閆 琳, 潘楠楠, 鄭海玲, 周 旸, 王 秉

(1.浙江理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,杭州 310018; 2.中國絲綢博物館,杭州 310002)

絲織品作為中國古代重要的紡織品之一[1],常被用作墓主人的佩劍、酒器、棺槨的包裹物,或者在千年前作為祭祀用品焚燒埋藏[2-3]。有的考古現(xiàn)場發(fā)掘出來的絲織物可以憑借肉眼直接分辨,但是絕大多數(shù)挖掘現(xiàn)場條件復(fù)雜、環(huán)境惡劣,許多紡織品都會發(fā)生物理、化學(xué)降解,成為碎片甚至是微痕跡[4-5]。

絲織品文物檢測的常規(guī)方法主要有掃描電子顯微鏡、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜、拉曼光譜等[6]。掃描電子顯微鏡法可以通過觀察樣品的橫縱向結(jié)構(gòu)分析判斷品種,但是這對文物的完整性有一定的要求,雜質(zhì)和老化程度都會影響結(jié)果的判斷,尤其是出土文物大部分降解損壞嚴(yán)重,就更難以辨別[7]。紅外光譜法通過特征峰的形狀、位置、強度來分析蛋白的組成,可是出土的文物無法避免不帶有雜質(zhì),會對檢測產(chǎn)生干擾,而且文物的降解也會導(dǎo)致特征峰偏移消失[8]。近年來,許多從事文物檢測的研究者逐漸認(rèn)識到免疫學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)越性,并將該技術(shù)應(yīng)用到文物鑒定領(lǐng)域中。劉苗苗等[9]制備了特異性絲素蛋白多克隆抗體,通過酶聯(lián)免疫吸附法成功鑒定出絲綢文物,為古代絲織品的鑒定提供了一種新的思路。

為了解決當(dāng)前現(xiàn)場快速檢測的問題,本文在膠體金免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)制備了絲素蛋白免疫層析試紙(圖1),用于考古現(xiàn)場快速檢測。該技術(shù)是免疫膠體金技術(shù)與層析法(以膜為固相載體的檢測方式)相結(jié)合的新一代檢測方法[10-11],近年來廣泛應(yīng)用于重金屬離子、病毒蛋白、農(nóng)藥殘留物等檢測[12-17]。若待測樣本中存在絲素蛋白,絲素蛋白抗原首先與單克隆抗體膠體金結(jié)合物反應(yīng),通過毛細(xì)管現(xiàn)象在膜上移動,與T線上的抗原形成競爭,因此不固定在C膜上,只與C線的二抗結(jié)合顯示紅色條帶。通過抗原抗體特異性結(jié)合及標(biāo)記物的顯色,短時間即可在試紙上憑肉眼可見結(jié)果,有利于考古專家快速定性樣品,極大地縮小取樣范圍,從而減少對考古現(xiàn)場的破壞,為現(xiàn)場檢測提供了巨大的便利。

圖1 膠體金免疫層析試紙及檢測原理示意Fig.1 Schematic diagram and detection principle of colloidal gold immunochromatographic assay strip

1 試 驗

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試 劑

人血清蛋白(HSA)、羊毛角蛋白(Wool keratin)、牛血清蛋白(BSA)、牛膠原蛋白(Bovine collagen)(杭州華安生物技術(shù)有限公司),磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氯化鈉(NaCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鉀(KCl)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、碳酸鈉(Na2CO3)、碳酸鉀(K2CO3)、檸檬酸三納(Na3C6H5O7·2H2O)均為分析純AR(杭州高晶精細(xì)化工有限公司),四硼酸鈉十水合物(Na2B4O7·10H2O)、硼酸(H3BO3)均為分析純AR(麥克林生化科技有限公司),樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC底板、羊抗鼠IgG(上海杰一生物技術(shù)有限公司),新疆營盤、南海一號、新疆阿勒泰三道海子、新疆小河墓地等遺址古代紡織文物(中國絲綢博物館)。

1.1.2 設(shè)備與儀器

85-2型恒溫磁力攪拌機(常州普天儀器制造有限公司),DNP-9022型恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備),BSA224S型電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司),MILLI-Q?IQ7003/7005型純水儀(美國密理博有限公司),KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),QL-861型旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司),DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗儀器設(shè)備有限公司),2015ZSIR0055ZF低溫高速離心機(杭州普天生物技術(shù)有限公司),臺式噴金劃膜機、中速切割機(杭州格倫坤科技有限公司),金標(biāo)檢測儀(上海杰一生物技術(shù)有限公司),Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀(英國馬爾文帕納科有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 單克隆抗體的制備

