席啦，孔祥聰，倪慧，劉忠軍，鐘吉安，蔡文超，郭壯*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術與應用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.清香型白酒生物技術襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053）

清香型白酒被認為是中國白酒的起源，可分為大曲清香酒、麩曲清香酒和小曲清香酒[1]，其中華中地區(qū)的清香型白酒主要以大曲清香為主，以湖北“石花”品牌為代表[2]。大曲清香型白酒主體香氣成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯，主要來源于低溫大曲和環(huán)境中微生物的代謝[3]。由于在“培曲”工藝上的不同，低溫大曲可分為后火、青茬和紅心三類[4]，研究表明，不同類型的低溫大曲細菌群落結構存在一定的差異[5]。采用高通量測序技術，欒春光等[6]對汾酒3類低溫大曲的微生物群落結構和理化指標的差異性進行了分析，發(fā)現畢赤酵母（Pichia）和曲霉屬（Aspergillus）等菌屬與青茬大曲酯化力的提升具有密切相關性，而釀酒酵母屬（Saccharomyces）、 維 克 漢 姆 酵 母 產 香 酵 母（Wickerhamomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）對紅心曲糖化力和液化力的提升具有積極作用，此外亦發(fā)現根霉屬（Rhizopus）可促進后火低溫大曲酯化力的提升。

后火低溫大曲在“潮火期”、“干火期”和“后火期”的溫度較青茬曲偏高，而低于紅心曲，其斷面呈現灰黃色，普遍存在兩道黑線，根據顏色的不同通?？煞譃榍ず颓膬刹糠諿4]。后火低溫大曲的糖化力、液化力和發(fā)酵力低于青茬曲，而高于紅心曲，但出酒率在三類大曲中最高[4]。雖然在實際生產中通常將后火低溫大曲整塊粉碎后使用，但對其曲皮和曲心的微生物差異性進行分析，對后續(xù)制曲工藝的改良具有指導作用。作為第二代測序技術的代表，Illumina MiSeq高通量測序技術不需要分離培養(yǎng)微生物，能直接捕獲樣品中微生物的群落結構[7-8]，目前已經廣泛應用于中國白酒酒醅[9-10]、窖泥[11-12]和酒曲[13-14]的微生物群系解析中。

作為華中地區(qū)大曲清香型白酒的代表，石花酒以高粱、糯米為原料，使用低溫大曲經地缸發(fā)酵而成[2]，其生產地為湖北省襄陽市谷城縣，位于中國四大河流中的漢水流域中段。目前國內學者對山西汾酒釀造用低溫大曲的微生物多樣性進行了系統(tǒng)解析，但圍繞華中地區(qū)清香型白酒釀造用大曲微生物群落結構的報道尚少。本研究真菌內轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS），采用 Illumina MiSeq高通量測序技術對后火低溫大曲真菌群落結構進行解析，對曲皮和曲心中的真菌類群進行甄別，以期為后續(xù)制曲工藝的改良和華中地區(qū)釀酒微生物資源的挖掘提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

后火低溫大曲：采集自湖北省石花釀酒股份有限公司曲庫。

DNA基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs） 混合物、5×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction buffer，PCR）緩沖液、DNA 聚合酶：寶生物工程（大連）有限公司；引物ITS1（5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）/ITS4（5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'）：武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Fluor Chem FC3化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺：美國Illumina公司；Power Edge R930架式服務器：美國DELL公司；800Y粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

選取庫存30d～35d的后火低溫大曲，共采集10份，模具大小為37 cm×18 cm×7 cm。根據截面情況將外部白色區(qū)域定為曲皮（編號為QP1～QP10），將內部偏黃部分定為曲心（編號為QX1～QX10），相同數字編號為同一樣品。將各樣品用粉碎機粉碎封存于無菌袋中并置于-40℃低溫條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA的提取、真菌ITS區(qū)PCR擴增及Illumina MiSeq高通量測序

按照生產商的使用說明對后火低溫大曲樣品進行宏基因組DNA提取，參照陳怡等[15]的方法對真菌的ITS序列進行PCR擴增。使用瓊脂糖凝膠對PCR產物進行鑒定，使用Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺將擴增合格的產物進行測序。

