景永帥，孫麗叢，張瑞娟，代立霞，李蘭，張丹參，吳蘭芳，國旭丹*

（1.河北科技大學(xué) 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.石家莊市中醫(yī)院肛腸科，河北 石家莊 050051；3.河北中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河北 石家莊 050200）

玉竹為百合科植物玉竹 [Polygonatum odoratum（Mill.）Druce]的干燥根莖[1]，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，是常用的藥食兩用資源，具有生津止燥、養(yǎng)陰清咳等功效，其富含多糖、黃酮、生物堿和強(qiáng)心苷等物質(zhì)[2]。玉竹多糖作為其主要的活性成分之一，具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、降血糖[5]、調(diào)節(jié)血脂[6]等作用。

近年來，越來越多的研究表明，多數(shù)非淀粉植物多糖不能完全被消化道降解，進(jìn)而到達(dá)結(jié)腸，被腸道微生物發(fā)酵利用，并且產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體代謝[7]。但也有數(shù)據(jù)表明，人體消化液對于多糖的結(jié)構(gòu)依舊存在一定的影響，可部分降解多糖[8]。故探究多糖在消化過程中的結(jié)構(gòu)變化和對機(jī)體的作用方式顯得尤為重要。消化試驗(yàn)最好方式是直接在生物體內(nèi)進(jìn)行，但由于消化系統(tǒng)的復(fù)雜性及試驗(yàn)成本等方面原因，大多數(shù)情況都是選擇體外試驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)消化的方式進(jìn)行，體外模擬已成為模擬人體內(nèi)消化吸收過程的有效途徑和趨勢[7]。近年來，對玉竹多糖的研究主要集中在提取工藝優(yōu)化、分離純化、單糖組成及藥理活性等方面，而對玉竹多糖在體內(nèi)外消化和酵解的研究鮮見。

本研究旨在運(yùn)用體外模擬消化系統(tǒng)和腸道微生物模型探究玉竹多糖消化過程中的變化，探究玉竹多糖發(fā)揮功能特征的作用機(jī)理，為相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉竹：安國墨源中藥材公司，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鄭玉光教授鑒定為百合科植物玉竹[Polygonatum odoratum（Mill.）Druce]的根莖；甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖（均為色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白酶（200 U/mg）、脂肪酶（200 U/mg），胃蛋白酶（500 U/mg）、α-淀粉酶（1 000 U/mg）：分析純，深圳市振芯嘉貿(mào)易有限公司；牛肉浸膏、硫酸銨，硫酸錳（均為分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2電熱恒溫水浴鍋：江蘇金壇宏華儀器廠；752紫外可見分光光度儀：上海光譜儀器有限公司；ME204E/02電子秤：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YXQ-SG46-280SA立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TGL-15B高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；S-100傅里葉變換紅外光譜儀：德國珀金埃爾默公司；LC1220高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；THZ臺(tái)式恒溫振蕩器：常州普天儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉竹多糖的提取

取玉竹，粉碎，過30目篩，25倍無水乙醇冷浸24h，除去脂溶性成分，抽濾后，藥渣通風(fēng)處干燥，干燥后密封保存，備用。干燥粉末按固液比1:50（g/mL）加入蒸餾水，85℃水浴提取3 h，提取2次，合并液濾，濃縮至濾液體積1/4，用5倍體積的無水乙醇醇沉，靜置過夜，抽濾，回收沉淀，干燥后即得玉竹粗多糖。

1.3.2 體外模擬唾液消化

模擬唾液：根據(jù)文獻(xiàn)[9]配制模擬唾液消化液，稱取α-淀粉酶0.215 5 g加入到250 mL唾液電解質(zhì)（pH值為6.9）中溶解，磁力攪拌20 min后過濾，濾液中再加入250 mL的唾液電解質(zhì)溶液混勻，放置冰箱備用。取30 mL玉竹多糖溶液和30 mL模擬唾液、30 mL水和30 mL模擬唾液、30 mL多糖溶液和30 mL水的混合物分別加入錐形瓶中。所有錐形瓶在37℃水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，在消化過程中（0.5 h），取出3 mL混合物，浸入沸水浴中使唾液酶失活后分別進(jìn)行還原糖含量、分子質(zhì)量和游離單糖組成及含量的測定。