將1 mg絲素蛋白粉末溶解在1 mL生理鹽水中,與1 mL弗式完全佐劑乳化完全。初次免疫時在小鼠皮下和腹腔多處注射100 μL上述抗原乳液。然后用弗式不完全佐劑代替弗式完全佐劑,分別在第二周、第四周、第六周對小鼠進行加強免疫。最后一次加強免疫之后,采用間接ELISA法評價血清抗體效價是否合格。效價合格后,小鼠被安樂死,切除脾臟,將脾臟作為與骨髓瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞來源。如果不合格,則繼續(xù)加強免疫,直到獲得合格的血清抗體效價。

細(xì)胞融合前7 d,骨髓瘤細(xì)胞在8-氮雜鳥嘌呤中培養(yǎng),以確保其對IMDM選擇培養(yǎng)基的敏感性。將脾臟放置在包含IMDM培養(yǎng)基的玻璃盤中,小心擠出脾臟細(xì)胞。將生長情況良好的骨髓瘤細(xì)胞按照1︰10的比例與已預(yù)熱的含有脾臟細(xì)胞的IMDM培養(yǎng)基混合,沿管底緩慢加入1 mL聚乙二醇(PEG)1500,以1 200 r/min的速度離心5 min,棄上清。將融合后的雜交瘤細(xì)胞懸液按每孔100 μL的量包被到孔板上培養(yǎng)7 d,然后用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞,收集以后采用免疫親和層析柱進行純化,獲得的單克隆抗體在-20 ℃的條件下保存?zhèn)溆肹18]。

1.2.2 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液。首先用王水浸泡250 mL的錐形瓶24 h,洗凈后用雙蒸水煮沸錐形瓶,重復(fù)操作5次后備用。將100 mL氯金酸(0.1 g/L)加入到預(yù)處理過的錐形瓶,然后加熱攪拌至沸騰,接著迅速加入10 g/L的檸檬酸三鈉,氯金酸溶液由淡黃色轉(zhuǎn)變成酒紅色,溶液不再發(fā)生顏色變化后停止加熱。繼續(xù)攪拌5 min,將冷卻的溶液放置在4 ℃的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 膠體金與抗體的偶聯(lián)

取5 mL膠體金溶液,用1 mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)其pH值,在渦旋儀上將溶液混勻,加入5 μL絲素蛋白單克隆抗體,將混合后的溶液置于37 ℃條件下攪拌孵育1 h,然后加入20 μL牛血清蛋白溶液作為封閉劑,繼續(xù)攪拌孵育30 min。將得到的溶液以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min,棄上清液,4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 膠體金試紙的制備

試紙由五部分組成:樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC底板。先對樣品墊和金標(biāo)墊進行預(yù)處理,將其完全浸沒于處理液片刻后取出,平鋪在托盤上放入37 ℃烘箱進行烘干。然后使用噴金劃膜機將膠體金標(biāo)記抗體噴涂在金標(biāo)墊上,噴涂量為4 μL/cm,再放入37 ℃烘箱干燥備用。將絲素蛋白抗原、羊抗鼠IgG用緩沖液稀釋,再用噴金劃膜機在硝酸纖維素膜上劃線包被,劃線量為1 mg/mL,形成間隔5 mm的檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線),同樣放入37 ℃烘箱干燥備用。最后將樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次粘貼在PVC底板上,用切條機處理成4 mm寬的試紙保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 膠體金試紙的性能表征和示范應(yīng)用

為了測試膠體金試紙的靈敏度,取絲素蛋白溶于BB緩沖溶液中,配制成一系列不同質(zhì)量濃度的絲素蛋白溶液(10.00、5.00、1.00、0.50、0.25、0.10 μg/mL)。將100 μL絲素蛋白溶液逐滴加入檢測試紙的樣品墊處,10 min后觀察并使用金標(biāo)檢測儀進行檢測,測試次數(shù)為3次,然后記錄試驗結(jié)果。

