崔皓鈞，王文奕，李巖，劉琳，馬書(shū)榮

(東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱 150040)

0 引言

在世界范圍內(nèi)鹽堿土的面積約占陸地總面積的10%，鹽堿地分布在干旱的荒漠和半荒漠地區(qū)，還存在于沿海及灌溉地區(qū)[1]。我國(guó)具有9 913萬(wàn)hm2的鹽堿地，在東部的沿海地區(qū)、西北干旱地區(qū)、東北平原地區(qū)均有分布[2-3]。土壤鹽堿化限制農(nóng)業(yè)發(fā)展，威脅生態(tài)環(huán)境[4-5]。鹽堿土中大量的鹽離子毒害植物，使植物生長(zhǎng)發(fā)育停滯，植物萎蔫加速。土壤中過(guò)量的鹽堿離子，也會(huì)使土壤的肥力減弱[6-7]。現(xiàn)如今，如何高效地利用鹽堿地，發(fā)揮最大的生態(tài)效益，促進(jìn)農(nóng)林業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，是首要解決的任務(wù)。

木霉菌(Trichoderma)是世界上廣泛分布的絲狀真菌[8]。木霉菌可以提高植物抗病性，拮抗植物病原菌，還可以在鹽堿脅迫下，減弱鹽堿離子對(duì)植物的毒害作用，提高植物耐鹽性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。木霉菌介導(dǎo)的植物耐鹽性已在多種植物中得到證實(shí)，如Zhao等[9]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉(Trichodermaasperellum)Q1對(duì)鹽脅迫下黃瓜生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，結(jié)果表明該菌株具有很好的溶解磷酸鹽能力，使黃瓜幼苗葉片中吲哚乙酸(IAA)、赤霉酸(GA)和脫落酸(ABA)的水平增加，同時(shí)植株的根系生長(zhǎng)和根系活力也增加。Contreras等[10]發(fā)現(xiàn)綠色木霉(Trichodermavirens)和深綠木霉(Trichodermaatroviride)在正常和鹽條件下都能促進(jìn)擬南芥(Arabidopsis)生長(zhǎng)，使擬南芥的脫落酸、L-脯氨酸和抗壞血酸水平增加，同時(shí)還可以提高擬南芥的IAA水平以及抗氧化能力。可見(jiàn)，通過(guò)分離篩選獲得木霉菌，作用于植物，可以作為提高植物抗鹽堿性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的重要手段。

本研究旨在從鹽堿地蒙古柳(Salixlinearistioularis)側(cè)根分離出長(zhǎng)枝木霉菌，通過(guò)鹽堿處理及接菌實(shí)驗(yàn)，分別從生物量、生理生化指標(biāo)及光合作用等幾個(gè)方面，探討了長(zhǎng)枝木霉菌對(duì)水稻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，分析了長(zhǎng)枝木霉菌對(duì)水稻的解鹽促生功能，為進(jìn)一步研究和利用長(zhǎng)枝木霉菌緩解鹽堿脅迫促進(jìn)植物生長(zhǎng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：本試驗(yàn)所采用的水稻品種為長(zhǎng)白9號(hào)。

長(zhǎng)枝木霉菌株：從黑龍江省松嫩平原鹽堿地上自然生長(zhǎng)的蒙古柳側(cè)根分離、純化獲得，并進(jìn)行分子鑒定，GeneBank登錄號(hào)NR120298.1。

供試土壤：園藝土與蛭石以3∶1的比例混合，裝入滅菌袋，121 ℃，60 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

將長(zhǎng)枝木霉菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃，黑暗培養(yǎng)7 d至完全產(chǎn)孢，用槍頭刮取培養(yǎng)基上的菌絲和孢子，放入無(wú)菌水中，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，制成孢子懸浮液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度，使?jié)舛日{(diào)至2×108cfu/mL。

1.2.2 種子萌發(fā)處理

挑選籽粒飽滿，大小合適的水稻種子，先用75%酒精消毒8～10 min，無(wú)菌水多次清洗，再用5%的次氯酸鈉溶液消毒10～15 min，無(wú)菌水多次清洗，得到無(wú)菌水稻種子。將無(wú)菌處理種子放入2×108cfu/mL的孢子懸浮液中，浸泡6 h，對(duì)照組用無(wú)菌水浸泡6 h。之后分別將種子放在無(wú)菌水、100 mmol/L NaCl溶液、30 mmol/L NaHCO3溶液[11]中，每板20粒種子，3個(gè)重復(fù)。在第2天時(shí)，測(cè)定水稻種子的發(fā)芽勢(shì)。在第3天時(shí)，測(cè)定水稻種子的發(fā)芽率。培養(yǎng)后第7天，每個(gè)處理取5粒正常發(fā)芽的種子測(cè)定其胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽第3天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100；

