席啦，孔祥聰，倪慧，劉忠軍，鐘吉安，蔡文超，郭壯*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.清香型白酒生物技術(shù)襄陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽 441053）

清香型白酒被認(rèn)為是中國白酒的起源，可分為大曲清香酒、麩曲清香酒和小曲清香酒[1]，其中華中地區(qū)的清香型白酒主要以大曲清香為主，以湖北“石花”品牌為代表[2]。大曲清香型白酒主體香氣成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯，主要來源于低溫大曲和環(huán)境中微生物的代謝[3]。由于在“培曲”工藝上的不同，低溫大曲可分為后火、青茬和紅心三類[4]，研究表明，不同類型的低溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異[5]。采用高通量測序技術(shù)，欒春光等[6]對汾酒3類低溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)和理化指標(biāo)的差異性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)畢赤酵母（Pichia）和曲霉屬（Aspergillus）等菌屬與青茬大曲酯化力的提升具有密切相關(guān)性，而釀酒酵母屬（Saccharomyces）、 維 克 漢 姆 酵 母 產(chǎn) 香 酵 母（Wickerhamomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）對紅心曲糖化力和液化力的提升具有積極作用，此外亦發(fā)現(xiàn)根霉屬（Rhizopus）可促進(jìn)后火低溫大曲酯化力的提升。

后火低溫大曲在“潮火期”、“干火期”和“后火期”的溫度較青茬曲偏高，而低于紅心曲，其斷面呈現(xiàn)灰黃色，普遍存在兩道黑線，根據(jù)顏色的不同通?？煞譃榍ず颓膬刹糠諿4]。后火低溫大曲的糖化力、液化力和發(fā)酵力低于青茬曲，而高于紅心曲，但出酒率在三類大曲中最高[4]。雖然在實(shí)際生產(chǎn)中通常將后火低溫大曲整塊粉碎后使用，但對其曲皮和曲心的微生物差異性進(jìn)行分析，對后續(xù)制曲工藝的改良具有指導(dǎo)作用。作為第二代測序技術(shù)的代表，Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)不需要分離培養(yǎng)微生物，能直接捕獲樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)[7-8]，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中國白酒酒醅[9-10]、窖泥[11-12]和酒曲[13-14]的微生物群系解析中。

作為華中地區(qū)大曲清香型白酒的代表，石花酒以高粱、糯米為原料，使用低溫大曲經(jīng)地缸發(fā)酵而成[2]，其生產(chǎn)地為湖北省襄陽市谷城縣，位于中國四大河流中的漢水流域中段。目前國內(nèi)學(xué)者對山西汾酒釀造用低溫大曲的微生物多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)解析，但圍繞華中地區(qū)清香型白酒釀造用大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的報道尚少。本研究真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS），采用 Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對后火低溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，對曲皮和曲心中的真菌類群進(jìn)行甄別，以期為后續(xù)制曲工藝的改良和華中地區(qū)釀酒微生物資源的挖掘提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

后火低溫大曲：采集自湖北省石花釀酒股份有限公司曲庫。

DNA基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs） 混合物、5×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction buffer，PCR）緩沖液、DNA 聚合酶：寶生物工程（大連）有限公司；引物ITS1（5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）/ITS4（5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'）：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Fluor Chem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀：美國AB公司；Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺：美國Illumina公司；Power Edge R930架式服務(wù)器：美國DELL公司；800Y粉碎機(jī)：永康市鉑歐五金制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

選取庫存30d～35d的后火低溫大曲，共采集10份，模具大小為37 cm×18 cm×7 cm。根據(jù)截面情況將外部白色區(qū)域定為曲皮（編號為QP1～QP10），將內(nèi)部偏黃部分定為曲心（編號為QX1～QX10），相同數(shù)字編號為同一樣品。將各樣品用粉碎機(jī)粉碎封存于無菌袋中并置于-40℃低溫條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA的提取、真菌ITS區(qū)PCR擴(kuò)增及Illumina MiSeq高通量測序

按照生產(chǎn)商的使用說明對后火低溫大曲樣品進(jìn)行宏基因組DNA提取，參照陳怡等[15]的方法對真菌的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，使用Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺將擴(kuò)增合格的產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.3.3 序列質(zhì)控及生物信息學(xué)分析

