彭曉燕 ， 陸盼盼 ， 胡祖權(quán)

貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴州省免疫細(xì)胞與抗體工程研究中心，貴陽 550025

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）簡稱新型冠狀病毒，能夠引起嚴(yán)重的急性呼吸道疾病，具有極強(qiáng)的傳染性。該病毒在世界范圍內(nèi)流行并不斷出現(xiàn)新的變異毒株，給全球公共衛(wèi)生安全帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)和威脅，免疫學(xué)診斷和治療是目前研究的重點(diǎn)領(lǐng)域［1-2］。

新型冠狀病毒由囊膜和核衣殼組成，囊膜上主要有表面刺突蛋白（spike protein， S）、膜蛋白（membrane protein， M）和包膜蛋白（envelope protein， E）等3種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)［3］，其中S蛋白與其傳染能力及致病機(jī)制密切相關(guān)。在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程中，S蛋白會(huì)被宿主細(xì)胞的蛋白酶切割為S1亞基和S2亞基，分別負(fù)責(zé)受體識(shí)別和膜融合［4］。S1亞基又分為N末端結(jié)構(gòu)域（N terminal domain， NTD）和C末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain， CTD），蛋白晶體結(jié)構(gòu)顯示新型冠狀病毒的CTD為 受 體 結(jié) 合 域（receptor binding domain，RBD），主要負(fù)責(zé)識(shí)別細(xì)胞表面特異性受體——血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ（angiotensin converting enzymeⅡ， ACE2），從而介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的相互作用［4-6］。因此，阻斷RBD與ACE2的結(jié)合能夠阻止新型冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以RBD為靶標(biāo)的特異性抗體或小分子抑制劑是抗新型冠狀病毒藥物研發(fā)的有效策略之一［3，7］。同時(shí)，免疫學(xué)診斷具有操作簡單、特異性高、重復(fù)性好和高效低廉等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為臨床上最普遍的檢測手段之一［8-10］，優(yōu)化基于抗RBD抗體的免疫診斷方法對(duì)于新型冠狀病毒的快速初篩和日常監(jiān)測具有重要意義。

本研究通過基因克隆操作構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，在大腸桿菌中大量表達(dá)含有不同標(biāo)簽蛋白的RBD重組蛋白，并驗(yàn)證其可溶性和免疫原性，以期為通過抗體庫技術(shù)分離抗RBD重組抗體及進(jìn)一步發(fā)展新型冠狀病毒的免疫診療方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌XL1-Blue、pGEX-6P-1和pET-32a（+）載體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，含RBD基因的pET-32-RBD質(zhì)粒由中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所蘇州研究院饋贈(zèng)。6～8周齡Balb/c小鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK（黔）2018-0001）提供，室溫20～25 ℃，光照黑暗周期為12 h，分籠標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由采食飼料和水。

1.2 儀器與試劑

酶標(biāo)儀購自BioTech公司；冷凍高速離心機(jī)購自丹麥LaboGene公司；超聲波破碎儀購自寧波新芝生物科技有限公司；恒溫?fù)u床購自蘇州捷美電子有限公司；垂直電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；轉(zhuǎn)印儀、水平和垂直電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；PCR儀購自美國ABI公司；純水儀購自英國ELGA公司；Syngene成像系統(tǒng)購自基因有限公司；Tryptone和Yeast extract購自英國OXOID公司；脫脂奶粉購自武漢博士德生物工程有限公司；對(duì)硝基苯磷酸二鈉購自上海Sigma-Aldrich公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司；親和層析柱和Ni-NTA基質(zhì)購自德國Qiagen公司；GST純化基質(zhì)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；工具酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；AP標(biāo)記和HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體購自上海默克公司；ECL發(fā)光液購自大連博格林生物科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建

培養(yǎng)含pET-32-RBD質(zhì)粒的重組大腸桿菌，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，通過PCR擴(kuò)增目的基因，采用EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切RBD片段、pDEX-6P-1載體和pET-32a（+）載體，制備1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。隨后，利用T4 DNA連接酶連接目的基因和載體，構(gòu)建重組載體pGEX-RBD和pET-RBD。電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB固體培養(yǎng)基（含100 μg·mL-1氨芐）平板，37 ℃過夜培養(yǎng)12～16 h至長出單克隆菌落。挑取菌落培養(yǎng)，利用基因特異引物進(jìn)行PCR鑒定，并送公司用載體特異引物測序驗(yàn)證。

