呂洪錦，張 倩，黃紹艷，張建中△

(1.龍口市人民醫(yī)院麻醉科，山東 煙臺(tái) 265700；2.濱州醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000；3.煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院麻醉科，山東 煙臺(tái) 264000)

創(chuàng)傷后機(jī)體存在不同程度的炎性反應(yīng)，引起白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細(xì)胞因子釋放[1]。創(chuàng)傷性炎癥介質(zhì)能使毛細(xì)血管通透性增加、大量蛋白質(zhì)滲出造成水腫，也能使血管內(nèi)中性粒細(xì)胞變形和黏附能力增強(qiáng)，使其更易游走至間質(zhì)并釋放炎癥介質(zhì)，在組織中形成“瀑布式”的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)而加重機(jī)體損傷[2]。微小RNA(miRNA)在機(jī)體炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答中具有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。miR-146a是首先被證實(shí)在免疫系統(tǒng)中具有負(fù)向調(diào)控免疫炎性反應(yīng)的miRNA[4]，被認(rèn)為是固有免疫及適應(yīng)性免疫細(xì)胞分化的重要調(diào)控者。miR-146a主要通過(guò)其靶基因IL-1受體相關(guān)激酶 1(IRAK1)和TNF受體相關(guān)因子 6(TRAF6)在協(xié)調(diào)免疫和炎癥信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用[5]。活化的 IRAK1、TRAF6可引起Toll樣受體-4(TLR4)及核因子-κB(NF-κB)過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1、IL-6的釋放，miR-146a的抗炎作用在一定程度上通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用[6]。

羥乙基淀粉(HES)130/0.4是第3代HES，可降低 IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子而減少創(chuàng)傷患者的炎性反應(yīng)[7]；注射HES可降低急性肺損傷大鼠體內(nèi)TLR4/NF-κB表達(dá)水平[8]，從而減輕炎性反應(yīng)，具有抗炎作用，但其作用機(jī)制尚不明確。因而建立創(chuàng)傷家兔模型，模擬創(chuàng)傷患者損傷及手術(shù)治療過(guò)程，探討HES對(duì)創(chuàng)傷性家兔炎癥介質(zhì)及miR-146a/TLR4/NF-κB的影響，明確HES減輕創(chuàng)傷性炎性反應(yīng)作用機(jī)制具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 2022年4月選取新西蘭雄性家兔(購(gòu)自山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，貨號(hào)37009214625)16只作為研究對(duì)象，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為乳酸鈉林格(LR)組和HES組，每組8只。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備 將家兔麻醉后用鈍器敲打家兔后肢造成后肢骨折，然后行骨折切開(kāi)內(nèi)固定術(shù)。麻醉方法：5%異戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射，異戊巴比妥鈉2～5 mg/(kg·h)靜脈維持。常規(guī)備皮、聚維酮碘消毒，鋪無(wú)菌巾。骨折部位外側(cè)切口，顯露股骨骨折部位，術(shù)中將骨膜縱行切開(kāi)，以保留骨膜完整性，胯骨折線置入合適的國(guó)產(chǎn)四孔鋼板，遠(yuǎn)近端各2枚螺釘固定，在骨折對(duì)應(yīng)肌肉組織2 cm×2 cm作為軟組織缺損模型，同時(shí)，取血液和少量肌肉組織備檢(T0)?？p合肌肉和皮膚，飼養(yǎng)在清潔環(huán)境中。LR組注射10 mL/kg LR，HES組注射10 mL/kg HES，每天1次，輸注5 d，完成后麻醉取2組家兔血液和損傷部位肌肉備檢(T1)。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定血液TNF-α、IL-1、IL-6水平 T0、T1時(shí)經(jīng)耳緣靜脈采集2組家兔血液，離心后吸取上清液，-70 ℃冰箱保存待檢。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；酶標(biāo)儀吸收450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)A值。各孔得到的A值減去空白組A值為各孔實(shí)際A值，用于反映血清IL-1、IL-6、TNF-α水平。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定肌肉組織NF-κB P65、TLR4、IRAK1、TRAF6蛋白水平 將損傷肌肉組織研磨后放入蛋白裂解液進(jìn)行裂解，2 h后取混合液離心后收集上清液加入蛋白上樣緩沖液，根據(jù)二辛可酸法蛋白定量結(jié)果上樣，通過(guò)凝膠電泳凝膠分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，加入針對(duì)NF-κB P65(貨號(hào)ab76302，英國(guó)Abcam公司)、TLR4(貨號(hào)ab13556，英國(guó)Abcam公司)、IRAK1(貨號(hào)ab18256，英國(guó)Abcam公司)、TRAF6(貨號(hào)ab76302，英國(guó)Abcam公司)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，采用Western洗滌緩沖液洗后加入二抗，采用微型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，應(yīng)用ImageJ軟件分析條帶密度，計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)肌肉組織miR-146a水平 將2組家兔T0、T1時(shí)肌肉組織研磨成細(xì)粉后加入環(huán)氧樹(shù)脂管中，加入裂解/結(jié)合緩沖液、無(wú)水乙醇、氯仿等攪拌混勻，將混合液分次加入一個(gè)吸附柱RNase-free吸附套管中，經(jīng)多次離心取出吸附柱RNase-free吸附套管，提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將純化的 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量-PCR擴(kuò)增，最終按熒光定量-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)在熒光定量-PCR儀器中操作，以U6作為內(nèi)參。引物序列：miR-146a，正向：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，反向：5′-GGGTGAGA ACTGAATTCCA-3′。U6，正向：5′-GCTTCGGC AGCACATATACTAAAAT-3′，反向：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′ 。

