王 娟 茅 松

急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)指由多種病因引起的腎功能快速下降而出現(xiàn)的一系列功能紊亂的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率的下降、體內(nèi)代謝產(chǎn)物的蓄積等。統(tǒng)計(jì)顯示，10%～15%的入院患者有AKI，而在重癥監(jiān)護(hù)患者中，其發(fā)生率已超過(guò)50%[1，2]。AKI的發(fā)生、發(fā)展是導(dǎo)致許多患者預(yù)后不佳的重要因素之一。雖然AKI與死亡之間沒(méi)有直接的聯(lián)系，但統(tǒng)計(jì)顯示AKI每年會(huì)導(dǎo)致(100～700)萬(wàn)人死亡[3]。AKI的發(fā)生是多種因素作用的結(jié)果，其與個(gè)體差異、當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)、醫(yī)療衛(wèi)生水平均有密切關(guān)系。統(tǒng)計(jì)顯示，全球每年有(130～300)萬(wàn)人發(fā)生AKI，其中85%的人生活在發(fā)展中國(guó)家[3]。中國(guó)作為世界上最大的發(fā)展中國(guó)家，AKI的發(fā)生率和病死率均較高，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。一項(xiàng)納入22個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)44家醫(yī)院的研究顯示，社區(qū)獲得性AKI的比率為1.11%，而社區(qū)獲得性AKI病例在所有AKI病例中的比例達(dá)到54.4%[4]。

多種疾病可能易并發(fā)AKI，除繼發(fā)于腎臟本身的疾病外，也好發(fā)于多器官功能障礙綜合征、敗血癥、休克、心臟外科手術(shù)創(chuàng)傷、燒傷、腎毒性藥物應(yīng)用及線粒體功能損傷等[5]。目前證實(shí)，腎臟也是新型冠狀病毒感染的重要受累器官之一[6]。

缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)是誘發(fā)腎損傷的常見(jiàn)原因之一。如腎移植、腎動(dòng)脈成形術(shù)、部分腎切除術(shù)、心臟相關(guān)大型手術(shù)和輸尿管阻塞等臨床情況中均易發(fā)生腎臟IR損傷。在此過(guò)程中，局部組織的氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供需不平衡，受損的腎臟細(xì)胞分泌一些促炎性細(xì)胞因子等，導(dǎo)致了腎小管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[7, 8]。缺血性AKI后腎小管細(xì)胞的存亡取決于損傷的嚴(yán)重程度。輕度損傷誘發(fā)細(xì)胞極性的喪失，如黏附分子/膜蛋白的錯(cuò)誤定位和細(xì)胞骨架完整性的破壞。如果損傷及時(shí)停止了，細(xì)胞功能往往可以恢復(fù)。但更嚴(yán)重的損傷易誘發(fā)不可逆轉(zhuǎn)的腎小管細(xì)胞凋亡或壞死，從而導(dǎo)致腎功能障礙[9]。