1.4 RBD蛋白的原核表達(dá)及純化

取測序正確的pGEX-RBD和pET-RBD重組質(zhì)粒菌液分別接種于含100 μg·mL-1氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～16 h。將培養(yǎng)菌液按1∶100接種于新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，置16 ℃、200 r·min-1恒溫?fù)u床誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h，離心收集菌體。PBS懸浮菌體，超聲波破碎處理后收集上清液，利用GST純化柱純化GST-RBD融合蛋白，以及Ni-NTA基質(zhì)純化RBD-His融合蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白的表達(dá)情況。

1.5 多克隆抗體的制備

用GST-RBD融合蛋白作為免疫抗原，取3只6周齡Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，共進(jìn)行4次免疫，每次免疫間隔時(shí)間為10 d，抗原劑量為每只小鼠25 μg。初次免疫用等量弗氏完全佐劑乳化，第2次和第3次免疫用等量弗氏不完全佐劑乳化，第4次免疫用等量生理鹽水混合。完成4次免疫后7 d取小鼠靜脈血制備抗血清。

1.6 間接ELISA法測定抗血清滴度

用PBS稀釋RBD-His融合蛋白至1 μg·mL-1，取100 μL加入96孔酶標(biāo)板，并設(shè)置PBS空白對(duì)照，于37 ℃包被2 h，用200 μL PBS洗滌3次。加入150 μL封閉液，37 ℃水浴2 h，用200 μL PBS洗滌3次。將待測抗血清以100、200、400、800、1 600、3 200倍比梯度稀釋，每孔加入100 μL，于37℃孵育1 h后，用200 μL PBST和PBS分別洗滌3次。加入100 μL按1∶5 000稀釋的AP標(biāo)記羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，用200 μL PBST和PBS分別洗滌3次。加入100 μL 0.2% pNPP顯色液，黑暗條件下反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀測OD450讀值。

1.7 Western blot分析

取20 μL RBD-His融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。將膜裁剪后用封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST溶液）封閉2 h，再分別用1∶2 000稀釋的抗血清于37 ℃孵育1.5 h。用TBST洗滌3次，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體，37 ℃孵育1 h。TBST和TBS分別洗滌5次后，加入ECL發(fā)光液，SynGene成像系統(tǒng)曝光顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)RBD基因序列設(shè)計(jì)特異引物，PCR擴(kuò)增目的基因，凝膠電泳檢測結(jié)果（圖1）顯示，獲得的RBD基因片段大小約為700 bp，與預(yù)期大小相一致。利用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切目的基因以及載體pGEX-6P-1和pET-32a（+），通過酶連接獲得pGEX-RBD和pET-RBD重組載體。

圖1 PCR擴(kuò)增RBD基因片段Fig. 1 PCR amplification of RBD gene fragment

2.2 陽性轉(zhuǎn)化子鑒定

重組載體通過電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆菌落培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示均擴(kuò)增出大小約為750 bp的基因片段（圖2），與預(yù)期大小相符。然后，利用載體特異性引物測序，比對(duì)結(jié)果顯示，目的基因與RBD基因（GenBank登錄號(hào)：BC032538.1）的序列相同，表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子Fig. 2 PCR identification of the positive transformants

2.3 重組蛋白原核表達(dá)及純化

重組菌株XL1-Blue/pGEX-RBD和XL1-Blue/pET-RBD的菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及超聲波破碎處理后，取上清液分別用GST和His基質(zhì)純化GST-RBD和RBD-His融合蛋白。SDS-PAGE結(jié)果（圖3）顯示，GST-RBD融合蛋白大小約為53 kD，RBD-His融合蛋白大小約為33 kD，與預(yù)期結(jié)果相符合，表明原核表達(dá)獲得了可溶性的GST-RBD和RBD-His融合蛋白。

圖3 SDS-PAGE檢測純化的融合蛋白Fig. 3 SDS-PAGE detection of the purified fusion proteins

2.4 多克隆抗體效價(jià)分析

用GST-RBD融合蛋白作為免疫抗原免疫3只Balb/c小鼠，用RBD-His融合蛋白作為檢測抗原分析多克隆抗體的效價(jià)。ELISA檢測結(jié)果（圖4）顯示，3只小鼠均產(chǎn)生了多克隆抗體，效價(jià)達(dá)到約1∶3 000，其中1號(hào)和3號(hào)小鼠產(chǎn)生了較高親和力的多克隆抗體。

圖4 ELISA檢測多克隆抗體的效價(jià)Fig. 4 ELISA detection of the titers of polyclonal antibodies

