吳 雷，張學振，王 力，劉 琪，李 建，張殿福，田大才

(1.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北省池塘養(yǎng)殖工程實驗室，武漢 430070；2.恩施州國硒冷水漁業(yè)開發(fā)有限公司，湖北恩施 445300；3.武漢中科瑞華生態(tài)科技股份有限公司，武漢 430077)

硒(selenium)長期被認為是一種對人和動物有毒的微量元素，直到SCHWARZ等[1]發(fā)現(xiàn)硒能夠緩解并抑制大鼠因維生素E缺乏所導致的肝壞死，硒的生物學意義、功能及作用才被人們正確地認識。常見的硒分為有機硒和無機硒兩種形式，不同化學形式的硒利用率明顯不同。眾多研究表明有機硒比無機硒具有更高的硒保留率、消化率以及更低的毒性[2、8]。硒對維持人和動物正常生理功能極其必要，適宜的硒水平能夠促進動物的生長發(fā)育、提升免疫和抗氧化能力[2]。而缺硒易導致大黃魚幼魚(Larimichthyscroceus)[3]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)幼魚[4]、石斑魚(Epinephelussp)[5]和白鱘(Acipensertransmontanus)幼魚[6]等魚類的生長速率降低、氧化壓力增加、免疫機能下降、機體代謝紊亂等。硒的有益劑量和毒性劑量之間范圍狹窄，超過臨界濃度會產(chǎn)生毒害作用[7-8]。因此，飼料中添加適宜水平的硒對于養(yǎng)殖魚類維持正常的生命活動至關重要。目前，針對不同養(yǎng)殖魚類對于飼料中硒的需求已經(jīng)開展了廣泛研究，如石斑魚0.7 mg/kg[5]、軍曹魚(Rachycentroncanadum)0.788 mg/kg[9]、皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)1.408 mg/kg[7]、鯉(Cyprinuscarpio)1.0 mg/kg[10]。

史氏鱘(A.schrenckii)隸屬于硬骨魚綱鱘形目鱘科，廣泛分布于黑龍江、烏蘇里江、松花江等地，是一種具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值的大型冷水性魚類。目前，對史氏鱘的研究主要集中在生長及抗氧化性能[11]、人工繁育[12]、分子遺傳[13]、疾病免疫[14]、生物學特性[15]等方面，而對其營養(yǎng)需求有少量研究，如ESLAMLOO等[16]和HAMILTON[17]開展了史氏鱘對礦物元素磷和鐵需求的研究，ARSHAD等[18]和MOHSENI等[19]開展了黑海鰉對微量元素硒和銅需求的研究，MOAZENZADEH等[20,21]開展了西伯利亞鱘對微量元素鋅需求的研究。但關于史氏鱘對微量元素硒需求的研究尚無相關報道。

因此，本研究以酵母硒為硒源，向飼料中添加不同水平的硒投喂史氏鱘幼魚，研究飼料中酵母硒添加對史氏鱘幼魚生長性能、肌肉品質、抗氧化能力的影響，為史氏鱘幼魚飼料研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

基礎飼料配方及成分見表1。向基礎飼料中添加總硒含量為2 000 mg/kg的酵母硒(酵母硒來源于安琪酵母股份有限公司)，配制4組不同硒水平的飼料。硒的添加水平分別為0(對照組)、2、4和6 mg/kg，飼料中總硒含量實測值分別為0.78、2.42、4.26和6.73 mg/kg?；A飼料配方如表1所示。