2 結(jié) 果

2.12組家兔不同時(shí)間點(diǎn)炎性細(xì)胞因子水平比較 與T0時(shí)比較，2組家兔T1時(shí)血液TNF-α、IL-1、IL-6水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LR組比較，HES組家兔T1時(shí)血液TNF-α、IL-1、IL-6均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組家兔不同時(shí)間點(diǎn)炎性細(xì)胞因子水平比較

2.22組家兔不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB P65、TLR4、IRAK1、TRAF6蛋白水平比較 與T0時(shí)比較，2組家兔T1時(shí)TLR4、NF-κB P65、IRAK1、TRAF6蛋白水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LR組比較，HES組家兔T1時(shí)TLR4、NF-κB P65、IRAK1、TRAF6蛋白水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

表2 2組家兔不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB P65、TLR4、IRAK1、TRAF6蛋白水平比較

圖1 2組家兔不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB P65、TLR4、IRAK1、TRAF6蛋白水平比較

2.32組家兔不同時(shí)間點(diǎn)肌肉組織miR-146a表達(dá)水平比較 miR-146a在T0時(shí)數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)值1，與T0時(shí)比較，創(chuàng)傷后miR-146a在T1時(shí)相對(duì)數(shù)值：HES組為1.69±0.07，LR組為1.52±0.07；2組家兔在創(chuàng)傷后miR-146a表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HES組家兔T1時(shí)miR-146a表達(dá)水平明顯高于LR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

續(xù)表2 2組家兔不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB P65、TLR4、IRAK1、TRAF6蛋白水平比較