發(fā)芽勢(shì)=發(fā)芽前2天正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)。

1.2.3 盆栽試驗(yàn)

將無(wú)菌處理后的水稻種子轉(zhuǎn)移至無(wú)菌培養(yǎng)皿中催芽3 d。3 d后挑選長(zhǎng)勢(shì)相同的種子，移入盆缽中，每盆種植5粒種子。試驗(yàn)組每5 d，用20 mL孢子懸浮液澆灌于幼苗根部，對(duì)照組和試驗(yàn)組均每3 d澆一次20 mL的鹽堿處理液，剩余2次澆灌蒸餾水20 mL[12]。

1.2.4 幼苗生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

鹽堿脅迫處理水稻45 d后，將水稻植株連根取出，分別測(cè)量水稻的株高、地上部分干鮮重、地下干鮮重、根長(zhǎng)和葉綠素含量。

1.2.5 生理指標(biāo)的測(cè)定

過(guò)氧化氫酶的測(cè)定采用過(guò)氧化氫還原法。過(guò)氧化物酶的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法。超氧化物歧化酶采用氮藍(lán)四哇法測(cè)定。丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定[13]。將水稻葉片擦凈剪碎，依次放入三氯乙酸溶液，獲得MDA提取液，加入硫代巴比妥酸溶液，沸水浴，離心。在比色皿中，用紫外分光光度計(jì)分別在450、532、600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值并計(jì)算含量。

1.2.6 光合參數(shù)的測(cè)定

采用便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)(LI-6400)測(cè)定水稻葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)，設(shè)置光照強(qiáng)度為1 000 μmol/(m2·s)，固定系統(tǒng)內(nèi)CO2濃度(體積分?jǐn)?shù)，下同)為405 μL/L。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016對(duì)水稻的各項(xiàng)脅迫指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理作圖，取5次重復(fù)的平均值，用SPSS19.0采用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)的影響

在鹽堿條件下，施用長(zhǎng)枝木霉菌孢子懸浮液處理水稻種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，處理3 d，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。如圖1所示，與對(duì)照組相比，無(wú)菌水條件下，長(zhǎng)枝木霉菌顯著提升水稻種子的發(fā)芽率，提升32%。鹽堿脅迫能夠顯著降低水稻種子發(fā)芽率，抑制水稻種子發(fā)芽，發(fā)芽率僅達(dá)到75%和53%。接菌后，在堿脅迫下，長(zhǎng)枝木霉菌提升水稻種子的發(fā)芽率為18%。而在鹽脅迫下，種子發(fā)芽率顯著提高，提升25%。證明長(zhǎng)枝木霉菌能夠有效緩解鹽堿脅迫對(duì)種子發(fā)芽的抑制。處理2 d，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)。無(wú)菌水條件下，長(zhǎng)枝木霉菌提升水稻種子的發(fā)芽勢(shì)為0.06。而在堿脅迫下，長(zhǎng)枝木霉菌提升水稻種子的發(fā)芽勢(shì)為0.03。而在鹽脅迫下，長(zhǎng)枝木霉菌提升水稻種子的發(fā)芽勢(shì)為0.2。由此可見(jiàn)，在鹽堿脅迫下，采用長(zhǎng)枝木霉菌孢子懸浮液處理后可減輕鹽堿離子對(duì)種子萌發(fā)的抑制，提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。

**表示P<0.01;***表示P<0.001；n.s.表示差異不顯著。白色柱表示未接種對(duì)照；黑色柱表示接種長(zhǎng)枝木霉菌株。

水稻種子培養(yǎng)7 d，測(cè)定水稻的胚根、胚芽。接種菌株后，促進(jìn)水稻種子胚芽和胚根的生長(zhǎng)，結(jié)果如圖2和圖3所示，無(wú)菌水條件下，胚芽增長(zhǎng)14.2%，胚根增長(zhǎng)38.9%。在鹽條件下，胚芽增長(zhǎng)50%，胚根增長(zhǎng)50%。堿條件下，胚芽增長(zhǎng)33.3%，胚根增長(zhǎng)50%。與CK相比，種子的胚芽、胚軸顯著提高。綜上可知，施用長(zhǎng)枝木霉菌孢子懸浮液可以有效緩解鹽堿脅迫對(duì)水稻發(fā)芽帶來(lái)的抑制作用，促進(jìn)水稻生長(zhǎng)。