表1 基礎飼料配方Tab.1 The composition of the basic diets %

1.2 實驗用魚及養(yǎng)殖管理

實驗用魚來自湖北省恩施州國硒冷水漁業(yè)開發(fā)有限公司同一批孵化的史氏鱘魚苗。在水溫14～16 ℃、溶氧量為6～7 mg/L的室外流水養(yǎng)殖系統(tǒng)進行養(yǎng)殖。正式實驗前，用基礎飼料對史氏鱘幼魚飽食投喂2周，使實驗魚逐漸適應養(yǎng)殖飼料和環(huán)境。暫養(yǎng)期結束后，將所有史氏鱘幼魚禁食處理24 h，選擇規(guī)格相近、健康、無傷病、平均體重為(25.89±0.74) g的史氏鱘幼魚360尾，平均分配到12個體積1 600 L的圓形養(yǎng)殖缸中，每組飼料隨機分配3個缸。在實驗過程中，每天定時飽食投喂兩次，時間分別為9:00和15:00，采用少量多次投喂法，投喂過程中觀察吃食情況，至養(yǎng)殖缸內(nèi)殘余少量或不殘余餌料時停止投喂。在整個養(yǎng)殖過程中定時監(jiān)測溶氧量和水溫，保持養(yǎng)殖缸中水深一致，通過增氧機控制溶氧量，并記錄史氏鱘的日攝食量和死亡情況。

1.3 樣品采集與分析方法

養(yǎng)殖實驗結束后，對實驗魚進行24 h禁食處理。將養(yǎng)殖缸中的所有魚用MS-222麻醉后，測量體長和體重，用于計算增重率(WG)、肥滿度(CF)、飼料轉化率(FCR)。隨機取3尾魚，用MS-222麻醉后，用一次性醫(yī)用注射器從尾靜脈取血放置在0.5 mL離心管中，室溫靜置30 min后在3 000 r/min的條件下離心15 min，取血清暫時保存在-20 ℃的冰箱中用于測定血液生化指標，取出肝臟及其余內(nèi)臟，計算內(nèi)臟比(VSI)和肝重比(HIS)，然后取出部分肝臟和肌肉放在離心管中暫時保存在-20 ℃的冰箱中用于測定酶活，部分肝臟和肌肉用4%多聚甲醛溶液固定用于測定肌纖維密度和肌纖維直徑。其余背部肌肉裝入自封袋在-20 ℃條件下保存，用于測定水分、粗灰分、粗蛋白質、粗脂肪和硒含量。最后另取3尾魚備測全魚的水分、粗灰分、粗蛋白質、粗脂肪和硒含量。之后將所有樣品置于-20 ℃的車載冰箱中，轉運至實驗室后保存于-80 ℃的冰箱中。

肌肉系水力和營養(yǎng)成分分析參考程輝輝等[22]的方法。油紅染色和HE染色參照鐘曉怡等[23]的方法。通過HE染色法染色，在顯微鏡下測定肌纖維直徑和密度。全魚、肝臟、肌肉和飼料中硒的含量采用氫化物原子熒光光譜法(HG-AFS)測定。谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性及谷胱甘肽(GSH)、總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)含量按照南京建成生物工程研究所試劑盒提供的說明書進行前處理和測定。

1.4 計算方法

內(nèi)臟比(VSI)=Nt/Wt×100%

肝重比(HIS)=N0/Wt×100%

存活率(SR)=Nt/N0×100%

增重率(WGR)=(Wt-W0)/W0×100%

攝食率(FR)=100%×Wf/[t(W0+Wt)/2]

特定生長率(SGR)=(lnWt-lnW0)/t×100%

飼料效率(FE)=(Wt-W0)/Wf×100%

成活率(SR)=N1/N2×100%

式中，Nt表示內(nèi)臟重，N0表示肝臟重；Wt為實驗結束時魚體質量(g)；W0為實驗開始時魚體質量(g)；Wf為飼料投喂總量(g)；Lt為魚結束時的魚體體長(cm)；t為飼養(yǎng)天數(shù)(d)；N1為實驗初始時魚的尾數(shù)；N2為實驗結束時魚的尾數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。通過Shapiro-Wilks和Levene法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布和方差齊性分析，對服從正態(tài)分布數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，當差異顯著時，則采用Duncan法進行多重比較，對非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行非參數(shù)統(tǒng)計分析(Kruskal-Wallis)，采用Dunn-Bonferroni法進行比較，差異顯著水平為P<0.05，實驗結果采用平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚生長性能的影響

由表2可知，養(yǎng)殖70 d后，史氏鱘幼魚平均尾末重隨酵母硒濃度的升高逐漸上升，與對照組相比，6 mg/kg添加組的平均尾末重顯著升高。飼料中添加酵母硒對日攝食率、飼料效率、內(nèi)臟比和肝重比無顯著影響。史氏鱘幼魚的增重率和特定生長率隨著飼料中酵母硒的添加逐漸升高，6 mg/kg添加組與其他組相比顯著升高。飼料中添加酵母硒顯著升高了史氏鱘幼魚的肥滿度。

