楊書(shū)平，鄭 仲，劉相邑，豆曉婕，劉國(guó)紅，柴玉榮

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系 鄭州 450001

胸腺是人體重要的中樞免疫器官，負(fù)責(zé)培育和選擇成熟的初始T淋巴細(xì)胞[1]。以胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞(cortical thymus epithelial cell，cTEC)和髓質(zhì)上皮細(xì)胞(medullary thymus epithelial cell，mTEC)為主的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為T細(xì)胞的發(fā)育和成熟提供了必需的微環(huán)境。隨著年齡的增長(zhǎng)，胸腺出現(xiàn)生理性退化，其重量和體積明顯縮小，免疫功能減退，這種現(xiàn)象也稱胸腺增齡性萎縮[2]。胸腺上皮細(xì)胞(thymus epithelial cell，TEC)在胸腺生理性退化、免疫功能穩(wěn)態(tài)維持等方面發(fā)揮重要作用[3-4]。角質(zhì)蛋白5(keratin 5，K5)和角質(zhì)蛋白8(keratin 8，K8)用于標(biāo)記和定位TEC[5]；上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)是胸腺上皮祖細(xì)胞的重要標(biāo)志之一[6]；性別決定區(qū)Y框蛋白2(sex determining region Y-box2，Sox2)作為干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，可以標(biāo)記胸腺中的成體胸腺上皮干細(xì)胞[7]；自身免疫調(diào)節(jié)因子(autoimmune regulator，Aire)主要表達(dá)于成熟的mTEC中[8]；叉頭框蛋白N1(forkhead box protein N1，F(xiàn)oxN1)在TEC的成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。本研究通過(guò)分析不同發(fā)育階段小鼠TEC分子標(biāo)記及重要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和變化，探索小鼠發(fā)育過(guò)程中TEC的動(dòng)力學(xué)變化，為進(jìn)一步理解胸腺衰老以及提高機(jī)體免疫力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑2月齡、6月齡、12月齡雌性昆明小鼠各5只，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。兔抗K5和K8抗體購(gòu)自Abcam公司，羊抗Aire抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，兔抗Sox2抗體購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，兔抗FoxN1和EpCAM抗體購(gòu)自博奧賽斯生物科技有限公司。羊抗兔和兔抗羊二抗顯色試劑購(gòu)自中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 胸腺組織學(xué)分析采用頸椎脫臼法處死小鼠，取胸腺組織，PBS沖洗，置于含有40 g/L多聚甲醛4 ℃冰箱中過(guò)夜固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟處理后石蠟包埋，5 μm厚切片，HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

免疫組化染色：胸腺組織切片脫蠟和微波抗原修復(fù)，加一抗K5和K8(按1∶200稀釋)、Aire(按1∶300稀釋)、EpCAM(按1∶200稀釋)和Sox2(按1∶600稀釋)抗體4 ℃孵育過(guò)夜，滴加相應(yīng)羊抗兔和兔抗羊二抗(均按1∶100稀釋)，37 ℃孵育30 min，DAB顯色。光學(xué)顯微鏡下拍照、觀察，每張切片選取5個(gè)視野(×200)，利用Image J分析軟件統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的面積。

1.3 小鼠胸腺組織中FoxN1、EpCAM蛋白表達(dá)的免疫印跡檢測(cè)胸腺組織中加入RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑后進(jìn)行研磨，提取蛋白，4 ℃離心，取上清液，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉液封閉，分別加一抗FoxN1(按1∶1 000)、EpCAM(按1∶5 000稀釋)和β-actin(按1∶2 000稀釋)抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(按1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h，加ECL顯色劑曝光成像。利用Image J分析軟件檢測(cè)條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 小鼠胸腺組織中FoxN1、Aire mRNA的qRT-PCR檢測(cè)使用TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)試劑提取小鼠胸腺組織的總RNA。用NanoDrop 2000光譜儀(美國(guó)Thermo公司)在260/280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定總RNA濃度。每個(gè)樣品各取500 ng RNA，使用cDNA合成試劑盒(寶生物工程有限公司)合成cDNA。用ABI 7500 Fast real-time PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)推薦參數(shù)，應(yīng)用SYBR Green Ⅰ熒光染料進(jìn)行PCR，GAPDH為參照基因。FoxN1、Aire和GAPDH的引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

