能化薄膜無(wú)損地從樣品表面吸附蛋白質(zhì)的方法,該方法以乙酸乙酯(EVA)作為AG501混合強(qiáng)陽(yáng)離子/陰離子交換樹(shù)脂和C8樹(shù)脂混合顆粒的黏合劑,而后將熔融態(tài)的EVA、樹(shù)脂混合物以薄膜形式擠出,使用超純水對(duì)薄膜進(jìn)行潤(rùn)濕后便可接觸樣品表面進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。D’Amato等[30]使用這種方法從包括羊皮紙?jiān)趦?nèi)的多種材質(zhì)的書(shū)籍表面吸附提取蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析。Barberis等[31]也使用這種方法從巴黎制造廠(公元14世紀(jì)初)的稀有涂漆皮革棺材樣品和托斯卡納木制圣物箱中成功識(shí)別出黏合劑。這種方法對(duì)皮質(zhì)文物的損傷幾不可查,但由于它依靠從皮革表面黏附蛋白質(zhì),一般較為適合保存較為完好的羊皮紙、皮革制品或者繪畫(huà)涂層下的動(dòng)物膠黏合劑。

2.1.3 靜電摩擦吸附法

靜電摩擦吸附法原理是利用PVC橡皮擦在皮革表面摩擦產(chǎn)生的靜電對(duì)皮革表層蛋白質(zhì)可產(chǎn)生靜電吸附,從而完成從基材表面吸附提取蛋白質(zhì)。用固相PVC聚合物上的靜電分子萃取,蛋白質(zhì)在室溫下即可保存在PVC聚合物廢料上,無(wú)需進(jìn)一步儲(chǔ)存。該方法對(duì)皮革文物是無(wú)損傷的,且取樣方便、成本低,不需要專(zhuān)業(yè)設(shè)備或存儲(chǔ)、無(wú)需人工制品即可采集樣本。Fiddyment等[32]首次使用這種方法對(duì)72本袖珍圣經(jīng)的羊皮紙進(jìn)行取樣檢測(cè)分析。但這種方法主要可以吸附的是皮革文物表面上的蛋白質(zhì),因此比較適用于羊皮紙類(lèi)的文物進(jìn)行取樣。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)物種鑒定檢測(cè)方法

目前,蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定方法主要包括基于質(zhì)譜的肽質(zhì)量指紋圖譜分析和串聯(lián)質(zhì)譜肽測(cè)序[33],檢測(cè)流程如圖3所示。

圖3 質(zhì)譜檢測(cè)流程示意Fig.3 Schematic diagram of mass spectrometry detection process

2.2.1 肽質(zhì)量指紋圖譜分析

肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting,PMF)是一種簡(jiǎn)單、快速且相對(duì)有效的鑒定蛋白質(zhì)組成的方法。基于質(zhì)譜的動(dòng)物考古學(xué)ZooMS(Zooarchaeology by Mass Spectrometry)作為PMF的一種重要形式,目前已廣泛用于膠原蛋白材料(皮革、羊皮紙、象牙等)的識(shí)別鑒定[34]。將從復(fù)雜樣品中提取出的膠原蛋白質(zhì)組使用胰蛋白酶水解消化,使之水解成一系列肽段,這些肽段具有唯一性,再利用質(zhì)譜測(cè)定所有肽段的質(zhì)量,產(chǎn)生的質(zhì)譜圖是離子相對(duì)豐度隨m/z值變化的曲線圖,收集數(shù)據(jù)形成膠原蛋白質(zhì)組的肽質(zhì)量指紋[35]。當(dāng)使用肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行皮革文物物種鑒定的時(shí)候,需要將未知樣品的圖譜與肽質(zhì)量圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比匹配,標(biāo)定特異性序列從而完成鑒別。