1.3.3 體外模擬胃液消化

模擬胃液：根據(jù)文獻(xiàn)[9]配制模擬胃液消化液，稱取150 g胃電解質(zhì)溶液，向其中加入35.4 mg胃蛋白酶、37.5 mg胃脂肪酶以及1.5 mL CH3COONa（pH值為5.0、1.0 mol/L），在室溫下磁力攪拌10 min用0.1 mol/L鹽酸溶液將pH值調(diào)至1.5，置于冰箱備用。取30 mL水和30 mL模擬胃液、30 mL多糖溶液和30 mL模擬胃液的混合物分別加入錐形瓶中。所有錐形瓶在37℃臺(tái)式恒溫振蕩器（150 r/min）中進(jìn)行反應(yīng)，在消化過程中（0.5、1.0、2.0、4.0 h 和 6.0 h），取出 3 mL 混合物，浸入沸水浴中使胃蛋白酶失活后分別測定還原糖含量、分子質(zhì)量和游離單糖的組成及含量。

1.3.4 體外模擬胃腸消化

模擬腸液：根據(jù)文獻(xiàn)[9]配制模擬腸液消化液，稱取26 mg的胰蛋白酶放置于棕色瓶中，向其中加入100 g胰酶溶液，200 g膽汁以及100 g腸電解質(zhì)溶液（simulated intestinal electrolyte solution，SIE），最后用 0.1 mol/L的NaOH把pH值調(diào)至7.5，置于冰箱中備用。取30 mL模擬胃液和30 mL水、30 mL模擬胃液和30 mL多糖溶液以及30 mL水和30 mL多糖溶液分別加入錐形瓶中，在37℃臺(tái)式恒溫振蕩器（150 r/min）中反應(yīng)6.0 h后，再向錐形瓶中分別加入30 mL模擬腸液，在消化過程中（0.5、1.0、2.0、4.0 和 6.0 h），取出 3 mL 混合物，浸入沸水浴中使胰蛋白酶失活后分別測定還原糖含量、分子質(zhì)量和游離單糖的組成及含量。

1.3.5 玉竹多糖對腸道菌群調(diào)節(jié)作用

1.3.5.1 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：10.0 g蛋白胨，5.0 g牛肉膏，4.0 g酵母提取物，2.0 g檸檬酸氫二銨，20.0 g葡萄糖，2.0 g磷酸氫二鉀，1.6 g硫酸銨，5.0 g乙酸銨，0.2 g硫酸鎂，0.05 g硫酸錳，1 mL吐溫80，去離子水1 000 mL，混勻后保存于4℃下備用。

LB培養(yǎng)基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母，10.0 g氯化鈉，去離子水1 000 mL，混勻后保存于4℃下備用。

1.3.5.2 菌種活化及生長曲線的測定

將大腸桿菌（大腸埃希氏菌，CGMCC NO.1.1521）和乳桿菌（植物乳桿菌，CGMCC NO.1258）以0.1%接菌量分別接種于LB培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基上，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h進(jìn)行菌種活化。在體積100 mL的液體試驗(yàn)培養(yǎng)基中分別加入10 mL的0.2 mg/mL的玉竹多糖，并均接種2%的大腸桿菌和乳桿菌菌懸液，37℃下靜止培養(yǎng)，采用比濁法在不同時(shí)間間隔（0、0.5、2、4、6、8、16、24、40 h）測定大腸桿菌、乳桿菌的生長曲線，用紫外可見分光光度計(jì)在560 nm下測定OD值及pH值，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白[10]。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。同時(shí)測定在0、0.5、1.0、2.0、4.0、12.0、24.0 h時(shí)的還原糖含量、分子質(zhì)量和游離單糖組成。

1.3.6 化學(xué)成分分析

玉竹多糖的總糖含量測定采用以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-硫酸法[11]；玉竹多糖的蛋白質(zhì)含量測定采用以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)的考馬斯亮藍(lán)法[12]；還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法。

1.3.7 紅外光譜掃描

采用KBr壓片法，在4 000 cm-1～450 cm-1范圍內(nèi)對玉竹多糖進(jìn)行紅外光譜掃描[13]。

1.3.8 分子質(zhì)量的測定

采用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）對玉竹多糖及其消化后產(chǎn)物進(jìn)行相對分子質(zhì)量的測定。色譜條件如下：色 譜 柱 TSK-GEL G4000Pwxl，TSK-GEL G2500 Pwxl（10μm）；流動(dòng)相為超純水，流速0.6mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。各葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為1 mg/mL的溶液，按上述色譜條件分析，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖。根據(jù)保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線（lgMw=-0.310 8x+11.749 0，R2=0.999 1），計(jì)算待測樣品的相對分子質(zhì)量[14]。