為了測定試紙的特異性,選取人血清白蛋白(HSA)、羊毛角蛋白(Wool keratin)、牛血清白蛋白(BSA)、牛膠原蛋白(Bovine collagen)、絲膠蛋白(Sericin)作為干擾蛋白進行測試,空白對照選用pH 8.2的BB緩沖液。將上述蛋白溶于BB緩沖液中,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的測試溶液。將100 μL干擾蛋白溶液逐滴加入試紙的樣品墊處,10 min后觀察并使用金標(biāo)檢測儀進行檢測,測試次數(shù)為3次,然后記錄試驗結(jié)果。

考慮到紡織品文物的稀缺性,稱取1～3 mg的糟朽文物樣品,加入BB緩沖溶劑中,37 ℃水浴下加熱10 min,得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的測試溶液,靜置后取上清液100 μL,加入試紙的樣品墊處,10 min后觀察并記錄試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金與絲素蛋白單克隆抗體的最佳標(biāo)記量選擇

將膠體金分裝成每管1 mL,分別取0、5、10、15、20、25 μg單克隆抗體加入離心管中,震蕩混勻(表1)。5 min后,在上述各管中加入100 μL 10% NaCl溶液,混勻后室溫靜置1 h,觀察結(jié)果。如果加入抗體的量不足以穩(wěn)定膠體金,則離心管中呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象;加入的抗體達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量,離心管則保持紅色不變。穩(wěn)定膠體金溶液紅色不變的最低抗體用量即為最佳標(biāo)記量。從圖2可看出,膠體金溶液中的抗體質(zhì)量濃度達(dá)到3#試樣質(zhì)量濃度時膠體金溶液便保持穩(wěn)定的紅色不再改變,所以確定膠體金與絲素蛋白單克隆抗體的最佳標(biāo)記量為10 μg/mL。

表1 膠體金與絲素蛋白單克隆抗體的最佳標(biāo)記量選擇Tab.1 Selection of the optimal labeling amount of colloidal gold and silk fibroin monoclonal antibody

圖2 膠體金與絲素蛋白單克隆抗體最佳標(biāo)記量的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization results of the optimal labeling amount of colloidal gold and silk fibroin monoclonal antibody

2.2 膠體金與絲素蛋白單克隆抗體的標(biāo)記粒徑選擇

膠體金的粒徑選擇對于膠體金試紙的靈敏度是極為重要的,不同粒徑的顆粒對標(biāo)記的絲素蛋白單克隆抗體的靈敏度有顯著的影響。本實驗選擇了三種不同粒徑的膠體金進行優(yōu)化,分別是15、30、45 nm,絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度50、10、5、1 μg/mL，尺寸分布如圖3所示。另由圖4優(yōu)化結(jié)果可知,使用45 nm及30 nm粒徑的膠體金標(biāo)記抗體后得到的試紙,在樣品中絲素蛋白質(zhì)量濃度低于50 μg/mL時難以進行檢測,使用15 nm粒徑的膠體金制成的試紙,在樣品質(zhì)量濃度為50 μg/mL時仍具備檢測能力,直到低至10 μg/mL時才檢測不到。結(jié)果說明,選擇15 nm粒徑的膠體金與抗體進行結(jié)合后制成的試紙在檢測時更靈敏。

圖3 膠體金的尺寸分布Fig.3 Size distribution of colloidal gold

圖4 膠體金與絲素蛋白單克隆抗體的標(biāo)記粒徑優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization results of labeling particle size of colloidal gold and silk fibroin monoclonal antibody

2.3 試紙的緩沖體系選擇

緩沖液對于膠體金試紙的靈敏度也是極為重要的,不同pH值的緩沖體系對膠體金標(biāo)記抗體的靈敏度也有顯著的影響。在膠體金與絲素蛋白單克隆抗體的最佳標(biāo)記量及粒徑的前提下,選擇適合維持抗體活性的緩沖體系進行優(yōu)化,兩種緩沖體系分別為PBS緩沖液、BB緩沖液,每種緩沖體系選取了三種pH值,依次為7.2、8.2、9.0,結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看到,pH 8.2的BB緩沖液在陰性檢測線強度相同時靈敏度更高,檢測線顯示顏色更清晰,且背景板殘留未結(jié)合的標(biāo)記物少。因此,選擇pH 8.2的BB緩沖液作為該試紙的緩沖體系。