Buckley等[36]利用膠原蛋白-肽質(zhì)量指紋圖譜方法,通過(guò)使用胰蛋白酶提取骨骼、牙齒等部位的膠原蛋白進(jìn)行分析檢測(cè),對(duì)土耳其東南部多穆茲特佩新石器時(shí)代遺址的111個(gè)動(dòng)物遺骸成功進(jìn)行了分類(lèi)鑒定,這為從皮質(zhì)文物中提取膠原蛋白進(jìn)行物種鑒別提供了方法。他們?cè)诖酥巴ㄟ^(guò)與標(biāo)準(zhǔn)樣品制備C18柱的相互作用,曾成功重復(fù)分離出能對(duì)綿羊和山羊膠原蛋白進(jìn)行區(qū)分的單個(gè)膠原蛋白肽[37]。而在此次試驗(yàn)中,他們采用了一種更為簡(jiǎn)單的替代方法,使用固相萃取(SPE)C18移液管尖端分離肽,分離程度雖然低于之前使用的方法,但可以產(chǎn)生更多分類(lèi)群的肽標(biāo)記物,從而做到不僅可以區(qū)分綿羊和山羊,還可以區(qū)分包括人類(lèi)在內(nèi)的許多其他分類(lèi)群。Yuki等[38]利用蛋白質(zhì)組學(xué),通過(guò)LC-MS法在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下監(jiān)測(cè)6種I型膠原胰肽段,以是否存在標(biāo)記肽的模式對(duì)6種動(dòng)物(牛、馬、豬、羊、山羊和鹿)皮革成功進(jìn)行了動(dòng)物源識(shí)別。

2.2.2 串聯(lián)質(zhì)譜肽測(cè)序

相對(duì)于肽質(zhì)量指紋圖譜這種簡(jiǎn)便快速的鑒別方法而言,膠原蛋白的識(shí)別取決于對(duì)分離出的肽相對(duì)分子質(zhì)量的準(zhǔn)確測(cè)量,而實(shí)際上有的肽段本身或在質(zhì)譜儀的測(cè)量過(guò)程中有可能是殘缺的、碎片化的?；诖?lián)質(zhì)譜的肽測(cè)序方法除了可以對(duì)肽段的確切氨基酸序列進(jìn)行定性,還可以通過(guò)對(duì)樣品中肽段碎片化產(chǎn)生的片段離子進(jìn)行進(jìn)一步修飾而獲得氨基酸序列[39]。與PMF制備樣品的過(guò)程相似,MS/MS只是在分析工作流程上有所不同。

作為對(duì)蛋白質(zhì)類(lèi)文物物種準(zhǔn)確鑒別的補(bǔ)充手段,Chambery等[40]開(kāi)發(fā)了一種基于LC-ESI/Q-q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜法的改進(jìn)程序,用于鑒定蛋白質(zhì)黏合劑的生物學(xué)來(lái)源。使用TPCK處理的胰蛋白酶溶液對(duì)還原和烷基化的混合物進(jìn)行酶水解,然后將混合物在37 ℃下孵育過(guò)夜消化。使用配備電噴霧電離源的四極桿飛行時(shí)間(ESI-Q-q-TOF)質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析,在Q-TOF質(zhì)譜儀上獲取電噴霧質(zhì)譜和串聯(lián)MS/MS數(shù)據(jù)。對(duì)MS/MS試驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)導(dǎo)向分析,并對(duì)照Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)搜索處理的MS/MS光譜以進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。試驗(yàn)識(shí)別出3種蛋清蛋白,此外,在樣品中還鑒定出了α S1和β酪蛋白肽,且串聯(lián)質(zhì)譜法能夠很好地區(qū)分綿羊和山羊α酪蛋白。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在皮質(zhì)文物上的應(yīng)用

3.1 羊皮紙

兩千多年以來(lái),羊皮紙一直是西方常用的書(shū)寫(xiě)材料。羊皮紙是由一些常見(jiàn)的動(dòng)物皮(綿羊皮、山羊皮和牛皮)不經(jīng)鞣制只進(jìn)行物理機(jī)械加工制得的。過(guò)去對(duì)于這些羊皮紙的材質(zhì)鑒別依賴(lài)于利用觀察觸摸及參考當(dāng)時(shí)當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)動(dòng)物的方法進(jìn)行判斷,而使用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法從根本上解決了這一問(wèn)題。

