王晨， 滿曉婷， 王穎， 張云紫， 周新雨， 萬汝燕， 夏曉華

（河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng)453007）

內(nèi)分泌干擾物是一類激素類環(huán)境污染物，類固醇激素被認為是內(nèi)分泌干擾物中最活躍的藥物類別之一，極少量殘留即可影響水生脊椎動物的繁殖和發(fā)育。作為一類重要的類固醇激素，孕激素具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與生殖周期的功能。孕酮（P4）是一種典型的孕激素，它被廣泛用于人類激素替代療法、避孕藥的制作和其他醫(yī)療應用（Lianget al.，2015），還被廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，以提高動物產(chǎn)量和相關的經(jīng)濟效益。P4會以糞便和尿液的形式進入污水處理廠，由于不能被完全去除，其在水體中的殘留往往超過正常范圍，給水生生物帶來了潛在的嚴重風險。污水處理廠廢水中的P4濃度為4.5～24.8 ng·L-1（Yarahmadiet al.，2018），豬場和奶牛場廢水中的P4濃度高達3 470～11 900 ng·L-1（Liuet al.，2012）。

環(huán)境中較低的P4殘留即可影響生物體內(nèi)源激素的合成、分泌和代謝，干擾機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡，進而影響生物體正常的生長、發(fā)育和繁殖過程。在3.5～306 ng·L-1的P4中暴露14 d，雌性斑馬魚Danio rerio的卵母細胞加速成熟且卵巢受到生理性損傷（Zucchiet al.，2013）。Wang等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，在50 ng·L-1和100 ng·L-1的P4處理下，雄性鯽魚Carassius auratus的精巢中出現(xiàn)卵原細胞，高濃度P4暴露組有更多的雌魚產(chǎn)生，使鯽魚性別比偏向雌性。魚類的生殖活動受下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary gonadal，HPG）軸的調(diào)節(jié)，Hou等（2018）發(fā)現(xiàn)斑馬魚在幼魚階段接觸炔諾酮可能會影響性腺分化和性別比例，并歸因于HPG軸基因表達的改變。Zhao和Fent（2016）的研究表明，晝夜節(jié)律可以調(diào)節(jié)HPG軸相關活動及各種重要的生物過程。因此，HPG軸和晝夜節(jié)律相關基因的表達改變可能干擾魚類的性腺發(fā)育，進而影響其繁殖。

魚類是低等的水生生物，其性腺發(fā)育和性別決定方式易受外界環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的影響。楊倩等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，雙酚F能導致下丘腦-垂體-甲狀腺軸、HPG軸和下丘腦-垂體-腎上腺軸上一系列基因的表達水平發(fā)生改變，進而影響斑馬魚的內(nèi)分泌功能。Zeilinger等（2009）發(fā)現(xiàn)在0.8 ng·L-1環(huán)境濃度水平的左炔諾孕酮影響下，雌魚的卵細胞結(jié)構及卵巢發(fā)育發(fā)生顯著改變。因胚胎相較于成魚和幼魚對污染物更敏感（Nagel，2002），本文以鯽魚胚胎為實驗對象，討論P4對鯽魚胚胎發(fā)育以及其對晝夜節(jié)律和HPG軸相關基因表達的影響，從而揭示P4對魚類早期胚胎的生態(tài)毒理學效應。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

孕酮標準品購自上海成捷化學有限公司，將其溶解在100%乙醇中用作儲備溶液（1 mg·mL-1），然后用脫氯自來水稀釋以獲得實驗濃度。4 ℃避光保存。

1.2 實驗動物

鯽魚購自河南師范大學水產(chǎn)學院水產(chǎn)養(yǎng)殖中心，置于200 L水箱中用曝氣自來水馴養(yǎng)1周。隨機挑選健康性成熟的親魚，用干法人工授精獲取受精卵。將正常發(fā)育的囊胚期胚胎隨機分配到直徑為180 mm的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿中均勻分布300～500個胚胎，暴露處理144 h，至所有胚胎全部孵出。