過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ)是核受體超家族的成員，其與新陳代謝、能量平衡、細(xì)胞發(fā)育和分化密切相關(guān)。業(yè)已證實(shí)，噻唑烷二酮類可以通過(guò)激活PPARγ發(fā)揮作用，臨床上被用來(lái)改善2型糖尿病患者的血糖狀態(tài)并減少胰島素抵抗，羅格列酮(rosiglitazone，RSG)是噻唑烷二酮類經(jīng)典藥物[10]。研究表明，在甘油誘導(dǎo)的AKI中，PPARγ的表達(dá)和活性降低，用西格列酮預(yù)處理后小鼠PPARγ的表達(dá)和活性即增強(qiáng)，且可明顯減輕AKI后腎功能的惡化[11]。激活PPARγ可以保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞，減少AKI的發(fā)生[12]。PPARγ激活業(yè)已被證明可引起冠狀動(dòng)脈血管舒張[13]。研究也發(fā)現(xiàn)，PPARγ的激活可降低血壓，這些研究表明PPARγ激動(dòng)劑對(duì)血管功能和系統(tǒng)血流動(dòng)力學(xué)有調(diào)節(jié)作用[14，15]。另一項(xiàng)研究則表明，吡格列酮對(duì)慢性腎臟病患者的內(nèi)皮功能，包括血流介導(dǎo)的擴(kuò)張、動(dòng)脈順應(yīng)性和脈搏波傳導(dǎo)速度沒(méi)有影響[16]。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)的事后分析顯示，吡格列酮可以降低慢性腎臟病 (chronic kidney diseases, CKD)糖尿病患者的全因病死率、心肌梗死和腦卒中的發(fā)生率，但是服用吡格列酮的隊(duì)列腎功能的下降更為明顯[17]。激活PPARγ保護(hù)腎功能的作用似乎有待于進(jìn)一步評(píng)估。筆者團(tuán)隊(duì)設(shè)想給藥的時(shí)間點(diǎn)與持續(xù)時(shí)間可能對(duì)其發(fā)揮腎臟預(yù)保護(hù)作用相互影響。因此本文研究了PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)IR誘導(dǎo)的小鼠AKI的預(yù)保護(hù)作用及時(shí)間序列影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本研究已通過(guò)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審核，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SYXK(滬)2011-0128。40只C57/B6雄性小鼠通過(guò)簡(jiǎn)單隨機(jī)分組方法分為5組，即對(duì)照組(C0組)、單純手術(shù)組(IR組)、術(shù)前1天給藥組(1RSG組)、術(shù)前3天給藥組(3RSG組)、術(shù)前7天給藥組(7RSG組)，每組各8只。C0組不做任何處理；IR組通過(guò)夾閉小鼠右側(cè)腎蒂45min，構(gòu)建腎臟IR誘導(dǎo)AKI的模型，術(shù)后24h進(jìn)行處理取材；1RSG、3RSG和7RSG組分別為術(shù)前連續(xù)給藥1、3、7天，藥物RSG劑量為10mg/kg，手術(shù)造模同IR組，術(shù)后24h進(jìn)行處理取材。

2.血液和尿液生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)：術(shù)后24h通過(guò)眼球采血收集血液，4℃、12000r/min下離心機(jī)離心10min以制備冷凍的血清，批量分析。隨后使用全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)：日立7600全自動(dòng)模塊組合式生化分析儀)檢測(cè)血清中的血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血清肌酐(creatinine, CREA)。術(shù)后24h收取尿液，收集的尿液在-80℃凍存，直到進(jìn)行批次分析。肌酐試劑盒(C011-2-1，南京建成生物工程研究所)檢測(cè)尿CREA水平。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(ab108792，英國(guó)Abcam公司)檢測(cè)尿微量白蛋白水平。

3.組織形態(tài)觀察：術(shù)后24h處理取材右側(cè)腎臟后，浸泡于甲醛溶液。后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察腎組織微觀形態(tài)改變。

4.腎組織基因表達(dá)分析：術(shù)后24h處理取材右側(cè)腎臟后，凍存于-80℃冰箱。用Trizol試劑(15596-018，美國(guó)Invitrogen公司)從組織中提取總RNA。用DNA酶試劑盒(K1622，美國(guó)Thermo Scientific公司)去除總RNA中混合的DNA，用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑(EN0521，美國(guó)Thermo Scientific公司)生成cDNA，后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR,4913850001，瑞士Roche公司)，檢測(cè)腎臟損傷標(biāo)志物(Kim-1、NGAL)mRNA水平，使用2-△△ct法計(jì)算與C0組的相對(duì)mRNA水平。

5.Western blot法檢測(cè)：用4℃保存的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌腎組織，并用添加磷酸酶抑制劑(PMSF)的RIPA緩沖液裂解。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定組織蛋白水平，并用以下抗體印跡：抗β-actin(4970S，美國(guó)CST公司)，抗Kim-1(ab47635，英國(guó)Abcam公司)，抗NGAL(ab125075，英國(guó)Abcam公司)，使用Image J軟件對(duì)蛋白印跡結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 8.0繪制。