2.4 多克隆抗體特異性分析

將RBD-His融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，再分別用不同免疫小鼠產(chǎn)生的多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果（圖5）顯示，3只免疫小鼠產(chǎn)生的多克隆抗體均出現(xiàn)蛋白雜交條帶，而對(duì)照組無條帶出現(xiàn)，表明獲得的多克隆抗體可特異性識(shí)別RBD蛋白。

圖5 Western blot檢測多克隆抗體特異性Fig. 5 Western blot detection of the specificities of polyclonal antibodies

3 討論

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情給全球公共衛(wèi)生安全和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展帶來了嚴(yán)重威脅。目前，在廣泛推行疫苗接種和核酸檢測基礎(chǔ)上，眾多科學(xué)家正在竭力研發(fā)更有效的防治手段和診療方法。目前的檢測方法主要包括核酸檢測、抗原檢測和抗體檢測［8-9］，前2種方法主要是針對(duì)病毒本身的檢測，在感染初期即可有效篩查，而抗體檢測則是檢測機(jī)體針對(duì)病毒免疫應(yīng)答產(chǎn)生的IgM或IgG抗體。核酸檢測靈敏度高、特異性好，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室、設(shè)備和人員的要求較高，而且操作繁鎖；抗原檢測操作簡便、快捷，但靈敏度稍差，僅能作為核酸檢測的補(bǔ)充；抗體檢測可評(píng)價(jià)抗體藥物和疫苗的臨床效果，但不適用于感染初期的檢測，而且存在一定的誤判率［8-10］。因此，核酸檢測是確診的標(biāo)準(zhǔn)方法，但發(fā)展免疫學(xué)檢測方法仍具有良好的應(yīng)用價(jià)值，其便捷高效性使其在大規(guī)模篩查時(shí)可作為快速初篩工具或家庭日常自測方法。

基于免疫學(xué)的新冠預(yù)防和治療是眾多科研團(tuán)隊(duì)的另一個(gè)研究重點(diǎn)［11-13］。目前在全世界普及的新冠疫苗主要包括病毒滅活疫苗、腺病毒載體疫苗和重組蛋白疫苗，接種疫苗對(duì)于病毒的防治效果起到非常重要的作用［13-14］。國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》將2種特異性抗新型冠狀病毒藥物增加到診療方案中，包括美國輝瑞公司生產(chǎn)的PF-07321332/利托那韋片（paxlovid）以及我國首個(gè)自主研發(fā)的單克隆抗體藥物（安巴韋單抗/羅米司韋單抗注射液）。安巴韋單抗的靶標(biāo)是S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域，能夠促進(jìn)S1亞基快速從新型冠狀病毒上脫落，阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［15-17］。因此，RBD被認(rèn)為是抗體中和治療和疫苗開發(fā)的理想靶標(biāo)。

本研究以新型冠狀病毒S蛋白的RBD結(jié)構(gòu)域?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，分別構(gòu)建了含有GST和His標(biāo)簽的重組蛋白表達(dá)載體，原核表達(dá)獲得大量可溶性的GST-RBD和RBD-His融合蛋白，并通過動(dòng)物免疫和抗血清滴度檢測證實(shí)重組蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)。眾所周知，原核表達(dá)系統(tǒng)是最常用的蛋白表達(dá)體系，具有生產(chǎn)周期短、操作簡單、成本低廉等特點(diǎn)。但是，在原核生物中表達(dá)真核基因時(shí)，由于缺乏糖基化、乙酰化等蛋白翻譯后修飾功能，使表達(dá)的蛋白不能正確折疊而形成包涵體，通過變性和復(fù)性獲得大量可溶性的具有生物活性功能的蛋白質(zhì)仍是當(dāng)前研究的技術(shù)難點(diǎn)［18］?，F(xiàn)有研究表明基因自身的特性是決定蛋白表達(dá)情況的決定性因素，但通過優(yōu)化IPTG濃度、誘導(dǎo)表達(dá)的溫度和時(shí)間以及與標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)等策略可以顯著改善蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和活性［19-22］。本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化表達(dá)條件，成功在大腸桿菌中獲得了大量的GST-RBD和RBD-His融合蛋白。由于GSTRBD融合蛋白的分子量較大，以該蛋白作為免疫原能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，以RBDHis蛋白作為檢測抗原可以鑒別是否產(chǎn)生了針對(duì)RBD的多克隆抗體，可以有效地避免GST標(biāo)簽蛋白的干擾?？傊狙芯客ㄟ^原核表達(dá)體系獲得了RBD融合蛋白，并驗(yàn)證其具有良好的免疫原性，為后續(xù)制備抗RBD的基因工程抗體以及研發(fā)以RBD為靶標(biāo)的新冠診療方法提供了數(shù)據(jù)支撐。