表2 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚生長性能的影響Tab.2 Effects of dietary levels of yeast selenium on the growth performance of juvenile A.schrenckii

2.2 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉營養(yǎng)成分和全魚體成分的影響

由表3可知，飼料中添加酵母硒顯著降低了肌肉粗蛋白含量，但是對水分、粗灰分、粗脂肪含量沒有顯著性影響。由表4可知，飼料中添加酵母硒對全魚水分、粗脂肪、粗蛋白含量均沒有顯著性影響；然而，當飼料中硒添加量為6 mg/kg時，全魚的粗灰分含量顯著性降低。

表3 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉營養(yǎng)成分的影響Tab.3 Effects of dietary levels of yeast selenium on muscle nutrient composition of juvenile A.schrenckii

表4 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚全魚體成分的影響Tab.4 Effects of dietary levels of yeast selenium on body composition of juvenile A.schrenckii

2.3 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚體內(nèi)硒含量的影響

由表5可知，隨著飼料中硒含量的升高，史氏鱘幼魚全魚硒含量顯著性升高；肌肉和肝臟的硒含量在各組間無顯著差異，但隨著飼料中硒含量的升高呈現(xiàn)出數(shù)值上的增加。酵母硒添加量在同一水平條件下時，肌肉中的硒含量最高，其次是肝臟，全魚的硒含量最低。

表5 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚不同組織中硒含量的影響Tab.5 Effects of dietary levels of yeast selenium on selenium content in different tissues of juvenile A.schrenckii

2.4 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉品質的影響

由表6可知，飼料中添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉系水力有顯著性影響，隨著飼料中硒含量的升高，肌肉的滴水損失顯著性降低；與對照組相比，添加2、4 mg/kg硒顯著降低了肌肉的滴水損失，但當添加至6 mg/kg硒時，不僅顯著降低了肌肉的滴水損失，還顯著降低了肌肉的蒸煮損失及凍融損失。飼料中添加酵母硒顯著減小了史氏鱘幼魚肌肉的肌纖維直徑，肌纖維直徑由對照組的85.32 μm減小到4 mg/kg添加組的79.55 μm，直徑減小了約7.25%，同時，飼料中添加酵母硒顯著性增大肌纖維密度，肌纖維密度由對照組的209根/mm2增加到229根/mm2，密度增加了約9.57%。

表6 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉系水力、肌纖維密度和直徑的影響Tab.6 Effects of dietary levels of yeast selenium on the hydraulic power、fiber density and diameter of muscle in juvenileA.schrenckii

2.5 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚血液和肝臟生化指標的影響

由表7可知，飼料中添加酵母硒對史氏鱘幼魚肝臟和血液中的T-CHO及TG的含量均沒有顯著性影響。由圖1可知，飼料中添加酵母硒對史氏鱘幼魚肝臟中脂肪含量并無顯著影響。

表7 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肝臟和血液的總膽固醇和甘油三酯含量的影響Tab.7 Effects of dietary levels of yeast selenium on total cholesterol and triglyceride in liver and blood of juvenileA.schrenckii

圖1 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肝臟油紅染色結果的影響Fig.1 Effects of dietary levels of yeast selenium on liver red oil staining of juvenile A.schrenckiia、b、c、d分別表示日糧添加酵母硒濃度為0、2、4、6 mg/kg條件下肝臟油紅染色的結果；e表示油紅染色面積統(tǒng)計結果。

2.6 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉、肝臟抗氧化能力的影響

由表8可知，飼料中添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉的CAT和SOD活性均無顯著影響，但在數(shù)值上，CAT、GSH和SOD活性均呈先升高再下降趨勢，在添加4 mg/kg硒時活性最高，且與對照組相比，4 mg/kg添加組的GSH含量顯著性升高。飼料中添加酵母硒對史氏鱘幼魚肝臟的CAT和SOD活性均無顯著影響；與對照組相比，4 mg/kg和6 mg/kg添加組肝臟的GPX活性顯著性升高。

表8 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉和肝臟抗氧化能力的影響Tab.8 Effects of dietary levels of yeast selenium on muscle and liver antioxidant capacity of juvenile A.schrenckii