結(jié) 果

1.BUN和血CREA水平：IR組BUN、血CREA水平較C0組均明顯增高(P<0.05)；1RSG、3RSG、7RSG組BUN、血CREA水平較C0組均明顯增高(P<0.05)；1RSG、3RSG、7RSG組BUN、血CREA水平較IR組均降低，且呈逐漸下降趨勢(shì)，其中7RSG組BUN、血CREA水平較IR組明顯下降(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組BUN和血CREA的變化趨勢(shì)A.各組BUN的變化趨勢(shì)；B.各組血CREA的變化趨勢(shì);與C0組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05

2.尿微量白蛋白/肌酐比值：IR組尿微量白蛋白/肌酐比值較C0組均明顯增高(P<0.05)；1RSG、3RSG、7RSG組較C0組均顯著增高(P<0.05)；1RSG、3RSG、7RSG組尿微量白蛋白/肌酐比值較IR組明顯均降低(P<0.05)，且呈逐漸下降趨勢(shì)，詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組尿微量白蛋白/肌酐比值的變化與C0組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05

3.組織病理學(xué)結(jié)果：從HE染色標(biāo)本觀察到，相較于C0組，IR組腎小管管腔可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，提示腎小管受到嚴(yán)重?fù)p傷；與IR組比較，1RSG、3RSG、7RSG組管腔內(nèi)紅細(xì)胞有所減少，提示1RSG、3RSG、7RSG組腎小管損傷較IR組改善明顯， 7RSG組改善最明顯，詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組腎組織病理改變(HE染色，×40)A.C0組；B.IR組；C.1RSG組；D.3RSG組；E.7RSG組

4.Kim-1和NGAL mRNA水平：IR組Kim-1和NGAL mRNA水平較C0組均明顯增高(P<0.05)；1RSG、3RSG、7RSG組Kim-1和NGAL mRNA水平較C0組均顯著增高(P<0.05)；1RSG、3RSG、7RSG組Kim-1和NGAL mRNA水平較IR組明顯均降低(P<0.05)，且呈逐漸下降趨勢(shì)，詳見(jiàn)圖4。

圖4 各組Kim-1和NGAL mRNA水平變化與C0組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05

5.Kim-1和NGAL蛋白表達(dá)水平：IR組Kim-1和NGAL蛋白表達(dá)水平較C0組均明顯增高(P<0.05)；1RSG、3RSG、7RSG組Kim-1和NGAL蛋白表達(dá)水平較C0組均顯著增高(P<0.05)；1RSG、3RSG、7RSG組Kim-1蛋白表達(dá)水平較IR組明顯均降低(P<0.05)，且呈逐漸下降趨勢(shì)；3RSG、7RSG組NGAL蛋白表達(dá)水平較IR組明顯均降低(P<0.05)，且呈逐漸下降趨勢(shì)，詳見(jiàn)圖5。

圖5 各組Kim-1和NGAL 蛋白表達(dá)水平A.各組Kim-1和NGAL蛋白表達(dá)Western blot法條帶圖；B.各組Kim-1和NGAL蛋白表達(dá)。與C0組比較，*P<0.05；與IR組比較，#P<0.05

討 論

AKI在臨床中廣泛存在，可引起多種并發(fā)癥，及早控制預(yù)防具有非常重要的意義，IR損傷是導(dǎo)致AKI的常見(jiàn)誘因。本研究結(jié)果表明，RSG可緩解IR誘導(dǎo)的AKI。給予RSG灌胃后，血CREA、BUN水平較單獨(dú)IR組下降，在一定時(shí)間范圍內(nèi)(1～7天)，降低程度與給藥時(shí)間呈正相關(guān)。同時(shí)尿微量白蛋白/肌酐比值明顯下降，相較于BUN、血CREA，尿微量白蛋白/肌酐比值只有術(shù)前7天給藥下降程度才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即便術(shù)前1天給藥，尿微量白蛋白/肌酐比值下降程度也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PPARγ激活可降低糖尿病患者尿微量白蛋白，提示PPARγ激動(dòng)劑在降低尿微量白蛋白方面效果比較顯著[18]。腎損傷分子Kim-1、NGAL在mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下降；這提示早期應(yīng)用PPARγ激動(dòng)劑可有效減輕IR損傷所誘導(dǎo)的AKI，且在一定范圍內(nèi)，給藥時(shí)間越長(zhǎng)，保護(hù)作用越顯著。