Toniolo等[41]使用蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)了一本拉丁語(yǔ)圣經(jīng)副本書(shū)頁(yè)的物種來(lái)源,這本圣經(jīng)有“馬可波羅的圣經(jīng)”之稱(chēng),它是歷史上唯一一本經(jīng)絲綢之路輾轉(zhuǎn)在中國(guó)停留400余年,最終安全返回歐洲的圣經(jīng)。由于圣經(jīng)的紙張非常薄,每張厚度僅有80 μm,因此當(dāng)時(shí)中世紀(jì)歷史文學(xué)家聲稱(chēng),這本圣經(jīng)使用的羊皮紙是由小羔羊皮制作而成的。而實(shí)驗(yàn)室利用nLC/ESI/LTQ MS/MS檢測(cè)紙張邊緣獲得的胰蛋白酶消化肽,在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索,分析得出其中產(chǎn)生的8種特征蛋白均屬于黃牛屬種,雖然片段中未能找到最為關(guān)鍵的可直接斷定種屬的PEGQESTTDQETT(綿羊)、PEGQESPTDQETT(牛)的特異性肽序列,但也足以說(shuō)明這本圣經(jīng)的羊皮紙實(shí)際是從小牛身上獲得的。

袖珍圣經(jīng)是公元13世紀(jì)《巴黎圣經(jīng)》中最重要的子群之一,因其體積足夠小,便于運(yùn)輸廣受歡迎,超細(xì)的羊皮紙是這種圣經(jīng)最常用的制作材料。Fiddyment等[32]使用無(wú)損肽質(zhì)量指紋方法分析了72本袖珍圣經(jīng)的皮質(zhì)來(lái)源,共分析了220對(duì)開(kāi)本。在這些對(duì)開(kāi)本中,68%羊皮紙來(lái)源是小牛,26%是山羊,6%是綿羊。這項(xiàng)研究首次報(bào)告了利用摩擦電無(wú)損提取蛋白質(zhì),且從PVC取樣中獲得的蛋白質(zhì)與使用實(shí)際羊皮紙碎片中的相同。Doherty等[42]對(duì)公元16—20世紀(jì)645個(gè)由羊皮紙制成的法律契約書(shū)進(jìn)行物種鑒定,通過(guò)ZooMS確定其中622個(gè)羊皮紙物種來(lái)源為綿羊,剩下23個(gè)樣本由于缺乏診斷肽無(wú)法確定究竟來(lái)源于綿羊或山羊,結(jié)合當(dāng)?shù)貧v史文獻(xiàn)可基本認(rèn)為當(dāng)時(shí)絕大多數(shù)法律契約書(shū)的羊皮紙由綿羊皮制成。Kirby等[43]使用PMF識(shí)別文物材料中的膠原蛋白。他們借鑒Buckley通過(guò)肽標(biāo)記物鑒別膠原蛋白的方法,以此為基礎(chǔ),從阿拉斯加歷史皮劃艇和《古蘭經(jīng)》羊皮紙的樣本中分離出肽標(biāo)記物,并結(jié)合光譜分析,對(duì)文物軟組織中的膠原蛋白進(jìn)行識(shí)別。蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定證實(shí)超細(xì)羊皮紙不一定像以前假設(shè)的那樣由新生或薄皮動(dòng)物(兔子、松鼠)制得,它們可以通過(guò)從幾個(gè)不同物種的成熟動(dòng)物皮中獲得。