1.3 P4毒性暴露實驗設計

一部分培養(yǎng)皿暴露于濃度為10 ng·L-1、100 ng·L-1、1 000 ng·L-1、10 000 ng·L-1的 P4、0.001%乙醇和曝氣自來水（空白對照組）中處理144 h，倒置顯微鏡下觀察胚胎的發(fā)育狀況，記錄死亡數(shù)、孵出數(shù)和畸形數(shù)，并選擇異常個體進行拍照；另一部分培養(yǎng)皿暴露于濃度為5 ng·L-1、50 ng·L-1和100 ng·L-1的P4和曝氣自來水（空白對照組）中處理144 h（乙醇溶劑終濃度低于1‰，且空白對照組和乙醇溶劑組結(jié)果不存在顯著差異，因此僅保留空白對照組），同時在暴露24 h、48 h、72 h、96 h、120 h和 144 h時從每組隨機挑選20～30個胚胎，保存于液氮中。以上所有實驗均設置3個重復。每隔24 h更換暴露溶液，在整個實驗過程中，所有胚胎均維持在（26±1） ℃的溫度下，并進行光照∶黑暗（14 h∶10 h）循環(huán)。

1.4 基因轉(zhuǎn)錄水平分析

使用 Total RNA extraction reagent（TaKaRa）對鯽魚胚胎進行總RNA提取，瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測RNA的完整性和純度，使用Prime Script逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa）進行cDNA合成。利用Primer Premier 5和Oligo 7對本實驗中所要研究的基因進行特異性引物設計，在LightCycler?96實時熒光定量PCR儀中進行qRT-PCR。25 μL反應體系包括：12.5 μL 2×TransStart?Top/Tip Green qPCR SuperMix，上、下游引物（表 1）各 0.5 μL，1 μL cDNA 和10.5 μL ddH2O，反應程序為：94 ℃30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s（45×）；94 ℃ 10 s，65 ℃60 s，97 ℃ 1 s；37 ℃ 30 s。選取了晝夜節(jié)律相關的6 個基因Clock1、Cry1、Cry2、Arntl1、Per2、Nr1d1，HPG軸相關基因Gnrh2、Gnrh3、Fshβ、Lhβ和類固醇生成相關基因Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β、Hsd20β，檢測其轉(zhuǎn)錄表達水平。選40S rRNA為管家基因，實驗重復3次。使用LightCycler?96 SW1.1分析數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt計算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以xˉ±SD表示，并用SPSS 16.0進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。統(tǒng)計學顯著性差異水平設置為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 P4暴露對鯽魚胚胎形態(tài)發(fā)育的影響

胚胎毒性實驗顯示，P4對鯽魚早期胚胎形態(tài)發(fā)育沒有明顯的致死、致畸效應（圖1）。在整個暴露過程中，空白對照組、0.001%乙醇對照組和4個濃度P4暴露組中的鯽魚胚胎在144 h后全部孵出，存活率分別為82.61%、78.41%、81.08%、75.63%、80.33%和82.80%，沒有顯著差異；畸形率分別為4.10%、3.70%、5.20%、3.90%、4.67%和5.07%。

圖1 P4對鯽魚早期胚胎形態(tài)發(fā)育的影響Fig. 1 Effects of P4 on morphological development in early embryos of Carassius auratus

2.2 P4對鯽魚早期胚胎發(fā)育過程中晝夜節(jié)律相關基因表達的影響

與空白對照組相比，5 ng·L-1或更高濃度的P4暴露組中，從24 h到144 h，Clock1和Arntl1基因的表達水平整體呈先升高后降低再升高的趨勢（圖2：A、B）；Cry1基因的表達水平在48 h和96 h上調(diào)（圖2：C）；Cry2和Nr1d1基因的表達水平在24 h、120 h和144 h顯著上調(diào)，而在72 h和96 h被抑制（圖2：D、E）；Per2基因的表達水平在24～96 h被抑制，但120 h后又上調(diào)（圖2：F）。

圖2 P4對鯽魚胚胎發(fā)育過程中晝夜節(jié)律相關基因表達水平的影響Fig. 2 Effects of P4 on the expression levels of circadian rhythm related genes during the embryonic development of Carassius auratus