表1 FoxN1、Aire引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組小鼠胸腺組織中K5、K8、Aire、EpCAM、Sox2陽(yáng)性細(xì)胞面積的差異，F(xiàn)oxN1蛋白和mRNA表達(dá)的差異，EpCAM蛋白和Aire mRNA表達(dá)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育時(shí)期小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)的變化見(jiàn)圖1。由圖1可知：2月齡小鼠胸腺的皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)較為完整，邊界清晰；6月齡小鼠胸腺的皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸融合；12月齡小鼠胸腺的皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)較紊亂，皮髓質(zhì)交界處不清楚，皮質(zhì)變薄；表明胸腺的組織結(jié)構(gòu)完整性隨著月齡增長(zhǎng)逐漸喪失。

上排：低倍鏡(×100)；下排：高倍鏡(×200)

2.2 不同發(fā)育時(shí)期小鼠TEC的變化見(jiàn)圖2、表2。由圖2可知，K5、K8以及Aire陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi)有棕色顆粒。K5主要表達(dá)于mTEC中，且隨著小鼠月齡的增長(zhǎng)，K5陽(yáng)性的髓質(zhì)區(qū)域逐漸減少。K8主要表達(dá)于cTEC中，mTEC中也有少量表達(dá)。隨著月齡的增長(zhǎng)，K5和K8表達(dá)逐漸減少，表明TEC逐步喪失。Aire主要在成熟的mTEC中表達(dá)；2月齡小鼠Aire陽(yáng)性細(xì)胞面積最大，6月齡和12月齡小鼠Aire陽(yáng)性細(xì)胞面積減少。

圖2 各組小鼠胸腺組織中K5、K8和Aire的表達(dá)

表2 各組小鼠胸腺組織中 K5、K8、Aire陽(yáng)性細(xì)胞面積的比較(n=5)

2.3 不同發(fā)育時(shí)期小鼠胸腺上皮干細(xì)胞/祖細(xì)胞的變化見(jiàn)圖3和表3。2月齡小鼠胸腺中EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞最多，出現(xiàn)在皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處。6月齡和12月齡小鼠胸腺中EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞減少。2月齡小鼠胸腺中Sox2陽(yáng)性的細(xì)胞最多；隨著月齡的增長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少；12月齡小鼠胸腺的被膜下、皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處僅見(jiàn)少量Sox2陽(yáng)性細(xì)胞。

圖3 各組小鼠胸腺組織中EpCAM和Sox2的表達(dá)變化

表3 各組小鼠胸腺組織中 EpCAM、Sox2陽(yáng)性細(xì)胞面積的比較(n=5)

2.4 不同發(fā)育時(shí)期小鼠胸腺組織中FoxN1蛋白和mRNA表達(dá)的差異、EpCAM蛋白和Aire mRNA表達(dá)的變化見(jiàn)表4。由表4可知，2月齡小鼠胸腺中FoxN1蛋白、mRNA和EpCAM蛋白、Aire mRNA的表達(dá)量最多；且隨著月齡的增加，小鼠胸腺中上述指標(biāo)逐漸降低。

表4 各組小鼠胸腺組織中FoxN1蛋白和mRNA、EpCAM蛋白和Aire mRNA表達(dá)的比較(n=5)

3 討論

胸腺是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞及中樞免疫耐受的部位，對(duì)機(jī)體的免疫防御功能至關(guān)重要。然而，胸腺對(duì)外界刺激非常敏感，壓力、感染或化療會(huì)造成該器官急性傷害；隨著年齡增長(zhǎng)，胸腺組織結(jié)構(gòu)和功能也會(huì)逐漸發(fā)生衰退[10]，而且胸腺是機(jī)體最先衰老的器官。作為胸腺微環(huán)境主要成分的TEC，其數(shù)量減少、功能紊亂是引起胸腺退化的重要原因之一[11]。研究[12-14]表明，通過(guò)性激素剝奪、補(bǔ)充抗氧化劑等策略可以恢復(fù)胸腺的組織結(jié)構(gòu)，調(diào)整胸腺細(xì)胞的亞群比例。單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)表明，TEC存在異質(zhì)性；并推測(cè)成體胸腺中存在胸腺上皮祖細(xì)胞，其在組織的穩(wěn)態(tài)維持以及炎癥壓力等導(dǎo)致的胸腺萎縮恢復(fù)過(guò)程中起到重要作用[15-17]。2月、6月和12月齡小鼠大致對(duì)應(yīng)人類青春期、30歲和60歲[18]，代表胸腺的發(fā)育成熟、開(kāi)始退化、萎縮衰老的動(dòng)態(tài)過(guò)程。本研究探索TEC在不同發(fā)育階段小鼠中的動(dòng)力學(xué)變化，期望為深入理解胸腺衰老機(jī)制和免疫功能恢復(fù)提供理論依據(jù)。