1.3.9 單糖組成的測定

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對玉竹多糖及消化后產(chǎn)物進(jìn)行單糖測定。取甘露糖（mannose，Man）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、葡萄糖（glucose，Glc）、木糖（xylose，Xyl）、半乳糖（galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）和巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）配制成 1 mg/mL的混合標(biāo)樣，取0.2 mL于離心管中，分別加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.2 mL，70℃水浴鍋加熱30 min。冷卻后加入0.2 mL 0.3 mol/L的鹽酸，加入1 mL氯仿進(jìn)行萃取，離心。取上清液重復(fù)上述操作3次，稀釋，定容[15]。色譜條件：流動(dòng)相為0.1 mol/mL磷酸鹽緩沖溶液（pH值為7.0）:乙腈（體積比為83:17），流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，紫外檢測波長245 nm，進(jìn)樣量為20 μL。

精密稱定玉竹多糖20 mg，加入5 mL的2.0 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，110℃下加熱水解6 h。取出，放冷，加入甲醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去TFA，加入2 mL蒸餾水溶解，即為玉竹多糖的水解液，水解液按上述單糖標(biāo)品處理方式采用相同色譜條件進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 17.0處理和分析數(shù)據(jù)，使用Origin 8.0和Microsoft Excel 2003作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉竹多糖的理化性質(zhì)

2.1.1 玉竹多糖的可溶性總糖、蛋白質(zhì)和還原糖含量

總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12.392 0x+0.142 9（R2=0.992 0）；蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.312 9x+0.703 5（R2=0.992 0），還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.933 7x+0.173 5（R2=0.995 0）。經(jīng)計(jì)算玉竹多糖可溶性總糖含量為77.74%，蛋白質(zhì)含量為3.98%，未在玉竹多糖中檢測到還原糖。

2.1.2 玉竹多糖紅外光譜分析

玉竹多糖紅外光譜結(jié)果如圖1所示。

圖1 玉竹多糖的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of P.odoratum polysaccharides

由圖1可知，3 400.55 cm-1附近具有光滑而寬的強(qiáng)吸收峰，此為羥基（O—H）的伸縮振動(dòng)，2 935.17 cm-1處的吸收峰與甲基或亞甲基的C—H的伸縮振動(dòng)有關(guān)，1 740 cm-1左右吸收峰為酯基（—COOR）中的伸縮振動(dòng)且吸收較弱，1 644.02 cm-1為O—H彎曲振動(dòng)吸收峰，1 247.45 cm-1為 C—O 吸收峰，1 375.28 cm-1為C—H內(nèi)彎曲振動(dòng)，1 024.75 cm-1為醇羥基的變角振動(dòng)，805.24 cm-1處為α-型糖苷鍵產(chǎn)生的吸收峰。

2.1.3 玉竹多糖的相對分子質(zhì)量

玉竹多糖分子質(zhì)量測定結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，玉竹多糖有2種分子質(zhì)量分布，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（lgMw=-0.310 8x+11.749 0，R2=0.999 1），計(jì)算出分子質(zhì)量分別為 1.37×106、6.75×103Da。

圖2 玉竹多糖的高效凝膠滲透色譜圖Fig.2 HPGPC chromatogram of P.odoratum polysaccharide

2.1.4 玉竹多糖的單糖組成分析

玉竹多糖水解后產(chǎn)物的色譜結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，玉竹多糖的單糖由Man、GalA、Glc、Gal組成，比例為13.55:2.42:1.00:2.81。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品及玉竹多糖的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of standard and P.odoratum polysaccharides

2.2 玉竹多糖的體外模擬消化試驗(yàn)

2.2.1 模擬唾液消化

α-淀粉酶是口腔唾液中最主要的蛋白質(zhì)成分，能分解淀粉及其他碳水化合物的α-（1→4）糖苷鍵[16]。模擬唾液消化0.5 h后玉竹多糖還原糖、單糖組成、相對分子質(zhì)量的變化如圖4所示。

圖4 玉竹多糖的體外模擬唾液消化試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of the in vitro simulated saliva digestion test of P.odoratum polysaccharide

