吳曉菲 孫 瓊 周芳芳 蔣 林

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是惡性漿細胞克隆性疾病，其分泌的單克隆球蛋白引起全身性損害，以骨質(zhì)破壞、腎功能不全、貧血、高鈣血癥等為臨床表現(xiàn)[1]。MM患者中可觀察到一系列T淋巴細胞數(shù)量、分化和功能異常。Th17和Th22是新的CD4+T淋巴細胞亞群，在MM的疾病進展中發(fā)揮重要作用。Prabhala等[2]研究發(fā)現(xiàn)，MM患者外周血及骨髓單個核細胞中白細胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)、IL-22和輔助性T細胞17(T helper cell 17, Th17)水平明顯高于健康人，促進體外和體內(nèi)的骨髓瘤細胞生長，以及增強骨髓瘤細胞對骨髓間充質(zhì)干細胞的黏附性，同時IL-17和IL-22聯(lián)合抑制健康供者外周血單個核細胞中Th1細胞因子的產(chǎn)生，削弱免疫反應[3]。最重要的是，Th17可通過CCL20-CCR6軸被募集到炎癥部位，IL-17上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)配體受體激活因子(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)的表達，后者促進破骨細胞形成；臨床上也同樣觀察到有溶骨性病變和非溶骨性病變患者中Th17細胞和IL-17的差異[4,5]。Th22細胞分泌的IL-22與腫瘤細胞上的IL-22受體結(jié)合，誘導信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)磷酸化，促進MM細胞的生長和耐藥性，IL-13通過促進骨髓間充質(zhì)干細胞黏附分子和IL-6表達，間接增強MM細胞和間質(zhì)細胞的黏附，調(diào)節(jié)MM腫瘤細胞的增殖和耐藥；臨床上也觀察到Th22細胞與分期呈正相關(guān)，并在患者獲得緩解后減少的現(xiàn)象[6]。

慢性炎癥刺激和腫瘤微環(huán)境影響下，大量T淋巴細胞受體激活誘導干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulatory factor 4, IRF4)、B淋巴細胞轉(zhuǎn)錄激活因子(B cell activating transcription factor, BATF)和活化T淋巴細胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1, NFATc1)驅(qū)動T淋巴細胞耗竭。耗竭的T淋巴細胞表現(xiàn)為線粒體功能障礙，代謝活性降低，產(chǎn)生細胞因子能力明顯減弱，包括γ-干擾素 (interferon-γ, IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-2等，并表達抑制性受體，包括程序性死亡受體-1(programmed cell death-1, PD-1)、淋巴細胞激活基因-3 (lymphocyte activation gene-3, LAG-3)、T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3, TIM-3)、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4)、T淋巴細胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains, TIGIT)和CD244等，最終抗原特異性T細胞缺失，出現(xiàn)腫瘤逃逸[7]。

缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是α亞基(通常為HIF-1α或HIF-2α)與β亞基(HIF-1β，也稱為芳基烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白)一起組成。在缺氧條件下，HIF-1α不被蛋白酶體降解，被轉(zhuǎn)運到核內(nèi)與HIF-1β形成二聚體，與缺氧反應元件結(jié)合，激活下游多種基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮重要的生物學作用。在缺氧條件下，HIF-1α結(jié)合的某個缺氧反應元件(hypoxia-responsive element, HRE)在Th17轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體相關(guān)孤兒受體-γt(orphan nuclear receptor ROR gammaT, RORγt)的近端，誘導Th17分化，并促進Treg轉(zhuǎn)錄因子叉頭框p3(forkhead box protein 3, Foxp3)蛋白降解，通過以上機制上調(diào)自身免疫性腦膜炎模型中Th17/Treg比值，介導疾病進展[8]。另一方面，在腸道炎癥相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)HIF-1α與IL-22的啟動子結(jié)合，促進Th22轉(zhuǎn)錄因子芳香烴受體(Ah receptor nuclear translocator protein, AhR)表達，Th22分化和IL-22產(chǎn)生[9]。然而，關(guān)于MM中HIF-1α的表達，及其與T淋巴細胞分化相關(guān)性的研究較少。