3.2 皮革服飾

公元19世紀(jì)以來(lái),人們一直嘗試鑒別所發(fā)現(xiàn)的古代皮革服飾的物種來(lái)源,確認(rèn)皮革的物種來(lái)源,對(duì)于研究古代畜牧業(yè)的起源發(fā)展及相關(guān)制造行業(yè)有重大意義。但古代皮革服飾受惡劣埋藏環(huán)境的影響往往難以妥善保存,且經(jīng)過(guò)鞣制的皮革更加難以辨認(rèn)物種,有時(shí)其物種的識(shí)別還依賴(lài)于對(duì)皮革上毛發(fā)的形態(tài)學(xué)特征鑒別,但是這些毛發(fā)發(fā)生降解后,形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使得鑒別難以施行[44]。目前,使用基于高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)皮革服飾進(jìn)行物種鑒定成為一種可靠的方式。

對(duì)皮革衣飾的研究可以揭示有關(guān)人類(lèi)歷史的重要特征。1991年在阿爾卑斯山的冰層中發(fā)現(xiàn)了一具新石器時(shí)代的木乃伊Oetzi,由于溫度極低,他的身體和衣服都保存得十分完好。Hollemeyer等[45]使用PMF的方法對(duì)Oetzi的外套,褲子和鞋進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。收集來(lái)自古代樣本和參考物種的PMF,參考物種主要選自阿爾卑斯山周?chē)?可以相互比較避免誤差。經(jīng)檢測(cè)得出,Oetzi的綁腿中來(lái)自犬科動(dòng)物物種,鞋面皮革來(lái)自馬鹿,綁腿是由山羊皮制成,鞋底和箭袋的閉合襟翼由牛皮制成,外套則是由綿羊皮和羚羊皮制成。

丹麥在泥炭沼澤中發(fā)現(xiàn)了一批保存完好的公元前920年至公元前775年的古代皮革服裝,Brandt等[46]使用基于質(zhì)譜(MS)的肽測(cè)序方法將12個(gè)考古皮革樣品進(jìn)行分析匹配,與肽質(zhì)量指紋圖譜的方法不同,肽測(cè)序方法旨在識(shí)別完整提取的古代蛋白質(zhì)組,無(wú)需提前選擇特定的參比對(duì)照物。得到的質(zhì)譜圖在nrNCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST搜索,所有的匹配結(jié)果再根據(jù)皮革的特性,如地理來(lái)源等進(jìn)行物種最終確定。由于山羊和綿羊的蛋白質(zhì)組十分相近,以往的檢測(cè)難以精確區(qū)別這兩個(gè)物種,此次試驗(yàn)還檢測(cè)到了文獻(xiàn)中提及的稀有的用于區(qū)別山羊和綿羊的特異性肽,如圖4[46]所示。最終結(jié)果顯示,有兩個(gè)皮革樣本來(lái)源為牛,六個(gè)樣本來(lái)源為綿羊,三個(gè)來(lái)源為山羊。同時(shí),試驗(yàn)還將基于MS的肽測(cè)序方法與顯微鏡觀察法進(jìn)行比較,更加說(shuō)明了蛋白質(zhì)組學(xué)的可靠性。

圖4 Ⅰ型膠原α2(COL1A2)綿羊/山羊診斷肽的串聯(lián)MS譜Fig.4 Tandem MS spectra of identification of the type Ⅰ alpha-2 collagen (COL1A2) sheep/goat diagnostic peptide

3.3 動(dòng)物膠黏合劑

天然黏合劑早在舊石器時(shí)代就已經(jīng)開(kāi)始使用,隨著社會(huì)生產(chǎn)力的發(fā)展,黏合劑的使用解決了生產(chǎn)由不同材料組成物體的問(wèn)題,克服了單一組分生產(chǎn)的技術(shù)限制,是生產(chǎn)制造水平的一個(gè)重要突破[47]。古代常用的黏合劑主要包括動(dòng)物膠、蛋清蛋黃、酪蛋白、樹(shù)膠樹(shù)脂、瀝青、焦油、淀粉等。其中動(dòng)物膠黏合劑是古時(shí)常用的黏合劑,主要通過(guò)煮沸動(dòng)物皮或魚(yú)皮獲得,膠原蛋白高溫水解轉(zhuǎn)化為明膠[48]。最常見(jiàn)的分析黏合劑的方法是與質(zhì)譜儀聯(lián)用的色譜法[49],但是這種方法對(duì)于鑒定蛋白質(zhì)類(lèi)黏合劑仍然較為困難,而基于高分辨率的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定方法具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性,利用較少的樣品量便可以確定黏合劑的物種來(lái)源。