圖5 試紙的緩沖體系優(yōu)化結(jié)果Fig.5 Optimization results of buffer system for the assay strip

2.4 靈敏度檢測結(jié)果分析

在優(yōu)化條件下,對絲素蛋白進行定量檢測,檢測結(jié)果如圖6所示。從圖6(a)可以看出,隨著樣品中絲素蛋白質(zhì)量濃度的增加,試紙檢測線(T線)的顏色會隨之變淺。當(dāng)樣品中的絲素蛋白質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL時,可以看出T線與檢測pH 8.2的BB緩沖液的試紙有明顯差異;當(dāng)樣品中的絲素蛋白濃度達(dá)到1.0 μg/mL時,T線徹底消失。因此,可以得出樣品質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL以上時,可用肉眼觀測檢測結(jié)果。由圖6(b)可知,隨著樣品中絲素蛋白的質(zhì)量濃度增大,T線上的金標(biāo)含量逐漸減少,繼而T/C的金標(biāo)量比值逐漸減小,曲線呈現(xiàn)負(fù)增長的趨勢,符合試紙的檢測原理。

圖6 試紙的靈敏度檢測結(jié)果Fig.6 Sensitivity of the assay strip

2.5 特異性檢測結(jié)果分析

通過圖7(a)可以看到,空白對照(BB緩沖液)和人血清白蛋白(HSA)、羊毛角蛋白(Wool keratin)、牛血清白蛋白(BSA)、牛膠原蛋白(Bovine collagen)、絲膠蛋白(Sericin)等干擾蛋白樣品的檢測結(jié)果均為陰性,T、C線均顯色,而絲素蛋白樣品在試紙檢測結(jié)果中T線不顯色,呈現(xiàn)陽性檢測結(jié)果。由圖7(b)可知,金標(biāo)儀檢測得出的T/C值柱狀圖也表明了該試紙具有良好的特異性。

圖7 試紙的特異性檢測結(jié)果Fig.7 Test results regarding the specificity of the assay strip

2.6 文物樣檢測結(jié)果分析

為了確定試紙對實際考古樣品的檢測能力,本文選取新疆營盤、南海一號、新疆阿勒泰三道海子、新疆小河墓地等遺址的古代文物樣進行檢測,樣品如圖8(a～d)所示,其中圖8(a～c)為絲織物樣品,圖8(d)為新疆小河墓地的毛織物樣品。新疆營盤處于樓蘭和尉犁之間,是絲路中道的主要城市,由于當(dāng)?shù)氐貐^(qū)常年干燥,留存了許多古代絲織物;“南海一號”是南宋初期一艘在海上絲綢之路向外運送貨物時失事沉沒的木質(zhì)古沉船,它為復(fù)原海上絲綢之路的歷史、陶瓷史提供極為難得的實物資料;三道海子在歷史上是通歐亞“草原絲綢之路”上的要沖,通過這條通道,商旅們源源不斷地把中原的絲綢、茶葉等貨物運往中亞及歐洲各地,又把歐洲和沿途各地的貨物、物產(chǎn)帶到中原地區(qū)。通過對圖8(a～c)樣品的檢測,結(jié)果中T線不顯色,只有C線顯色(圖8(e～g)),表明上述文物樣品中均含有絲素蛋白,而圖8(d)毛織物樣品的檢測結(jié)果為陰性(圖8(h)),T、C均顯色,說明該樣品不含絲素蛋白。這些檢測結(jié)果說明,該試紙可以為考古遺址的絲織品檢測提供新的檢測方法。

圖8 考古樣品的圖像及試紙檢測結(jié)果Fig.8 Images and assay strip test results of archeological samples

3 結(jié) 論

本文為檢測考古現(xiàn)場絲織品微痕跡,開發(fā)了一種膠體金標(biāo)記絲素蛋白單克隆抗體的免疫層析試紙。通過抗原抗體特異性結(jié)合,專一靈敏地檢測樣品中存在的絲織品痕跡。質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL以上時,可用肉眼觀測,5～10 min內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果,且具有極好的特異性,能實現(xiàn)專一微量的絲素蛋白檢測。在對實際古代文物樣進行檢測后也展現(xiàn)了優(yōu)秀的定性檢測結(jié)果,可為之后的考古現(xiàn)場檢測提供了可靠便捷的實用工具。

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