圖2 2組家兔不同時(shí)間點(diǎn)肌肉組織miR-146a表達(dá)水平比較

3 討 論

HES 130/0.4是第3代HES，相對(duì)分子質(zhì)量為130×103，相對(duì)分子質(zhì)量降低且更加集中，對(duì)凝血及肝、腎功能的影響更小[7]。HES的使用爭(zhēng)論焦點(diǎn)主要在于腎功能損害，有研究表明，中等劑量HES[(10.3±4.7)mL/kg]在合適人群中使用不會(huì)增加腎損傷的風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)將其廣泛用于創(chuàng)傷或臨床有失血癥狀的手術(shù)患者[9]。創(chuàng)傷刺激能引起機(jī)體免疫系統(tǒng)細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)，炎性反應(yīng)的輕重取決于促炎性細(xì)胞因子水平，其中主要促炎性細(xì)胞因子有IL-1、IL-6、TNF-α等[2]。促炎性細(xì)胞因子可激發(fā)NF-κB的表達(dá)，而NF-κB反過(guò)來(lái)可提高IL-6、TNF-α水平，形成一個(gè)表達(dá)的正反饋。有研究發(fā)現(xiàn)，HES可通過(guò)影響TNF-α、IL-6、IL-10等炎癥因子的促炎及抗炎反應(yīng)平衡而誘導(dǎo)大鼠淋巴細(xì)胞的增殖與分化，HES還可抑制巨噬細(xì)胞蛋白增加[10]，并且早期應(yīng)用HES更加有利于抑制炎性反應(yīng)[11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，HES可通過(guò)抑制NF-κB途徑降低炎性反應(yīng)，從而降低毛細(xì)血管滲漏[12]。創(chuàng)傷和手術(shù)刺激主要通過(guò)啟動(dòng)炎性反應(yīng)及促進(jìn)釋放大量細(xì)胞因子，進(jìn)而引發(fā)全身應(yīng)激反應(yīng)。本研究使用創(chuàng)傷家兔模擬創(chuàng)傷患者損傷及手術(shù)治療過(guò)程，因損傷部位的炎性反應(yīng)最明顯，所以，取損傷部位肌肉作為不同治療組進(jìn)行對(duì)照研究，結(jié)果顯示，與LR組比較，HES組家兔T1時(shí)TNF-α、IL-1、IL-6水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明使用HES可降低創(chuàng)傷性炎性細(xì)胞因子水平。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其在免疫功能的調(diào)節(jié)、免疫細(xì)胞生長(zhǎng)與分化和自身免疫的預(yù)防中均具有重要作用，主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，最終影響信號(hào)通路下游蛋白分子的表達(dá)而發(fā)揮作用，且絕大多數(shù) miRNA 對(duì)基因表達(dá)的作用是抑制性的，具有負(fù)反饋?zhàn)饔肹3，13]。miR-146a是在免疫系統(tǒng)中具有重要調(diào)節(jié)作用的miRNA，尤其是在免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)方面的調(diào)節(jié)作用[4]。IRAK1在各種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，主要作用是作為一種受體蛋白激酶參與了TLR等信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)炎性反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。TRAF6是一種重要的細(xì)胞內(nèi)多功能信號(hào)分子，具有獨(dú)特的受體結(jié)合特異性。IRAK1、TRAF6作為miR-146a公認(rèn)的靶基因，是全身炎癥及免疫應(yīng)答的有效調(diào)節(jié)因子，miR-146a通常通過(guò)其發(fā)揮作用[5，14]。TLR4是一種膜結(jié)合蛋白，激活的TLR4可募集下游細(xì)胞內(nèi)髓樣分化因子88(MyD88)蛋白，MyD88通過(guò)miR-146a的IRAK1、TRAF6形成 MyD88-IRAKs-TRAF6 復(fù)合體參與信號(hào)傳導(dǎo)，最終作用于下游 NF-κB 通路，調(diào)節(jié)炎癥因子釋放[15]。TAGANOV等[16]發(fā)現(xiàn)，脂多糖刺激細(xì)胞可使NF-κB依賴的miR-146a表達(dá)水平升高，并已通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)和突變?cè)囼?yàn)證實(shí)。有研究在人工模擬炎癥疾病模型中使用miR-146a骨髓細(xì)胞定向遞送的方法，驗(yàn)證了miR-146a通過(guò)靶向NF-κB信號(hào)通路抑制炎性反應(yīng)[17]。當(dāng)miR-146a表達(dá)水平升高時(shí)，IRAK1、TRAF6表達(dá)水平均下調(diào)，因此，認(rèn)為miR-146a調(diào)控TLR/NF-κB信號(hào)通路應(yīng)答炎性反應(yīng)是以負(fù)反饋方式發(fā)揮作用的[18-19]。本研究結(jié)果顯示，2組家兔TLR4、NF-κB P65、IRAK1、TRAF6蛋白水平在創(chuàng)傷后均明顯升高，HES組家兔T1時(shí)TLR4、NF-κB P65、IRAK1、TRAF6蛋白水平均明顯低于LR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明HES能抑制TLR4/NF-κB表達(dá)，從而減輕創(chuàng)傷性炎性反應(yīng)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，2組家兔創(chuàng)傷后miR-146a表達(dá)水平均明顯升高，而HES組家兔創(chuàng)傷后miR-146a表達(dá)水平更高。表明HES可能通過(guò)上調(diào)miR-146a表達(dá)抑制IRAK1、TRAF6的產(chǎn)生，使TLR4/NF-κB活化減少而抑制炎性反應(yīng)。

綜上所述，HES可減輕創(chuàng)傷性家兔的炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能是HES通過(guò)調(diào)控miR-146a負(fù)反饋調(diào)節(jié)TLR4 信號(hào)通路的 IRAK1、TRAF6，降低NF-κB蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減少信號(hào)通路下游促炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1、TNF-α的表達(dá)。然而，本研究未添加通路抑制劑進(jìn)行反向驗(yàn)證，今后將進(jìn)一步完善分組設(shè)置進(jìn)行研究。