參照Wang等[16]的方法對下機(jī)序列進(jìn)行質(zhì)控。參考Du等[17]的方法，物種分析和多樣性評估使用QIIME（v1.90）平臺進(jìn)行分析，大致流程為建立分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）、UNITE 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對以及多樣性分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用兩配對樣本的非參數(shù)（Wilcoxon符號秩）檢驗(yàn)和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）分析后火低溫大曲曲皮和曲心間真菌的差異性；使用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；使用R軟件（v4.1.0）和Origin 2017進(jìn)行繪圖；線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）算法使用Huttenhower實(shí)驗(yàn)室Galaxy服務(wù)器的在線網(wǎng)頁（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/） 對 P＜0.05的菌群進(jìn)行甄別。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

通過對20份樣品進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序，共得到高質(zhì)量序列1 424 879條，平均每個樣品71 244條（范圍：63 862條～74 023條，標(biāo)準(zhǔn)差 2 415）。根據(jù)100%和97%相似度劃分去除單序列后得到了857個OTU，平均每個樣品321個（范圍：248～406個，標(biāo)準(zhǔn)差56）。當(dāng)測序深度為63 010條序列時，通過Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)對Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)行分析，比較了曲皮和曲心中真菌群落的豐度和多樣性，結(jié)果見圖1。

圖1 低溫大曲不同部位真菌α多樣性指標(biāo)比較分析Fig.1 Comparative analysis of α diversity indexes in different parts of low-temperature Daqu

由圖1可知，曲皮和曲心真菌類群的Chao 1指數(shù)的值分別為432±39和511±59，Shannon指數(shù)的值分別為0.87±0.10和2.15±0.48。經(jīng)Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)曲皮和曲心中Chao 1指數(shù)差異非常顯著（P＜0.01），Shannon指數(shù)差異極顯著（P＜0.001）。由此可見，后火低溫大曲曲心的真菌豐富度和多樣性均顯著高于曲皮。

2.2 β多樣性分析

本研究進(jìn)一步對曲皮和曲心的β多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于UniFrac距離加權(quán)和非加權(quán)的低溫大曲不同部位真菌群落結(jié)構(gòu)主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)of fungal community structure in different parts of low-temperature Daqu based on weighted and unweighted UniFrac distance

由圖2可知，基于加權(quán)和非加權(quán)UniFrac距離對曲皮和曲心間β多樣性進(jìn)行分析均發(fā)現(xiàn)兩組之間有明顯的分離趨勢。由圖2A可知，第一主成分和第二主成分的總貢獻(xiàn)值高達(dá)99.35%，大部分曲心樣品分布于坐標(biāo)軸左側(cè)，所有的曲皮樣品分布于坐標(biāo)軸右側(cè)，由圖2B也可得出相似的結(jié)論。經(jīng)MANOVA分析發(fā)現(xiàn)，曲皮和曲心樣品間差異極顯著（P＜0.001），這說明后火低溫大曲曲皮和曲心樣品間真菌物種組成存在顯著差異。

2.3 曲皮、曲心樣品物種組成分析

本研究將在20個樣品中平均相對豐度超過1.00%的真菌門或?qū)俣x為優(yōu)勢真菌門或?qū)?，小?.00%的門或?qū)俣x為“Others”，而不能鑒定到門或?qū)偎降男蛄卸x為“unclassified”。納入本研究的后火低溫大曲樣品中真菌類群可鑒定為3個門、6個綱、8個目、17個科和18個屬，后火低溫大曲曲皮和曲心中優(yōu)勢真菌門和屬的相對含量比較分析如圖3所示。

圖3 基于門和屬水平的低溫大曲不同部位真菌構(gòu)成分析Fig.3 Fungal community composition in different parts of lowtemperature Daqu at phylum and genus levels