1.3.3 序列質控及生物信息學分析

參照Wang等[16]的方法對下機序列進行質控。參考Du等[17]的方法，物種分析和多樣性評估使用QIIME（v1.90）平臺進行分析，大致流程為建立分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）、UNITE 數據庫進行同源性比對以及多樣性分析。

1.4 數據統(tǒng)計

使用兩配對樣本的非參數（Wilcoxon符號秩）檢驗和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）分析后火低溫大曲曲皮和曲心間真菌的差異性；使用Excel 2016進行數據處理；使用R軟件（v4.1.0）和Origin 2017進行繪圖；線性判別分析效應大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）算法使用Huttenhower實驗室Galaxy服務器的在線網頁（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/） 對 P＜0.05的菌群進行甄別。

2 結果與分析

2.1 α多樣性分析

通過對20份樣品進行Illumina MiSeq高通量測序，共得到高質量序列1 424 879條，平均每個樣品71 244條（范圍：63 862條～74 023條，標準差 2 415）。根據100%和97%相似度劃分去除單序列后得到了857個OTU，平均每個樣品321個（范圍：248～406個，標準差56）。當測序深度為63 010條序列時，通過Wilcoxon符號秩檢驗對Chao 1指數和Shannon指數進行分析，比較了曲皮和曲心中真菌群落的豐度和多樣性，結果見圖1。

圖1 低溫大曲不同部位真菌α多樣性指標比較分析Fig.1 Comparative analysis of α diversity indexes in different parts of low-temperature Daqu

由圖1可知，曲皮和曲心真菌類群的Chao 1指數的值分別為432±39和511±59，Shannon指數的值分別為0.87±0.10和2.15±0.48。經Wilcoxon符號秩檢驗發(fā)現曲皮和曲心中Chao 1指數差異非常顯著（P＜0.01），Shannon指數差異極顯著（P＜0.001）。由此可見，后火低溫大曲曲心的真菌豐富度和多樣性均顯著高于曲皮。

2.2 β多樣性分析

本研究進一步對曲皮和曲心的β多樣性進行了分析，結果如圖2所示。

圖2 基于UniFrac距離加權和非加權的低溫大曲不同部位真菌群落結構主坐標分析Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)of fungal community structure in different parts of low-temperature Daqu based on weighted and unweighted UniFrac distance

由圖2可知，基于加權和非加權UniFrac距離對曲皮和曲心間β多樣性進行分析均發(fā)現兩組之間有明顯的分離趨勢。由圖2A可知，第一主成分和第二主成分的總貢獻值高達99.35%，大部分曲心樣品分布于坐標軸左側，所有的曲皮樣品分布于坐標軸右側，由圖2B也可得出相似的結論。經MANOVA分析發(fā)現，曲皮和曲心樣品間差異極顯著（P＜0.001），這說明后火低溫大曲曲皮和曲心樣品間真菌物種組成存在顯著差異。

2.3 曲皮、曲心樣品物種組成分析

本研究將在20個樣品中平均相對豐度超過1.00%的真菌門或屬定義為優(yōu)勢真菌門或屬，小于1.00%的門或屬定義為“Others”，而不能鑒定到門或屬水平的序列定義為“unclassified”。納入本研究的后火低溫大曲樣品中真菌類群可鑒定為3個門、6個綱、8個目、17個科和18個屬，后火低溫大曲曲皮和曲心中優(yōu)勢真菌門和屬的相對含量比較分析如圖3所示。

圖3 基于門和屬水平的低溫大曲不同部位真菌構成分析Fig.3 Fungal community composition in different parts of lowtemperature Daqu at phylum and genus levels