本研究利用MM患者的骨髓活檢切片標本并通過免疫組化技術(shù)檢測HIF-1α在MM中的表達水平，并通過流式細胞術(shù)檢測Treg、Th17和Th22細胞分化水平，實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測T淋巴細胞中T淋巴細胞耗竭相關(guān)基因表達，分析患者臨床特征、HIF-1α表達水平、T淋巴細胞分化特征之間的相關(guān)性，旨在為深入研究MM免疫逃逸提供新的視角和更多的實驗證據(jù)。

對象與方法

1.材料與儀器：抗CD4-FITC、抗Foxp3-PE、抗CD25-APC、抗IL-17A-PE、抗IL-22-PE均購自美國eBioscience公司；兔抗人HIF-1α抗體購自武漢Bioswamp公司；MaxVision TM HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。固定破核劑購自美國BD公司；SYBR快速qPCR試劑盒購自巴塞羅那Biosystems公司；Oligo (dT)18 Primer TaKaRa 3806、PrimeScript Ⅱ RTase、Recombinant Rnase Inhibitor均購自日本TaKaRa公司；10mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸預混液購自北京索萊寶科技有限公司；人全血單個核細胞分離液購自天津TBD公司。儀器：GE48527型PCR儀購自杭州柏恒科技有限公司；CFX-Connect 96型實時熒光PCR儀購自美國伯樂公司；NovoCyte型流式細胞儀購自美國艾森公司。

2.研究對象：收集2021年1月～2022年2月華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院收治的9例MM患者和3例缺鐵性貧血(iron deficiency anemia, IDA)患者的病例資料，分別納入MM組和IDA組。所入選MM患者均符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》診斷標準，IDA患者均符合缺鐵性貧血專家共識標準，并排除合并腫瘤的患者[10，11]。本項目通過華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審批[倫理審批號：院-市衛(wèi)健委-倫2021(16)；WHZXKYL2022-006]，參與患者均簽署知情同意書。MM組患者中，男性5例，女性4例，患者中位年齡為69(55，81)歲，發(fā)病年齡高峰為65～75歲，IDA組患者中，女性2例，男性1例，患者中位年齡為36(33，74)歲。疾病分型：IgG型6例，IgA型2例，輕鏈型1例。按照國際分期系統(tǒng)(International Staging Systyem, ISS)進行疾病分期，Ⅰ期3例，Ⅱ期2例，Ⅲ期4例；按照DS分期(Durie-Salmon, DS)進行疾病分期，ⅡA期3例，ⅢA期4例，ⅢB期2例。結(jié)合MM患者初診時頭顱、骨盆X線片、以及胸腰椎CT統(tǒng)計每位患者直徑≥5mm獨立溶骨性骨質(zhì)破壞的部位數(shù)量，詳見表1。

3.免疫組化方法：應用Maxvision法對兩組患者骨髓病理進行HIF-1α免疫標記，DAB顯色，蘇木精復染，通過顯微鏡拍照，Leica Application Suite圖象系統(tǒng)采集樣本相關(guān)部位。蘇木精染細胞核為藍色，DAB顯出陽性為棕黃色。

4.流式細胞術(shù)：(1)Treg：取各組外周血樣本，1×106個細胞，100μl 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸后，每管加入5μl CD4和CD25抗體，4℃避光孵育30min。洗滌后每管加入固定劑1ml，重懸細胞，避光孵育20min離心后每管加入破膜劑1ml，重懸細胞，避光孵10min后，離心重懸細胞，每管加入5μl的Foxp3抗體，4℃避光孵育45min。400μl的PBS重懸細胞，4℃避光保存，上機檢測。(2)Th17、Th22：取各組外周血樣本，1×106個細胞，1ml的細胞培養(yǎng)液重懸，每管加入2μl的刺激阻斷合劑佛波酯(PMA，終濃度50ng/ml)和離子酶素(Ionomycin，終濃度2μg/ml)，高爾基體阻斷劑莫能菌素鈉(Monensin sodium，終濃度3μg/ml)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)6h。洗滌后，加入2ml流式染色緩沖液洗滌1次，離心重懸細胞，每管加入5μl CD4抗體避光孵育；每管加入固定劑1ml，重懸細胞避光孵育并離心后，每管加入破膜劑1ml，重懸細胞避光孵育，洗滌離心后，每管加入5μl的IL-17、IL-22抗體，4℃避光孵育45min。重懸細胞，上機檢測。使用NovoCyte分析軟件分析實驗結(jié)果。