Elshazly等[19]研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前7天給予吡格列酮灌胃后，不但可以改善腎功能，還能改善因腎缺血損傷的肝功能。Singh等[20]研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇通過(guò)PPARγ激活大鼠內(nèi)皮一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)來(lái)緩解IR誘導(dǎo)的AKI。Zhang等[21]研究證明，油酸通過(guò)Ras/MAPKs/PPAR-γ信號(hào)通路上調(diào)PPARγ緩解脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的急性腎損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，甜菊糖(stevioside)可緩解橫紋肌溶解誘導(dǎo)的AKI，但在用甜菊糖之前給予PPARγ受體拮抗劑-雙酚A二縮水甘油醚預(yù)處理，可廢除甜菊糖介導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用，這表明PPARγ參與其腎臟保護(hù)作用[22]。近年來(lái)研究表明，AKI后腎功能并不是完全恢復(fù)，而是有向慢性腎臟病轉(zhuǎn)化的傾向，及早干預(yù)有著重要意義，而PPARγ的激活可緩解AKI向CKD轉(zhuǎn)化[23]。因此，激活PPARγ不但可以預(yù)保護(hù)AKI，而且長(zhǎng)期也可發(fā)揮腎功能保護(hù)作用。PPARγ的激活可能為IR誘導(dǎo)的AKI患者提供了一種保護(hù)腎臟的潛在方法。

同時(shí)不容忽視的一點(diǎn)是，PPARγ激活有舒張血管的作用，由于腎臟與血流量的自身調(diào)節(jié)有密切的關(guān)系，所以PPARγ對(duì)血管的作用也與其對(duì)腎臟功能的作用相關(guān)聯(lián)。Guan等[24]研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ的激活可導(dǎo)致體內(nèi)液體潴留。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ的激活可抑制一些血管相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如血管緊張素-1型受體和血栓素合成酶基因[25，26]。而且噻唑烷二酮類藥物通過(guò)顯著降低血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體的表達(dá)和抑制通過(guò)該受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以抑制血管重塑和氧化應(yīng)激反應(yīng)[27]。PPARγ激動(dòng)劑對(duì)血管與血流動(dòng)力學(xué)的作用要求在考慮將其應(yīng)用于腎臟病患者時(shí)格外謹(jǐn)慎。研究發(fā)現(xiàn)，一種吲哚衍生物可作為選擇性PPARγ調(diào)節(jié)劑(SPPARγMs)，相較于傳統(tǒng)噻唑烷二酮類藥物其增加血漿和細(xì)胞外液容量的潛力降低了，但還沒(méi)有相關(guān)研究證明其對(duì)腎臟是否有保護(hù)作用，這說(shuō)明選擇性PPARγ調(diào)節(jié)劑有著巨大潛力[28]。

PPARγ激動(dòng)劑對(duì)腎臟疾病起到一定的保護(hù)作用，但其機(jī)制尚未完全清楚。雖然RSG可舒張血管，影響血流動(dòng)力學(xué)，但總體來(lái)看RSG對(duì)腎臟起到良好的保護(hù)作用，可能不是通過(guò)單純的改善血流動(dòng)力學(xué)來(lái)緩解腎臟損害。有研究者稱未來(lái)的研究應(yīng)該通過(guò)研究噻唑烷二酮類對(duì)腎臟相關(guān)終點(diǎn)的影響來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題，這將有助于定位真正適合PPARγ治療的腎臟疾病患者類型[29]。一些衍生物或雙重PPAR激動(dòng)劑也有可能在規(guī)避不良反應(yīng)的同時(shí)有特定的適應(yīng)人群。噻唑烷二酮類藥物作為一種成熟藥物，若要考慮直接應(yīng)用于AKI，則需要尤其注意劑量和攝入方式，以減輕不良反應(yīng)對(duì)患者的危害，這需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，羅格列酮作為PPARγ激動(dòng)劑，對(duì)AKI有預(yù)保護(hù)作用，但要考慮直接將其應(yīng)用于AKI患者，還需要對(duì)劑量和適應(yīng)人群做更精準(zhǔn)的研究，因此選擇性PPARγ調(diào)節(jié)劑可能是潛在的研究方向。