李夢(mèng)媛，李小黎，薛 冰，張乃文，魯麗華，張 婧，刁華瓊，陳 琳

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100029)

女性在中年期由于體內(nèi)雌激素水平減少導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列以軀體、精神癥狀為主的圍絕經(jīng)期表現(xiàn)，平素工作壓力大、社會(huì)家庭關(guān)系不和諧等因素的刺激，更易導(dǎo)致女性圍絕經(jīng)期抑郁癥的發(fā)生[1]。該病以情緒低落、焦慮憂郁等癥狀為主，伴有潮熱盜汗、煩躁不安、記憶力下降等表現(xiàn)。研究[2]顯示，圍絕經(jīng)期抑郁女性在心理健康、生活質(zhì)量方面比同期女性更差。研究[3-6]表明，雌激素撤退可導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞再生障礙，下丘腦-垂體-卵巢(hypothalamus-pituitary-ovary,HPO)軸、下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal, HPA)軸功能異常和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)缺乏，從而引起圍絕經(jīng)期抑郁的發(fā)生。臨床多采用激素及抗抑郁類藥物治療[7]，雖見效快，但存在不良反應(yīng)大、復(fù)發(fā)率高等問題，而中醫(yī)辨證論治對(duì)該病的治療有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[8]。柴坤解郁湯是治療圍絕經(jīng)期抑郁的臨床經(jīng)驗(yàn)方。本研究從去勢(shì)應(yīng)激模型大鼠行為學(xué)變化、HPO軸激素水平變化以及下丘腦雌激素受體α(estrogen receptor alpha,ERα)水平變化方面，探究柴坤解郁湯改善圍絕經(jīng)期抑郁的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量(190±20)g，共60只。購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001]，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審查編號(hào)為AEEI-2021-218。

1.2 藥物及試劑 柴坤解郁湯(益母草24 g,刺五加、烏梅、浮小麥各18 g,合歡花、巴戟天各12 g,柴胡、郁金、梔子各9 g)，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，并制成顆粒劑；鹽酸氟西汀膠囊(H20073985)：山西仟源醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司；大鼠卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)/黃體生成素(luteinizing hormone，LH)/雌二醇(estradiol,E2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(E-EL-R0391c/E-EL-R0026c/E-EL-0152c)：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；抗雌激素受體α(estrogen receptor alpha,ERα)抗體(1325)：美國細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司；抗GAPDH抗體(ab9485)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(ab7090)：英國艾博抗；Tris-glycine-SDS電泳緩沖液(AR0139)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(AR0138)、Trizol試劑(FTR-50)：北京賽百盛；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(QP056)：GeneCopeia；2×SYBR Green qPCR反應(yīng)混合液(無ROX)(MPC2107026)：武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器 5415D型離心機(jī)：德國Eppendorf公司；酶標(biāo)分析儀：北京普朗新技術(shù)有限公司；LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)：美國UVP公司；iQ5 Real-time PCR擴(kuò)增儀：美國Applied Biosystems公司；曠場試驗(yàn)敞箱及數(shù)據(jù)分析、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)裝置：首都醫(yī)科大學(xué)行為學(xué)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 圍絕經(jīng)期抑郁大鼠模型復(fù)制、分組及給藥 將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，柴坤解郁湯低、中、高劑量組和鹽酸氟西汀組，每組10只。參照文獻(xiàn)[9-10]的方法及本實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用去勢(shì)手術(shù)聯(lián)合慢性不可預(yù)知性溫和刺激(chronic unpredictable mild stimulation,CUMS)兩步法復(fù)制圍絕經(jīng)期抑郁模型。①去勢(shì)手術(shù)。用1.5%戊巴比妥鈉5 mL/kg對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，在背部肋弓下1 cm與脊柱側(cè)面1 cm相交處，剪開切口，用鑷子找出一團(tuán)被脂肪組織包裹的粉紅色菜花狀卵巢，在近子宮角位置進(jìn)行結(jié)扎，切除雙側(cè)卵巢。假手術(shù)組僅切除卵巢周圍少量脂肪,術(shù)后無需特殊護(hù)理。②CUMS。術(shù)后第8天，對(duì)摘除卵巢的模型組大鼠開始進(jìn)行CUMS處理，假手術(shù)組正常飼養(yǎng)。每天隨機(jī)給予2種不同刺激，持續(xù)21 d。同種刺激再次出現(xiàn)的間隔周期為4 d以上。刺激方法：鼠籠傾斜24 h(將鼠籠傾斜至45°)；擁擠鼠籠24 h；持續(xù)光照24 h；禁食24 h；禁水24 h；4 ℃冷水中5 min；單籠飼養(yǎng)24 h；束縛(束縛盒束縛四肢限制活動(dòng))3 h；潮濕墊料24 h；夾尾3 min。以糖水偏愛率降低、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加等指標(biāo)[11-12]判斷模型是否復(fù)制成功。參照課題組前期實(shí)驗(yàn)有效藥量[13]，按照成人用量7倍計(jì)算大鼠灌胃量，柴坤解郁湯低、中、高劑量組給藥劑量分別為0.9、1.8、3.6 g/kg，分別相當(dāng)于成人臨床用量的3.5、7、14倍，以10 mL/kg生理鹽水配置顆粒劑，3組濃度分別為0.11、0.22、0.44 g/mL，鹽酸氟西汀組給藥劑量為2.33 mg/kg，灌胃濃度為0.70 g/mL。假手術(shù)組和模型組予以等容積生理鹽水。以上灌胃均每日1次，從應(yīng)激開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，持續(xù)21 d。