5.實時熒光定量聚合酶鏈反應：使用Trizol分離細胞總RNA，使用TaKaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA形成cDNA。加入對應基因引物(表2)，使用美國Bio-Rad公司熒光定量PCR儀進行實時PCR。使用比較性循環(huán)數(shù)(Ct法)測量基因的mRNA表達水平，以內(nèi)參基因GAPDH表達為基準值，將目的基因表達值標準化為相對mRNA表達水平。

表2 PCR引物序列

結(jié) 果

1.HIF-1α在MM患者中的表達：MM患者的骨髓活檢組織中，HIF-1α主要表達在間質(zhì)組織中，少數(shù)在細胞質(zhì)中(圖1)。6例行骨髓活檢的MM患者中，4例HIF-1α陽性率平均水平為12.00%±9.55%，1例為10%～20%，1例在30%以上，3例IDA患者骨髓活檢組織中，HIF-1α陽性率平均水平均為5.31%±1.14%。在MM患者骨髓標本中，HIF-1α陽性率明顯高于IDA患者(t=1.95，P=0.016)。

圖1 免疫組化法檢測骨髓活檢組織中HIF-1α的表達(DAB染色，×200)A.多發(fā)性骨髓瘤患者；B.缺鐵性貧血患者

2.Treg、Th17和Th22占CD4+T細胞中的比例：

MM組患者與IDA組患者外周血中， Treg、Th17細胞占CD4+T細胞中的比例差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.975，P=0.685)，MM組患者外周血中，Th22占CD4+T細胞中的比例明顯高于IDA組(P=0.037，圖2)。MM組患者外周血中Th17/Treg比值明顯高于IDA組(P=0.006，表3)。

表3 外周血中Th17、Treg和Th22占CD4+T細胞百分比

圖2 流式細胞學檢測外周血中Treg、Th17和Th22占CD4+T細胞百分比A.多發(fā)性骨髓瘤患者；B.缺鐵性貧血患者；1.Th17；2.Treg；3.Th22

3.MM患者中T淋巴細胞耗竭相關(guān)基因表達：MM患者的T淋巴細胞中，NFATc1擴增水平明顯高于IDA患者(P=0.019)。同時，IRF4、轉(zhuǎn)錄因子Helios、B淋巴細胞誘導成熟蛋白-1(B lymphocyte induced maturation protein-1，Blimp-1)、轉(zhuǎn)錄因子T-bet的擴增水平在MM組和IDA組患者之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表4)。

表4 T淋巴細胞耗竭相關(guān)基因表達水平

4.Pearson相關(guān)性分析：Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在MM患者骨髓中，HIF-1α表達水平與Th17/Treg比值之間呈正相關(guān)，但差異無統(tǒng)計學意義(r=0.538，P=0.270，圖3A)，HIF-1α表達水平與Th22占CD4+T細胞百分比之間呈明顯正相關(guān)(r=0.982，P=0.001，圖3B)。Th17/Treg比值與MM患者的溶骨性病變之間呈正相關(guān)(r=0.879，P=0.009，圖3C)。

圖3 HIF-1α與Th17/Treg比值、Th22以及Th17/Treg與骨損害的相關(guān)性分析A.HIF-1α與Th17/Treg比值；B.HIF-1α與Th22；C.Th17/Treg比值與骨損害