由圖3A可知，根據(jù)UNITE數(shù)據(jù)庫，99.95%的序列被鑒定為子囊菌門（Ascomycota），10份低溫后火大曲中Ascomycota的相對含量均>99.73%，為優(yōu)勢菌門。由圖3B可知，在屬層面上，曲皮中的優(yōu)勢真菌屬主要為復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis，98.92%）。曲心中的優(yōu)勢真菌屬主要為Saccharomycopsis（58.20%）和Aspergillus（40.97%）。由此可見，后火低溫大曲曲皮和曲心中的微生物群落結(jié)構(gòu)以及分布均存在一定差異，與圖2結(jié)果一致。經(jīng)Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Saccharomycopsis在曲皮中極顯著偏高（P<0.001），Aspergillus在曲心中顯著偏高（P<0.01）。

與曲皮相比后火低溫大曲中曲心的物種豐富度和多樣性均較高，究其原因可能是由于在后火階段隨著水分的蒸發(fā)，曲心中的水分含量高于曲皮，微生物最后向水分較高的曲心發(fā)展[18]。羅惠波等[19]對山西汾酒3種低溫大曲的真菌群落進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，后火大曲中的優(yōu)勢菌為Pichia。張雙燕等[20]對北京地區(qū)低溫大曲中微生物多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢真菌種群以假絲酵母屬（Canndida）、Aspergillus、毛霉屬（Mucor）和Wickerhamomyces為主。這與本文研究結(jié)果有所差異，可能是由原料、工藝條件以及環(huán)境等因素引起的。

2.4 基于OTU水平真菌多樣性分析

本研究將在20個樣品中均存在的OTU定義為核心OTU。后火低溫大曲曲皮和曲心真菌OTU分布結(jié)果如圖4所示。

由圖4A可知，后火低溫大曲中共存在857個OTU，其中曲心中注釋的OTU總量高于曲皮，曲皮中僅注釋到572個OTU，而曲心中注釋到757個OTU。所有樣品中共有的OTU有91個，但包含了1 342 093條序列，占所有序列的94.19%。由圖4B可知，所有樣品中均存在且相對含量>1.00%的OTU僅2個，分別為OTU776（70.84%）和 OTU1183（17.91%），其中 OTU776隸 屬 于 Saccharomycopsis，OTU1183 隸 屬 于 Aspergillus，這進(jìn)一步證實(shí)了 Saccharomycopsis和 Aspergillus為后火大曲中的優(yōu)勢真菌屬。酵母菌有利于酒精發(fā)酵，同時也影響相關(guān)酶系的產(chǎn)生，曲霉等具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，能促進(jìn)酵母菌的生長繁殖，進(jìn)而產(chǎn)生更多的酒精，對白酒的風(fēng)味起著重要的作用[21]。

圖4 OTU在不同樣本中的分布和核心OTU相對含量瀑布圖Fig.4 Distribution of OTUs in different samples and waterfall plot of relative abundance of key OTUs

2.5 曲皮和曲心樣品差異菌群分析

LEfSe分析常用于分類學(xué)水平物種特征及差異的認(rèn)識與揭示[22]。為進(jìn)一步解析后火大曲曲皮和曲心中真菌群落結(jié)構(gòu)的差異，采用Lefse分析對其差異微生物進(jìn)行了甄別，結(jié)果見圖5。

圖5 LEfSe分析Fig.5 Cladogram of LEfSe

由圖5可知，LEfSe的LDA閾值得分為3.0，共鑒定出8個豐度差異顯著的類群（P<0.05），曲心和曲皮中各4個。結(jié)果表明，Saccharomycopsis可作為曲皮中的生物標(biāo)志物，Aspergillus可作為曲心的生物標(biāo)志物[23]。值得一提的是，曲皮中的優(yōu)勢真菌屬為Saccharomycopsis，而曲心中的優(yōu)勢真菌屬是Saccharomycopsis和Aspergillus。由此可見，后火低溫大曲曲皮和曲心中真菌群落結(jié)構(gòu)差異主要是由優(yōu)勢真菌屬Saccharomycopsis和Aspergillus造成的。

3 結(jié)論

通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，石花后火低溫大曲曲皮和曲心中真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，曲心中真菌豐度和種類均顯著偏高，曲皮中優(yōu)勢真菌屬主要以Saccharomycopsis為主，曲心中以Saccharomycopsis和Aspergillus為主。進(jìn)一步解析發(fā)現(xiàn)，造成曲皮和曲心樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要菌群為Saccharomycopsis和Aspergillus等優(yōu)勢真菌屬。