2.3 P4對鯽魚早期胚胎發(fā)育過程中HPG軸相關基因表達的影響

與空白對照組相比，P4暴露組中Gnrh2基因的表達水平在96 h顯著降低；而5 ng·L-1P4暴露24 h、48 h和120 h， 50 ng·L-1P4暴露24 h、72 h、120 h和144 h以及100 ng·L-1P4暴露144 h后，Gnrh2基因的表達水平均顯著升高（圖3：A）。P4暴露組中，Gnrh3基因的表達水平在96 h受到了顯著誘導，而在120 h和144 h被顯著抑制（圖3：B）。P4暴露組在 72 h 以及 100 ng·L-1P4處理144 h時，F(xiàn)shβ基因的表達水平顯著提高，而在其他大多數(shù)時間點被顯著抑制（圖3：C）。此外，與空白對照組相比，5 ng·L-1P4暴露處理24 h、120 h，50 ng·L-1P4暴露處理120 h以及100 ng·L-1P4暴露處理144 h后，Lhβ基因的表達水平顯著上調(diào)（圖3：D）。

圖3 P4對鯽魚胚胎發(fā)育過程中下丘腦和垂體激素相關基因表達水平的影響Fig. 3 Effects of P4 on the expression levels of hypothalamus and pituitary hormone-related genes during the embryonic development of Carassius auratus

與空白對照組相比，5 ng·L-1或更高濃度的P4處理72 h以及100 ng·L-1P4處理120 h顯著抑制Cyp11a基因的表達；而在24 h、48 h和96 h，Cyp11a基因的表達水平顯著提高（圖4：A）。在24 h和144 h，不同濃度P4暴露顯著提高Cyp19a基因的表達；而在72 h則被顯著抑制（圖4：B）。Hsd3β基因經(jīng)50 ng·L-1和100 ng·L-1P4暴露處理24 h、100 ng·L-1P4暴露48 h以及5 ng·L-1P4暴露144 h，表達水平顯著提高；而在72～120 h則顯著降低（圖4：C）。不同濃度P4暴露24 h和96 h后，Hsd20β基因的表達水平顯著降低；而在72 h，Hsd20β基因的表達水平顯著提高（圖4：D）。

圖4 P4對鯽魚胚胎發(fā)育過程中與類固醇激素相關基因表達水平的影響Fig. 4 Effects of P4 on the expression levels of steroid hormone related genes during the embryonic development of Carassius auratus

3 討論

胚胎毒性實驗表明，P4濃度梯度對鯽魚早期胚胎形態(tài)發(fā)育沒有明顯的急性毒性。梁燕秋（2016）發(fā)現(xiàn)，暴露于10～10 000 ng·L-1P4的斑馬魚胚胎未出現(xiàn)死亡、畸形的情況，與本研究結(jié)果一致。胚胎是魚類發(fā)育最敏感、最脆弱、最關鍵的階段，胚胎的正常發(fā)育是魚體生長和繁殖的基本保障，因此，本文進一步研究了較低濃度P4對鯽魚胚胎的內(nèi)分泌干擾效應。

晝夜節(jié)律是生物體為了適應地球自轉(zhuǎn)引起的以24 h為周期的行為、代謝、免疫等方面節(jié)律性變化，它由多個正、負調(diào)節(jié)因子組成的自我維持的反饋回路組成。Clocks、Arntls、Pers、Crys、Nr1ds構成了晝夜節(jié)律調(diào)控網(wǎng)絡的核心。轉(zhuǎn)錄因子Clocks和Arntls是這些反饋回路的正向組件，可以激活核心晝夜節(jié)律基因——周期（Pers）和隱花色素（Crys）的轉(zhuǎn)錄，而Per和Cry又可以與Clock/Arntl1異二聚體相互作用，抑制異二聚體的活性。此外，Clocks/Arntls異二聚體還激活核受體基因Nr1ds的轉(zhuǎn)錄（Albrecht & Eichele，2003）。Nr1d1的表達可抑制Arntl1、Pers和Crys轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。Zhao等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，孕激素能改變斑馬魚中晝夜節(jié)律及其下游信號通路的基因表達水平。Xia等（2019）發(fā)現(xiàn)，孕酮能影響黃河鯉Cyprinus carpiovar.幼魚中晝夜節(jié)律相關基因表達，進而導致內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂。本研究中P4暴露影響了晝夜節(jié)律信號通路相關基因（Clock1、Cry1、Cry2、Arntl1、Per2、Nr1d1）的表達，這與Zhao和Fent（2016）在斑馬魚中的研究結(jié)果類似。