2.2 行為學(xué)觀察

2.2.1 蔗糖水偏好試驗(yàn) 蔗糖水偏好試驗(yàn)主要測試大鼠快感是否缺失，而快感缺失是衡量抑郁癥狀的重要標(biāo)準(zhǔn)。模型復(fù)制第21天，12 h禁食禁水后，將大鼠單籠放置，給每個(gè)籠子兩瓶同樣容積的液體(一瓶為1%蔗糖水，一瓶為純水)，4 h后取走兩個(gè)瓶子并稱質(zhì)量。大鼠蔗糖水偏愛率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

2.2.2 曠場試驗(yàn) 模型復(fù)制第21天，將大鼠放入100 cm×100 cm×40 cm的曠場反應(yīng)箱內(nèi)底面正中心，進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)，觀察并記錄每只大鼠在5 min內(nèi)所有活動(dòng)距離及進(jìn)入中心區(qū)域的活動(dòng)距離。實(shí)驗(yàn)時(shí)保持安靜，采用Super Maze視頻記錄分析軟件(上海欣軟信息科技有限公司)記錄曠場試驗(yàn)結(jié)果。

2.2.3 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) 模型復(fù)制第21天，在室溫下將大鼠置入水深約37 cm的溫水中，強(qiáng)迫大鼠游泳6 min，記錄后4 min 內(nèi)大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間，表現(xiàn)為大鼠僅有頭部露出水面，身體呈現(xiàn)飄浮狀態(tài)，四肢可有微動(dòng)但不掙扎。

2.3 ELISA法檢測大鼠血清FSH、LH、E2水平 從大鼠腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min后，3 500 r/min離心10 min，分離血清，放置于-80 ℃冰箱中保存，采用ELISA試劑盒測定血清FSH、LH、E2水平。

2.4 Western blot法檢測大鼠下丘腦ERα蛋白表達(dá)水平 取大鼠下丘腦組織，提取總蛋白，蛋白定量后配制SDS-PAGE凝膠，于4 ℃轉(zhuǎn)膜緩沖液中350 mA恒電流轉(zhuǎn)膜2 h，將膜按蛋白的印跡位置剪開，置于含ERα一抗(1∶1 000)的Blotto中，搖動(dòng)漂洗后，放入對(duì)應(yīng)二抗(1∶8 000)的Blotto中，將膜置于曝光盒中，對(duì)感光膠片進(jìn)行曝光后進(jìn)行顯影、定影處理，分析各組蛋白條帶的亮度值。

2.5 Rt-PCR法檢測大鼠下丘腦ERα mRNA表達(dá)水平 將上述-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存的腦組織，加入1 mL Trizol研磨，按說明書步驟提取RNA，加入20 μL DEPC水溶解混勻，分別留取1 μL用于定量和電泳，其余RNA置-80 ℃保存。按照反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。ERα正向引物：5′-CATTATGGGGTCTGGTCCTGCG-3′；ERα反向引物：5′-GCCCACTTCGTAACACTTGC-3′。GAPDH正向引物：5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3′；GAPDH反向引物：5′-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′。循環(huán)溫度和時(shí)間：95 ℃，30 s；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s。共40個(gè)循環(huán)。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