K5和K8分別是胸腺中mTEC和cTEC的分子標(biāo)記，本研究結(jié)果顯示，隨著小鼠月齡的增長(zhǎng)，二者的表達(dá)衰減，表明mTEC和cTEC數(shù)量減少，導(dǎo)致與其相互作用的胸腺細(xì)胞不能正常發(fā)育，由此，胸腺的整體正常組織結(jié)構(gòu)逐漸被破壞。自身免疫調(diào)節(jié)因子Aire主要在胸腺mTEC中表達(dá)，在TEC的發(fā)育、胸腺細(xì)胞黏附、免疫耐受和腫瘤免疫中起重要作用，其表達(dá)發(fā)生改變往往導(dǎo)致多種自身免疫病的發(fā)生。Aire可影響mTEC的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)，進(jìn)而影響胸腺細(xì)胞的黏附[19]。Aire陽(yáng)性細(xì)胞表示mTEC的成熟階段，本研究結(jié)果顯示，隨著小鼠月齡的增長(zhǎng)，胸腺組織中Aire陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少，說(shuō)明成熟的mTEC呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與年齡相關(guān)的免疫能力衰退相一致。

EpCAM作為上皮細(xì)胞黏附分子，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、遷移、干性以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等[20]，并且是胸腺上皮祖細(xì)胞的重要標(biāo)志之一。干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2可在干細(xì)胞和祖細(xì)胞中表達(dá)，參與成體器官的穩(wěn)態(tài)維持[21]和腫瘤干細(xì)胞的干性維持[22]。本研究結(jié)果顯示，小鼠胸腺中EpCAM和Sox2陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在皮質(zhì)、皮髓質(zhì)交界區(qū)域，說(shuō)明該位置可能是胸腺成體干細(xì)胞儲(chǔ)備區(qū)。隨著小鼠月齡的增長(zhǎng)，EpCAM和Sox2的表達(dá)逐漸減少，表明胸腺中成體干細(xì)胞的儲(chǔ)備逐漸下降。這些祖細(xì)胞/成體干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的下降，也伴隨著Aire陽(yáng)性細(xì)胞的減少，推測(cè)可能是由于祖細(xì)胞的數(shù)目減少，導(dǎo)致了Aire陽(yáng)性mTEC的減少。

FoxN1是TEC發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在胸腺發(fā)育以及T細(xì)胞的分化、成熟等方面發(fā)揮重要作用，是維持胸腺功能和穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著小鼠月齡的增加，F(xiàn)oxN1在細(xì)胞中的表達(dá)逐漸降低，提示TEC逐漸衰老，與小鼠胸腺逐漸萎縮的表型相一致。FoxN1的表達(dá)降低與EpCAM和Aire的表達(dá)減少相同步，推測(cè)胸腺上皮干細(xì)胞/祖細(xì)胞的減少，導(dǎo)致成熟mTEC減少，使T細(xì)胞發(fā)育、成熟受阻，最終引發(fā)胸腺組織萎縮和器官衰老。這些轉(zhuǎn)錄因子共同作用以維持胸腺的正常發(fā)育與成熟，其表達(dá)下降，提示胸腺組織發(fā)生了動(dòng)力學(xué)改變。

綜上所述，隨著小鼠月齡的增長(zhǎng)，小鼠胸腺組織中FoxN1、Aire mRNA的表達(dá)逐漸減少，EpCAM和Sox2陽(yáng)性細(xì)胞減少，TEC動(dòng)力學(xué)發(fā)生顯著變化，這與年齡相關(guān)的免疫力低下和疾病的易感性相一致。增加成體胸腺上皮干細(xì)胞/祖細(xì)胞儲(chǔ)備的策略或?qū)樾叵俳M織再生、自身免疫性疾病的治療及一些腫瘤免疫提供新的視角。