2009年,在瑞士新石器時(shí)代(約公元前4 000年)遺址發(fā)現(xiàn)了一把表面裝飾有樹(shù)皮條的弓,這把弓包裹在形成厭氧條件的沉積物中,得以保存完好。為了確定樹(shù)皮條的固定材料是獸膠還是魚(yú)膠,Bleicher等[50]利用基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的古代蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序方法檢測(cè)可能殘留的蛋白痕跡,他們將采集的樹(shù)皮條下的小木片作為試驗(yàn)樣品,清洗去除雜質(zhì)后用HCl溫和水解提取蛋白質(zhì),再使用測(cè)序級(jí)胰蛋白酶將蛋白質(zhì)水解成肽片段,將獲得的胰蛋白酶肽固定在C18級(jí)尖端上,最后通過(guò)在線納米流反相C18液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析肽混合物。根據(jù)所得的MS/MS圖譜確定氨基酸序列為SGETGASGPGFVGEK,從而確定此序列物種來(lái)源為牛。最終結(jié)果表明,有4/5的序列檢測(cè)為膠原蛋白,且主要為Ⅲ型膠原蛋白,最有可能的來(lái)源物種為牛和當(dāng)?shù)匚锓NOvicaprids。同時(shí),古代蛋白質(zhì)測(cè)序表明,早在公元前4 000年,當(dāng)?shù)厝司涂梢允褂煤?jiǎn)單的化學(xué)方法提取生產(chǎn)動(dòng)物皮黏合劑,這是第一次利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法溯源史前環(huán)境中的生產(chǎn)活動(dòng)。

小河墓地位于中國(guó)西北部塔克拉瑪干沙漠孔雀河以南約60 km處,該地區(qū)氣候干燥,為蛋白質(zhì)類(lèi)有機(jī)物的保存提供了有利條件。該墓地出土了許多木杖,木杖頂部的正面開(kāi)了兩個(gè)槽,用于鑲嵌兩個(gè)骨雕塑,背面粘貼羽毛[51]。由于骨雕脫落露出了木杖上的淡黃色黏合劑,Rao等[52]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)確定黏合劑的物種來(lái)源。取10 mg的黏合劑樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)提取,將上清液加載到凝膠上進(jìn)行凝膠電泳,使用胰蛋白酶進(jìn)行凝膠內(nèi)消化水解,將提取的溶液真空干燥并冷凍保存,以便通過(guò)LC-MS/MS進(jìn)一步鑒定。在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)搜索對(duì)比,結(jié)果如表2所示,黏合劑的主要蛋白質(zhì)為牛膠原α1(Ⅰ)鏈前體和α2(Ⅰ)鏈前體,且所識(shí)別的Ⅰ型膠原α1中的GPPGSAGSPGKGLNGLPGPIGPPGPR(位置1141-1167)和α2中的IGQPGAVGPAGIR(位置1066-1078)序列為牛的特異性肽,證實(shí)了此黏合劑為動(dòng)物膠,物種來(lái)源為牛。這是迄今為止在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的最古老的動(dòng)物膠黏合劑。

表2 小河墓地出土黏合劑中鑒定出的牛特異性肽Tab.2 Bovine specific peptides identified from adhesives in Xiaohe Cemetery