3 結(jié)果

3.1 6組大鼠蔗糖水偏好率、曠場試驗(yàn)結(jié)果、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠蔗糖水偏好率、曠場總路程、曠場中心區(qū)域路程顯著降低(P<0.05)，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長(P<0.05)。與模型組比較，柴坤解郁湯中、高劑量組及鹽酸氟西汀組蔗糖水偏好率，曠場總路程、曠場中心區(qū)域路程顯著升高(P<0.05)，柴坤解郁湯高劑量組、鹽酸氟西汀組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著縮短(P<0.05)。柴坤解郁湯中、高劑量組和鹽酸氟西汀組蔗糖水偏好率、曠場總路程和曠場中心區(qū)域路程顯著大于柴坤解郁湯低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 6組大鼠蔗糖水偏好率、曠場試驗(yàn)結(jié)果、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較

3.2 6組大鼠血清FSH、LH、E2水平及下丘腦ERα蛋白和mRNA表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清FSH、LH水平顯著升高(P<0.05)，血清E2水平及下丘腦ERα蛋白和ERα mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，柴坤解郁湯中、高劑量組與鹽酸氟西汀組FSH、LH水平顯著降低(P<0.05)，E2水平及下丘腦ERα蛋白和其mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。柴坤解郁湯中、高劑量組和鹽酸氟西汀組血清FSH、LH水平顯著低于柴坤解郁湯低劑量組(P<0.05)，血清E2水平和下丘腦ERα表達(dá)水平顯著高于柴坤解郁湯低劑量組(P<0.05)；柴坤解郁湯中劑量組E2水平顯著高于鹽酸氟西汀組(P<0.05)。見表2和圖1。

表2 6組大鼠血清FSH、LH、E2含量及下丘腦ERα蛋白和mRNA表達(dá)水平比較

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.柴坤解郁湯低劑量組；D.柴坤解郁湯中劑量組；E.柴坤解郁湯高劑量組；F.鹽酸氟西汀組

4 討論

相關(guān)調(diào)查[14]顯示，在世界范圍內(nèi)圍絕經(jīng)期抑郁發(fā)病率約為25%，這一疾病已經(jīng)嚴(yán)重影響中年女性的生活質(zhì)量。目前，抑郁癥動(dòng)物模型主要有脂多糖腹腔注射模型、嗅球摘除模型、基因模型、CUMS模型等[15]?？紤]到模型穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)可操作性，本研究采用CUMS聯(lián)合去勢(shì)手術(shù)復(fù)制圍絕經(jīng)期抑郁動(dòng)物模型。

圍絕經(jīng)期抑郁屬于中醫(yī)學(xué)“絕經(jīng)前后諸癥”“郁證”等范疇，其發(fā)生與肝腎兩臟功能失調(diào)密不可分。女子“七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子”(《素問·上古天真論》)。圍絕經(jīng)期婦女天癸漸竭，腎氣漸衰，精血不足，沖任空虛，再加上女性平素易受七情所傷，常憂思多慮，致肝氣失疏，氣機(jī)郁結(jié)不暢，從而易發(fā)展為本病。《景岳全書》：“情志之郁，總由乎心，此因郁而病也。”因此，圍絕經(jīng)期抑郁的基本病機(jī)為腎虛肝郁[16]。柴坤解郁湯是臨床經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)腎虛肝郁型圍絕經(jīng)期抑郁的療效顯著。本方以柴胡和刺五加為君，活血祛瘀、補(bǔ)腎益氣、安神益智；臣藥益母草活血散瘀調(diào)經(jīng)，為婦科圣藥；佐以浮小麥、烏梅養(yǎng)心安神、清虛熱、斂陰止汗，合歡花安神解郁、養(yǎng)血寧心，郁金既能活血也能行氣，有涼血清心、解郁行氣之功，巴戟天補(bǔ)腎益精，配以少量梔子以清氣分郁熱、涼血除煩。全方標(biāo)本兼治，配伍合理，共奏補(bǔ)益腎精、疏肝解郁、養(yǎng)心安神之功。