3 討論

3.1 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚生長性能的影響

Se是維持魚類正常生長和代謝功能所必需的微量元素[17]。日糧硒對魚類生長發(fā)育的影響已有較多研究，結果表明飼料中添加適宜劑量的硒能夠促進魚類的生長[3,5,7,9]。HUNT等[24]也報道過，在日糧中添加3或4 mg/kg的酵母硒能改善虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的生長性能。在本實驗中，當飼料中硒添加量為6 mg/kg時，史氏鱘幼魚的增重率、特定生長率和平均尾末重均顯著性增加，表明飼料中添加酵母硒能促進史氏鱘幼魚的生長，這一結果普遍高于其他魚類的硒需求量，如大黃魚幼魚(0.178 mg/kg)[3]、石斑魚(0.7 mg/kg)[5]、皺紋盤鮑(1.408 mg/kg)[7]、軍曹魚(0.788 mg/kg)[9]、羅非魚(Oreochromisspp)(3 mg/kg)[25]、大西洋白姑魚(Argyrosomusregius)(3.98～4 mg/kg)[26,27]、黃尾鰤(Seriolalalandi)(5.56 mg/kg)[28]，遠低于黑海鰉(Husohuso)(11.56 mg/kg)[18]，說明不同魚類對飼料硒的需求量有差異，這可能和養(yǎng)殖模式、實驗魚種類與習性及飼料硒的添加形式等有關。銅和鋅也是水產(chǎn)動物必需的微量元素。MOHSENI等[19]以CuSO4為銅源,以體增重為評價指標，確定了黑海鰉飼料的適宜銅添加量為10.3～13.1 mg/kg，在西伯利亞鱘的研究中，MOAZENZADEH等[20,21]以ZnSO4為鋅源，以終末體重和肝臟鋅含量為評價指標，認為飼料中適宜的鋅添加量分別為29.15 mg/kg和34.60 mg/kg，本實驗以WGR、SGR和CF進行評價，當飼料中硒添加量為6 mg/kg時，史氏鱘幼魚的生長性能最好，說明鱘科魚類對微量元素Cu、Zn和Se的需求較高。高水平的日糧硒會產(chǎn)生一系列不利的生物學效應，包括死亡率上升，抑制魚類生長和降低飼料利用率。WANG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加高濃度的亞硒酸鈉(9.16 mg/kg)對皺紋盤鮑產(chǎn)生了毒性作用，降低了其生長性能和抗氧化能力。飼料中長時間投喂高水平硒(13 mg/kg)時，虹鱒會出現(xiàn)慢性中毒現(xiàn)象，表現(xiàn)出生長減緩、飼料效率降低和死亡率升高等癥狀[29]。根據(jù)TASHJIAN等[30]的報道，魚類對飼料中硒毒性的閾值是10～20 mg/kg。但RIDER等[31]的研究顯示，在飼料中添加7.4～8.0 mg/kg的酵母硒對虹鱒沒有產(chǎn)生任何毒性作用，整個實驗期間也沒有虹鱒死亡。飼料中一定量的硒可以導致魚體中毒死亡而沒有抑制生長，也有抑制生長而沒有中毒死亡的現(xiàn)象，不同魚類對飼料硒的耐受能力有差異，本實驗中最高添加6 mg/kg(飼料總硒含量6.73 mg/kg)的硒既沒有抑制史氏鱘幼魚的生長，也沒有對其產(chǎn)生毒性作用，說明史氏鱘幼魚對酵母硒的耐受能力和生物利用率較高。

胡俊茹等[4]認為血液中的膽固醇、甘油三酯的含量能很好的反映動物的營養(yǎng)健康狀況，且膽固醇常被用于檢測由脂肪代謝紊亂產(chǎn)生的相關疾病。王崇等[32]認為血清中甘油三脂的含量越高，異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)生長越差，可能是甘油三脂通過影響脂肪代謝從而影響魚的生長。本實驗中，飼料中添加硒對血液和肝臟的T-CHO和TG含量沒有顯著性影響；對肝臟進行油紅染色發(fā)現(xiàn)添加酵母硒對肝臟的脂肪含量也沒有影響。這說明在飼料中添加6 mg/kg的硒不會造成史氏鱘肝臟中脂肪的積累，也不會引起脂肪代謝紊亂對機體造成損害。