晝夜節(jié)律可以驅(qū)動各種關鍵細胞和生理過程的日常振蕩，如細胞周期及其調(diào)節(jié)、激素分泌、甚至繁殖等（Bedrosianet al.，2016；Zhaoet al.，2018；Zhenget al.，2018），且Zhao和Fent（2016）研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律能夠調(diào)節(jié)HPG軸的活動。HPG軸參與調(diào)節(jié)一系列生殖活動，促進和控制生殖細胞的起源、性別分化、性腺的發(fā)育和成熟。促性腺激素釋放激素（GnRH）在HPG軸中起關鍵作用。在HPG軸的cAMP級聯(lián)反應中，GnRH與垂體前葉促性腺激素細胞表面的跨膜受體結(jié)合，觸發(fā)級聯(lián)反應來調(diào)控Lhβ和Fshβ表達（Guoet al.，2003；Pawson ＆ Mcneilly，2005）。黃體生成素（LH）和卵泡生成素（FSH）控制性腺中的類固醇生成和配子發(fā)生，因此GnRH介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)對生殖的控制。這個過程中任何一個基因表達量的改變都可能會導致整個HPG軸的紊亂，進而影響機體的正常生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，P4處理后，Gnrh2、Gnrh3的表達水平與Fshβ、Lhβ的相一致。推測Gnrh2和Gnrh3的顯著上調(diào)可能增強了Lhβ和Fshβ的表達，從而提高FSH和LH的激素水平，并進一步調(diào)節(jié)類固醇生成基因（Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β、Hsd20β）的表達。

Cyp11a具有側(cè)鏈裂解活性，能催化膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮（Guoet al.，2003），在Hsd3β的催化作用下，孕烯醇酮或脫氫表雄酮能生成有活性的孕酮和雄烯二酮（Kruschet al.，1979）。Cyp19a在體內(nèi)可催化雄烯二酮向雌二醇轉(zhuǎn)化，因而又稱雌激素合成酶。Walsh等（2000）研究發(fā)現(xiàn)LH主要通過激活Hsd20β和促進17α，20β-二羥化酮受體的轉(zhuǎn)運來促進精子和卵子的發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，3個不同濃度P4組處理72 h后，F(xiàn)shβ的表達水平顯著上調(diào)；Cyp11a在5 ng·L-1P4處理96 h和120 h以及50 ng·L-1P4 處理 120 h 顯著上調(diào)；5 ng·L-1P4暴露144 h后，Cyp19a和Hsd3β的表達水平上調(diào)。這表明激活的FSH促進了Cyp11a、Hsd3β和Cyp19a的表達。Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β和Hsd20β是控制類固醇生成的關鍵基因，這些基因的表達改變可降低或提高類固醇激素的合成效率。實驗室前期對暴露結(jié)束后相同P4濃度處理條件下生長至6個月的鯽魚的性別比進行了統(tǒng)計分析，與對照組相比，高濃度P4暴露組誘導更多雌魚產(chǎn)生。性腺組織學分析發(fā)現(xiàn)，在暴露于 50 ng·L-1和100 ng·L-1的鯽魚精巢中觀察到了卵母細胞的存在（Wanget al.，2020）。這些結(jié)果說明P4可能通過干擾類固醇合成途徑來影響鯽魚的胚胎發(fā)育，進一步影響鯽魚幼魚和成魚的性腺發(fā)育和性別比例。

4 結(jié)論

在胚胎發(fā)育階段，P4對鯽魚胚胎形態(tài)發(fā)育無急性毒性，環(huán)境相關濃度的P4可導致晝夜節(jié)律和HPG軸相關基因表達紊亂，從而導致細胞和生理代謝的紊亂，進而影響鯽魚幼魚的性腺分化和性比。本實驗闡明了孕激素物質(zhì)對水生生物的生態(tài)毒理學效應以及所引起的一系列風險，為準確評估P4對水生生物的生態(tài)風險提供參考價值。