由圖4A可知，多糖和模擬唾液本身不含還原糖，經(jīng)唾液消化后，吸光度并未發(fā)生明顯變化，沒有產(chǎn)生還原糖；由圖4B可以看出，多糖水溶液和模擬唾液不含游離單糖，消化后并沒有產(chǎn)生游離的單糖；由圖4C可知，相對于多糖水溶液，經(jīng)唾液消化后的多糖的分子質(zhì)量分布并未發(fā)生變化。以上結(jié)果說明，玉竹多糖不能被模擬唾液消化，與鼠尾藻多糖體外模擬唾液消化試驗(yàn)結(jié)果一致[17-18]。

2.2.2 模擬胃液消化

模擬胃液消化 0.5、1.0、2.0、4.0 h 和 6.0 h 后玉竹多糖的還原糖、單糖組成、相對分子質(zhì)量的變化如圖5所示。

圖5 玉竹多糖的體外模擬胃液消化試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of the in vitro simulated gastric juice digestion test of P.odoratum polysaccharide

由圖5A可知，多糖和模擬胃液本身不含還原糖，經(jīng)胃液消化后，吸光度并未發(fā)生明顯變化，沒有產(chǎn)生還原糖；由圖5B可以看出，多糖水溶液和模擬胃液不含游離單糖，消化后并沒有產(chǎn)生游離的單糖；由圖5C可知，玉竹多糖有2種分子質(zhì)量分布，模擬胃液有2種分子質(zhì)量分布，經(jīng)胃液消化后，相對于多糖溶液和模擬胃液的分子質(zhì)量分布，多糖的分子質(zhì)量分布并未發(fā)生變化；以上結(jié)果說明玉竹多糖不能被模擬胃液消化，與桑葚多糖在模擬胃液消化的試驗(yàn)結(jié)果相一致。

2.2.3 模擬胃腸液消化

模擬胃腸液消化 0.5、1.0、2.0、4.0 h 和 6.0 h 后玉竹多糖的還原糖、單糖組成和相對分子質(zhì)量的變化結(jié)果如圖6所示。

圖6 玉竹多糖的體外模擬胃腸液消化試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of the in vitro simulated gastrointestinal fluid digestion test of P.odoratum polysaccharide

由圖6A可知，多糖和模擬胃腸液本身不含還原糖，經(jīng)胃腸液消化后，雖然吸光度值有顯著性變化，但是并沒有產(chǎn)生還原糖；由圖6B可以看出，多糖水溶液不含游離單糖，模擬胃腸液含葡萄糖，經(jīng)胃腸液消化后并沒有產(chǎn)生新的游離單糖；由圖6C可知，與多糖溶液和模擬胃腸液分子質(zhì)量分布對比，經(jīng)胃腸液消化后，多糖的分子質(zhì)量分布并未發(fā)生變化；以上結(jié)果說明玉竹多糖不能被模擬胃腸液消化。

綜上所述，經(jīng)唾液、胃液、胃腸液消化后，多糖還原糖、單糖組成、分子質(zhì)量均不發(fā)生變化，說明玉竹多糖在體外模擬胃腸液模型中不被消化。

2.3 玉竹多糖與腸道菌群的相互影響

2.3.1 玉竹多糖對乳桿菌的影響

玉竹多糖對乳桿菌的影響如圖7所示。

圖7 多糖對乳桿菌的影響Fig.7 Effect of polysaccharide on Lactobacillus bulgaricus

由圖7A可以看出，與空白組相比，加入多糖后，乳桿菌的pH值變化不明顯；由圖7B乳桿菌的生長曲線可以看出，在6 h后乳桿菌生長進(jìn)入對數(shù)生長期，菌數(shù)加速分裂，迅速生長，生長至20 h后，菌種生長基本保持在恒定狀態(tài)，乳桿菌的生長進(jìn)入穩(wěn)定期，與空白組相比，加入多糖后，OD560值大于空白組，說明玉竹多糖對乳桿菌生長可能存在促進(jìn)作用。

乳桿菌降解多糖 0.5、1、2、4、12 h 和 24 h 后玉竹多糖中的還原糖、單糖組成和相對分子質(zhì)量的變化結(jié)果如圖8所示，由圖8A可知，多糖降解12 h和24 h時(shí)，還原糖含量顯著增加（p<0.05，p<0.01），說明乳桿菌可以降解多糖，產(chǎn)生了還原糖；由圖8B可以看出，玉竹多糖經(jīng)乳桿菌作用后，在12 h和24 h時(shí)檢測到甘露糖，說明乳桿菌可以降解多糖，進(jìn)而被機(jī)體利用；由圖8C可知，與多糖溶液和乳桿菌分子質(zhì)量分布對比，經(jīng)乳桿菌作用后，在32 min出現(xiàn)新的峰，進(jìn)一步說明乳桿菌可以降解多糖；以上結(jié)果說明玉竹多糖可以被乳桿菌降解。