行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠蔗糖水偏好率、曠場總路程、曠場中心區(qū)域路程均顯著降低，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯增加，表明模型組大鼠對(duì)新異環(huán)境的探索行為和自主行為減少，對(duì)美好事物的欣快感降低，遇到危險(xiǎn)的絕望度增加，說明圍絕經(jīng)期抑郁模型大鼠處于應(yīng)激狀態(tài)。與模型組大鼠比較，柴坤解郁湯中、高劑量組大鼠蔗糖水偏好率、曠場總路程、曠場中心區(qū)域路程均顯著升高，提示柴坤解郁湯能夠有效改善圍絕經(jīng)期抑郁大鼠應(yīng)激狀態(tài)。

研究[17]表明，圍絕經(jīng)期系列癥狀主要是由卵巢功能退行性改變，機(jī)體雌激素水平明顯波動(dòng)或下降，導(dǎo)致HPO軸失衡引起的。HPO軸是調(diào)節(jié)女性生理現(xiàn)象的神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)，主要是由下丘腦弓狀核和室旁核脈沖式分泌促性腺激素釋放激素，再通過門脈系統(tǒng)的微血管傳遞至垂體前葉，刺激垂體釋放FSH和LH，LH和FSH再促進(jìn)卵巢分泌E2[18]。臨床研究[19]表明，圍絕經(jīng)期抑郁患者血清E2水平低于圍絕經(jīng)期無癥狀者，但FSH、LH等激素水平顯著升高，說明HPO軸激素水平波動(dòng)與圍絕經(jīng)期抑郁的發(fā)病密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組E2水平顯著低于假手術(shù)組，而FSH、LH水平明顯高于假手術(shù)組；治療后柴坤解郁湯中、高劑量組E2水平明顯升高，F(xiàn)SH、LH水平明顯降低，且柴坤解郁湯中劑量組E2水平顯著高于柴坤解郁湯高劑量組和鹽酸氟西汀組，說明柴坤解郁湯可能通過提高E2水平影響HPO軸激素水平變化，從而發(fā)揮改善圍絕經(jīng)期抑郁的作用。非孕婦女體內(nèi)雌激素除了卵巢合成分泌之外，還可以通過腎上腺皮質(zhì)及周圍脂肪組織、肝臟等芳香化途徑轉(zhuǎn)化而成。鹽酸氟西汀干預(yù)后模型大鼠血清E2水平的恢復(fù)可能是其對(duì)腎上腺皮質(zhì)的激發(fā)作用所致[20]。

雌激素通過與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮抗抑郁作用，主要通過ERα和ERβ這兩種ER亞型作用于細(xì)胞。研究[21]表明，ER激動(dòng)劑可發(fā)揮抗抑郁樣作用，反之，雌激素受體拮抗劑則會(huì)阻斷雌激素的抗抑郁作用。圍絕經(jīng)期不僅雌激素水平下降明顯，神經(jīng)系統(tǒng)、免疫組織或心腦血管系統(tǒng)中雌激素受體表達(dá)水平也發(fā)生變化[22]。ERα在下丘腦、垂體細(xì)胞及免疫細(xì)胞的生長、存活和應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用，是介導(dǎo)雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要蛋白。研究[23]發(fā)現(xiàn)，大約40%的ERα結(jié)構(gòu)與下丘腦室旁核釋放的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)相似，并且發(fā)現(xiàn)雌激素反應(yīng)元件存在于CRH啟動(dòng)子區(qū)，說明雌激素可能通過ERα及CRH神經(jīng)細(xì)胞共區(qū)域化直接影響CRH水平，進(jìn)而影響HPA軸，導(dǎo)致抑郁發(fā)生。下丘腦作為神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的中樞系統(tǒng)，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要部分。本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠下丘腦ERα表達(dá)水平顯著下降；與模型組比較，柴坤解郁湯中、高劑量組和鹽酸氟西汀組下丘腦ERα表達(dá)水平顯著升高；柴坤解郁湯中、高劑量組下丘腦ERα表達(dá)水平較接近于假手術(shù)組。結(jié)果表明，柴坤解郁湯可增加模型大鼠下丘腦ERα的表達(dá)水平，可能是該方通過提高體內(nèi)雌激素水平，影響HPO軸激素變化，從而提高下丘腦ERα水平，以此增強(qiáng)雌激素的生物學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，柴坤解郁湯可以有效預(yù)防并改善圍絕經(jīng)期抑郁大鼠的應(yīng)激狀態(tài)，其作用機(jī)制與其影響HPO軸激素水平以及調(diào)節(jié)下丘腦ERα表達(dá)水平有關(guān)。