討 論

MM患者體內(nèi)T細胞分化水平與健康人存在明顯差異。部分研究表明，MM患者中Treg細胞分化增多，而Th17細胞分化減少，參與到意義未明的單克隆球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS)向MM進展的過程中[12]。另一部分學者研究表明，MM患者中Th17細胞、Th22分化及IL-17A、IL-22水平明顯高于健康對照組，兩者均能促進MM細胞增殖、黏附，與較差的疾病預后密切相關(guān)，其中Th17可通過誘導破骨細胞活性而促進溶骨性病變形成[5,6,13]。高水平的TGF-β，相對低水平的IL-6條件下，F(xiàn)oxp3占主導地位，推動T細胞從Treg/Th17向Treg傾斜。另一方面，低水平TGF-β，而高水平的IL-6激活STAT3，F(xiàn)oxp3對RORγt轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用削弱，從而推動T淋巴細胞向Th17方向分化，因此Th17/Treg動態(tài)平衡是維持正常免疫功能的關(guān)鍵[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，MM組患者外周血中Th17/Treg向Th17細胞分化方向傾斜，Th22細胞分化也明顯高于IDA組，提示監(jiān)測Th17/Treg和Th22可為發(fā)現(xiàn)疾病進展提供關(guān)鍵線索。

嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)具有單克隆抗體的抗原識別域和細胞內(nèi)T淋巴細胞信號域，在結(jié)合特異性抗原后可直接發(fā)揮腫瘤殺傷作用，主要效應細胞為CD8+T細胞，靶向識別B淋巴細胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)的CAR-T細胞在臨床上已獲得重大突破，維持CAR-T細胞的持續(xù)性的靶向殺傷活性是進一步改善治療效果的關(guān)鍵[15]。然而，Tan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，MM患者外周血和骨髓中耗竭表型T淋巴細胞，即表達PD-1、TIM-3的T淋巴細胞均顯著增加，尤其在CD8+T細胞群中更為明顯，而治療后患者耗竭表型T淋巴細胞有所減少。腫瘤微環(huán)境中的髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)可通過高表達PD-L1、CD80，分泌TGF-β和IL-10誘導T淋巴細胞耗竭[17]。慢性炎癥環(huán)境下，轉(zhuǎn)錄因子IRF4、BATF和NFATc1激活也是T淋巴細胞耗竭的重要機制[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，MM患者外周血T淋巴細胞中NFATc1表達水平較高，而其他耗竭相關(guān)基因IRF4、Helios、Blimp-1、T-bet水平無明顯差異，還需要進一步擴大樣本量，分析CD8+T細胞的抑制性表型，評估MM患者的T淋巴細胞耗竭程度。骨髓微環(huán)境中巨噬細胞的STAT3以及IL-17通過上調(diào)NFATc1表達，促進破骨細胞分化和增殖，破壞骨穩(wěn)態(tài)[18,19]。MM患者T淋巴細胞中NFATc1的激活為進一步探究MM患者溶骨性病變機制提供思路。

在MM中，HIF-1α主要通過調(diào)節(jié)VEGF、BFGF、Ang-2等血管新生相關(guān)的因子，促進骨髓瘤血管新生而影響腫瘤生長[20]。炎癥性疾病的相關(guān)研究表明，HIF-1α還可與缺氧反應元件結(jié)合，誘導下游轉(zhuǎn)錄因子激活，調(diào)節(jié)Th17和Th22細胞分化[8,9]。而關(guān)于MM中HIF-1α對免疫細胞的調(diào)節(jié)作用甚少研究。本研究結(jié)果提示，MM患者的骨髓活檢組織中高表達HIF-1α，與Th17/Treg比值、Th22百分比呈一定的正相關(guān)，Th17/Treg和溶骨性病變程度呈明顯正相關(guān)。HIF-1α可通過多種途徑調(diào)節(jié)線粒體氧化能力、氧化磷酸化、生物發(fā)生、凋亡、裂變和自噬，而線粒體功能障礙是T淋巴細胞耗竭、衰老的元兇[21]。HIF-1α與T淋巴細胞線粒體功能障礙之間的關(guān)系和內(nèi)在機制是下一步研究的方向。

綜上所述，MM患者Th17/Treg、Th22水平升高，T淋巴細胞耗竭相關(guān)基因表達水平上調(diào)，表明MM患者的T淋巴細胞分化及功能狀態(tài)異常；骨髓中高表達的HIF-1α與異常的T淋巴細胞分化狀態(tài)相關(guān)，HIF-1α調(diào)節(jié)T淋巴細胞分化和功能的內(nèi)在機制的深入研究為提高MM CAR-T細胞療效提供了新的可能性。