圖8 玉竹多糖經(jīng)乳桿菌降解試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 The results of P.odoratum polysaccharide degradation by Lactobacillus bulgaricus

2.3.2 玉竹多糖對大腸桿菌的影響

玉竹多糖對大腸桿菌的影響結(jié)果如圖9所示。

由圖9A的pH值變化可以看出，與空白組相比，加入多糖后，大腸桿菌的pH值變化不明顯；由圖9B大腸桿菌的生長曲線可以看出，在4 h后大腸桿菌生長進(jìn)入對數(shù)生長期，生長至20 h后，生長進(jìn)入穩(wěn)定期，與空白組相比，加入多糖后，OD560值小于空白對照組，說明玉竹多糖對大腸桿菌生長存在抑制作用。

圖9 玉竹多糖對大腸桿菌的影響Fig.9 Effect of P.odoratum polysaccharide on Escherichia coli

大腸桿菌降解玉竹多糖 0.5、1、2、4、12 h 和 24 h后其中的還原糖、單糖組成和相對分子質(zhì)量的變化結(jié)果如圖10所示。

由圖10A可知，多糖降解4 h和12 h時(shí)，還原糖含量顯著增加，說明大腸桿菌可以降解多糖，產(chǎn)生了還原糖；由圖10B可以看出，玉竹多糖經(jīng)大腸桿菌作用后，在4 h和12 h時(shí)檢測到甘露糖，這與圖8A結(jié)果一致。24 h時(shí)，甘露糖的峰消失，說明大腸桿菌可以降解多糖，進(jìn)而被機(jī)體利用，并且降解的多糖可能作為碳源再次被大腸桿菌利用；由圖10C可以看出，與玉竹多糖和大腸桿菌的分子質(zhì)量分布相比，玉竹多糖經(jīng)大腸桿菌作用后，出現(xiàn)了新的峰，進(jìn)一步說明大腸桿菌可降解玉竹多糖。龔雯等[19]在對金茶花多糖的體外消化及酵解特性研究中發(fā)現(xiàn)，金茶花多糖未被體外模擬胃腸道試驗(yàn)消化，但能被大腸桿菌等分解利用，與本研究的結(jié)果類似。

圖10 玉竹多糖經(jīng)大腸桿菌降解試驗(yàn)結(jié)果Fig.10 The results of P.odoratum polysaccharide degradation by Escherichia coli

綜上所述，玉竹多糖對乳桿菌的生長有促進(jìn)作用，可抑制大腸桿菌的生長，并且乳桿菌和大腸桿菌可部分降解多糖。

3 結(jié)論

玉竹多糖由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖組成，含有2種分子質(zhì)量分布，分別為1.37×106、6.75×103Da。在體外模擬消化系統(tǒng)中，經(jīng)唾液、胃液和胃腸液消化后，發(fā)現(xiàn)多糖分子質(zhì)量沒有變化，而且消化前后的還原糖含量無顯著變化，說明其均不能消化分解玉竹多糖。但是在乳桿菌和大腸桿菌的作用下，玉竹多糖在開始反應(yīng)時(shí)均無單糖生成，隨著時(shí)間的變化產(chǎn)生甘露糖，多糖分子質(zhì)量降低，結(jié)果表明乳桿菌和大腸桿菌均能部分降解玉竹多糖。兩者不同的是大腸桿菌在分解玉竹多糖后產(chǎn)生的甘露糖能夠被機(jī)體再次吸收利用，而乳桿菌則不能；玉竹多糖存在與否對乳桿菌的對數(shù)生長期無明顯影響，但對乳桿菌的生長起到促進(jìn)作用，而添加玉竹多糖能延長大腸桿菌對數(shù)生長期，但總體上對其增長起到抑制作用。綜上所述，玉竹多糖在體外模擬胃腸道模型中不被消化，但在體外模擬菌種進(jìn)行消化時(shí)能夠被消化，并進(jìn)一步被機(jī)體利用。