3.4 膜金屬線

在中世紀(jì)時(shí)期,膜金屬線是歐洲紡織品中使用最多的裝飾金屬線。大多數(shù)膜金屬線以動(dòng)物皮革或者膜組織作為基底,然后鍍以金屬或使用黏合劑黏附上金屬制得。它們因靈活輕便且價(jià)格低廉,一度成為西亞紡織品上最常見(jiàn)的金屬線[53]。識(shí)別金屬線中的膜基底對(duì)中世紀(jì)膜金屬線的起源、生產(chǎn)技術(shù)和使用價(jià)值有重大意義,但紡織品經(jīng)年劣化對(duì)金屬線基底的物種鑒別帶來(lái)困難,形態(tài)學(xué)方法幾乎無(wú)法鑒別,DNA擴(kuò)增技術(shù)由于數(shù)據(jù)庫(kù)的局限只能識(shí)別少數(shù)的物種[54]。相比較而言,蛋白質(zhì)組學(xué)在金屬線基底物種鑒別方面有無(wú)可比擬的優(yōu)越性。

Popowich等[55]使用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)公元14世紀(jì)意大利紡織品上的膜金屬線進(jìn)行基底的物種鑒別。為了測(cè)試蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)古代樣品的適用性,維也納應(yīng)用藝術(shù)大學(xué)(奧地利)還從豬腹膜和牛腸中制備了兩個(gè)系列參比標(biāo)準(zhǔn)品,分別提取蛋白質(zhì),并使用納米LC-Orbitrap-MS/MS法進(jìn)行分析,檢測(cè)到Ⅰ型膠原α1(COL1A1)、Ⅰ型膠原α2(COL1A2)豐度最高,其次是Ⅲ型膠原α1(COL3A1)。對(duì)古代樣品進(jìn)行檢測(cè),與公開(kāi)序列的UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配,分離鑒定出特異性膠原肽,其中檢測(cè)出的來(lái)自牛的COL1A1、COL1A2和COL3A1肽數(shù)量最多(分別為45、42和38個(gè)肽),最終確定線是由牛的腸或胃膜制成。同樣的,Cheung等[56]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法測(cè)試了20世紀(jì)初6頂中國(guó)傳統(tǒng)兒童帽的11個(gè)金屬線樣品,鑒定顯示金屬線基底為綿羊皮或山羊皮,同時(shí)還檢測(cè)出將金屬黏到羊皮基底上的動(dòng)物膠為魚(yú)皮膠。

4 結(jié) 論

利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)國(guó)內(nèi)外皮質(zhì)文物進(jìn)行檢測(cè)鑒定主要分為三個(gè)流程:從皮質(zhì)文物中提取膠原蛋白,利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)膠原蛋白進(jìn)行定性或定量檢測(cè)分析,將獲得的肽在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比匹配以獲得肽段序列等相關(guān)信息。目前,已經(jīng)有一些較為成熟的從皮質(zhì)文物中無(wú)損或微損地提取膠原蛋白的方法,如研磨法、功能化薄膜黏附法、靜電摩擦法,能在確保試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的前提下,盡可能地降低對(duì)皮質(zhì)文物的損壞?；谫|(zhì)譜的蛋白質(zhì)組檢測(cè)方法主要有肽質(zhì)量指紋圖譜法和串聯(lián)質(zhì)譜肽測(cè)序法,兩者各有長(zhǎng)短,前者更為簡(jiǎn)便,后者更為精確。皮質(zhì)文物按照常見(jiàn)的用途分為四大類(lèi),分別是羊皮紙、皮革服飾、動(dòng)物膠黏合劑和以皮革為基底的膜金屬線,這些皮質(zhì)文物難以使用傳統(tǒng)的觀察法進(jìn)行物種的準(zhǔn)確鑒別。而蛋白質(zhì)組學(xué)分析作為一種新興檢測(cè)方法,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),只需極少的樣品,便能準(zhǔn)確地對(duì)文物的物種來(lái)源進(jìn)行鑒別,有效解決物種鑒別困難這一難題,同時(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)基于皮質(zhì)文物的精細(xì)鑒別,對(duì)溯源古代畜牧業(yè)及手工制造業(yè)的生產(chǎn)活動(dòng)也有重大意義。

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