3.2 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉營養(yǎng)成分和硒沉積的影響

魚體的肌肉營養(yǎng)成分是魚類營養(yǎng)學研究中評價魚體營養(yǎng)狀況的重要研究內(nèi)容[4]。魚類的營養(yǎng)價值主要和肌肉中的蛋白質和脂肪含量相關[33]。魚類肌肉品質又主要受物種、棲息環(huán)境和食物組成的影響[22]。在本實驗中，飼料中添加酵母硒對史氏鱘幼魚全魚體成分沒有顯著性影響，對史氏鱘幼魚肌肉的水分、粗灰分和粗脂肪含量也沒有影響。這和其他學者的研究結果相同，隨著飼料中硒含量的升高，大黃魚幼魚[3]、黃顙魚幼魚[4]、石斑魚[5]、皺紋盤鮑[7]和軍曹魚[9]的肌肉營養(yǎng)成分沒有顯著性影響。

硒可在機體內(nèi)蓄積，當攝入適量硒時，能夠促進機體的生長和代謝；過量時能夠加速肝胰臟和腎臟硒積累而出現(xiàn)中毒現(xiàn)象[8]。LIN等[5]發(fā)現(xiàn)點帶石斑魚全魚硒含量隨飼料硒濃度的升高而升高，全魚硒含量可以作為飼料硒營養(yǎng)的有效指標。LE等[34]發(fā)現(xiàn)黃尾鰤幼魚肝臟和肌肉硒含量隨飼料硒水平的升高而極顯著的升高，肝臟和肌肉硒含量是衡量硒效價的重要指標。HUNT等[24]和RIDER等[31]研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒不同組織中的Se累積量與飼料中硒的添加量之間存在正相關關系。大黃魚幼魚[3]的全魚和骨骼的硒含量以及軍曹魚幼魚[8]的脊椎骨、全魚和肝臟硒含量隨飼料中硒的添加逐漸升高，和本研究結果一致。可能是酵母硒通過機體代謝途徑和沉積機制轉化成硒,從而增加了史氏鱘幼魚肝臟和肌肉硒含量。LE等[34]和ASHOURI等[10]研究結果表明，硒在黃尾鰤幼魚和鯉魚組織中的沉積能力是肝臟>肌肉。楊原志等[8]發(fā)現(xiàn)硒在軍曹魚幼魚組織中的沉積能力是全魚>肌肉。但本研究和HAN等[3]對異育銀鯽的研究結果一致,硒在組織中的沉積能力是肌肉>肝臟>全魚。關于魚類硒的代謝的研究十分有限，對其代謝機制不是很清楚，尤其是硒在鱘魚體內(nèi)的代謝機制鮮有研究，我們大膽猜測這可能和實驗魚的種類、大小、遺傳特性、攝食習性、飼養(yǎng)環(huán)境和其他因素有關，但硒在史氏鱘體內(nèi)的代謝及轉化機制實際是怎么樣的還需進一步研究。

3.3 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉品質的影響

系水力是衡量肉質好壞的一項重要指標。滴水損失、蒸煮損失和凍融損失都是評價肌肉系水力的重要指標，滴水損失、蒸煮損失和凍融損失越小，肌肉系水力越強[22]。肌纖維密度在一定程度上也是衡量肌肉品質的指標，通常肌纖維密度越大，肌肉嫩度越大。JONSSON等[35]認為滴水損失可能和肌纖維密度、肌纖維直徑及一些內(nèi)在的組織結構有關。本實驗中，隨著飼料中硒的添加，滴水損失、蒸煮損失和凍融損失都逐漸降低，肌肉系水力能力增強，當添加水平為6 mg/kg時，滴水損失、蒸煮損失和凍融損失顯著性降低；飼料中添加酵母硒顯著增大了肌纖維密度，顯著降低了肌纖維直徑。所以，當飼料中硒添加量為6 mg/kg時，史氏鱘幼魚肌肉保持水分的能力和嫩度是最好的。

3.4 日糧添加酵母硒對史氏鱘幼魚肌肉、肝臟抗氧化能力的影響