由圖3A可知，根據UNITE數據庫，99.95%的序列被鑒定為子囊菌門（Ascomycota），10份低溫后火大曲中Ascomycota的相對含量均>99.73%，為優(yōu)勢菌門。由圖3B可知，在屬層面上，曲皮中的優(yōu)勢真菌屬主要為復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis，98.92%）。曲心中的優(yōu)勢真菌屬主要為Saccharomycopsis（58.20%）和Aspergillus（40.97%）。由此可見，后火低溫大曲曲皮和曲心中的微生物群落結構以及分布均存在一定差異，與圖2結果一致。經Wilcoxon符號秩檢驗發(fā)現，Saccharomycopsis在曲皮中極顯著偏高（P<0.001），Aspergillus在曲心中顯著偏高（P<0.01）。

與曲皮相比后火低溫大曲中曲心的物種豐富度和多樣性均較高，究其原因可能是由于在后火階段隨著水分的蒸發(fā)，曲心中的水分含量高于曲皮，微生物最后向水分較高的曲心發(fā)展[18]。羅惠波等[19]對山西汾酒3種低溫大曲的真菌群落進行分析發(fā)現，后火大曲中的優(yōu)勢菌為Pichia。張雙燕等[20]對北京地區(qū)低溫大曲中微生物多樣性進行分析發(fā)現，優(yōu)勢真菌種群以假絲酵母屬（Canndida）、Aspergillus、毛霉屬（Mucor）和Wickerhamomyces為主。這與本文研究結果有所差異，可能是由原料、工藝條件以及環(huán)境等因素引起的。

2.4 基于OTU水平真菌多樣性分析

本研究將在20個樣品中均存在的OTU定義為核心OTU。后火低溫大曲曲皮和曲心真菌OTU分布結果如圖4所示。

由圖4A可知，后火低溫大曲中共存在857個OTU，其中曲心中注釋的OTU總量高于曲皮，曲皮中僅注釋到572個OTU，而曲心中注釋到757個OTU。所有樣品中共有的OTU有91個，但包含了1 342 093條序列，占所有序列的94.19%。由圖4B可知，所有樣品中均存在且相對含量>1.00%的OTU僅2個，分別為OTU776（70.84%）和 OTU1183（17.91%），其中 OTU776隸 屬 于 Saccharomycopsis，OTU1183 隸 屬 于 Aspergillus，這進一步證實了 Saccharomycopsis和 Aspergillus為后火大曲中的優(yōu)勢真菌屬。酵母菌有利于酒精發(fā)酵，同時也影響相關酶系的產生，曲霉等具有較強的產酶能力，能促進酵母菌的生長繁殖，進而產生更多的酒精，對白酒的風味起著重要的作用[21]。

圖4 OTU在不同樣本中的分布和核心OTU相對含量瀑布圖Fig.4 Distribution of OTUs in different samples and waterfall plot of relative abundance of key OTUs

2.5 曲皮和曲心樣品差異菌群分析

LEfSe分析常用于分類學水平物種特征及差異的認識與揭示[22]。為進一步解析后火大曲曲皮和曲心中真菌群落結構的差異，采用Lefse分析對其差異微生物進行了甄別，結果見圖5。

圖5 LEfSe分析Fig.5 Cladogram of LEfSe

由圖5可知，LEfSe的LDA閾值得分為3.0，共鑒定出8個豐度差異顯著的類群（P<0.05），曲心和曲皮中各4個。結果表明，Saccharomycopsis可作為曲皮中的生物標志物，Aspergillus可作為曲心的生物標志物[23]。值得一提的是，曲皮中的優(yōu)勢真菌屬為Saccharomycopsis，而曲心中的優(yōu)勢真菌屬是Saccharomycopsis和Aspergillus。由此可見，后火低溫大曲曲皮和曲心中真菌群落結構差異主要是由優(yōu)勢真菌屬Saccharomycopsis和Aspergillus造成的。

3 結論

通過Illumina MiSeq高通量測序技術發(fā)現，石花后火低溫大曲曲皮和曲心中真菌群落結構差異顯著，曲心中真菌豐度和種類均顯著偏高，曲皮中優(yōu)勢真菌屬主要以Saccharomycopsis為主，曲心中以Saccharomycopsis和Aspergillus為主。進一步解析發(fā)現，造成曲皮和曲心樣品中真菌群落結構差異的主要菌群為Saccharomycopsis和Aspergillus等優(yōu)勢真菌屬。