2.2 生物量的影響

在鹽堿脅迫條件下，長(zhǎng)枝木霉菌對(duì)水稻幼苗生物量的影響，見(jiàn)表1。處理45 d后，在鹽堿脅迫條件下，植株受到鹽堿的作用，生長(zhǎng)受到抑制。但接菌后，水稻的株高、根長(zhǎng)、鮮重和干重均有所增加。無(wú)菌水條件下，接菌后，水稻的株高增加10.4%，水稻的根長(zhǎng)增加21.2%，水稻的地下干重增加15.3%，水稻的地下鮮重增加17.4%，水稻的地上干重增加23%，水稻的地上鮮重增加17.4%。在堿脅迫條件下，接菌后，水稻的株高增加13.7%，水稻的根長(zhǎng)增加6.7%，水稻的地下干重增加30%，水稻的地下鮮重增加6.7%，水稻的地上干重增加17%，水稻的地上鮮重增加10.8%。在鹽脅迫條件下，水稻的株高增加2.3%，水稻的根長(zhǎng)增加14%，水稻的地下干重增加42%，水稻的地下鮮重增加14.7%，水稻的地上干重增加17%，水稻的地上鮮重增加5.4%。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種長(zhǎng)枝木霉菌孢子懸浮液后，均不同程度地促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)，對(duì)水稻地上部分促生效果較為顯著。

第一行為無(wú)菌水、NaHCO3、NaCl; 第二行為水+長(zhǎng)枝木霉菌、NaHCO3+長(zhǎng)枝木霉菌、NaCl+長(zhǎng)枝木霉菌。

**表示P<0.01;***表示P<0.001。白色柱表示未接種對(duì)照；黑色柱表示接種長(zhǎng)枝木霉菌株。

2.3 葉綠素含量的影響

光合作用是植物重要的生命活動(dòng)，植物的光合作用為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供養(yǎng)分和信息。鹽堿脅迫會(huì)降解葉綠素，降低植物的光合作用效率[14]。如圖4所示，在鹽堿脅迫條件下，接菌后，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量均升高。接菌后，在無(wú)菌水條件下，水稻葉片葉綠素a升高18.9%，葉綠素b升高31.8%，總?cè)~綠素升高21.6%。在鹽脅迫條件下，水稻葉片葉綠素a升高25.3%，葉綠素b升高10.3%，總?cè)~綠素升高18.4%。在堿脅迫條件下，水稻葉片葉綠素a升高29.6%，葉綠素b升高16.3%，總?cè)~綠素升高22.9%，綜上所述，接種長(zhǎng)枝木霉菌可增加水稻葉片中的葉綠素含量。

表1 長(zhǎng)枝木霉菌對(duì)鹽堿脅迫下水稻幼苗生物量的影響

***表示P<0.001；**表示P<0.01;*表示P<0.05。白色柱表示未接種對(duì)照；黑色柱表示接種長(zhǎng)枝木霉菌株。

2.4 水稻葉片丙二醛含量的影響

丙二醛(MDA)的存在加劇膜的損傷程度，常作為植物受到逆境脅迫的指標(biāo)。接菌后，水稻幼苗葉片內(nèi)丙二醛含量的變化，如圖5所示。在鹽堿脅迫下，水稻葉片丙二醛的含量上升。在無(wú)菌水條件下，降低效果最明顯，下降47.5%。在鹽脅迫下，下降11.9%。在堿脅迫下，菌株使MDA上升2.5%。

n.s.表示差異不顯著;*表示P<0.05。白色柱表示未接種對(duì)照；黑色柱表示接種長(zhǎng)枝木霉菌株。

2.5 鹽堿脅迫對(duì)水稻酶活性的影響

當(dāng)植物受到鹽堿脅迫時(shí)，會(huì)分泌大量的抗氧化物質(zhì)保護(hù)自身，防止活性氧的積累[13]。如圖6所示，在鹽堿脅迫下，與對(duì)照相比，接菌后水稻葉片內(nèi)酶含量發(fā)生變化。在無(wú)菌水條件下，接菌后水稻葉片過(guò)氧化物酶(POD)的含量上升38.7%，過(guò)氧化氫酶(CAT)的含量上升19.9%，超氧化物歧化酶(SOD)的含量上升20.2%。在鹽脅迫條件下，水稻葉片過(guò)氧化物酶含量下降17.9%，過(guò)氧化氫酶含量下降11.2%，超氧化物歧化酶含量下降5.7%。在堿脅迫條件下，水稻葉片過(guò)氧化物酶含量下降27.9%，過(guò)氧化氫酶21.7%，超氧化物歧化酶下降19.2%。綜上所述，在無(wú)菌水條件下，接菌后可使酶的活性提高。在鹽堿脅迫條件下，接菌后酶的活性下降。

2.6 水稻葉片光合參數(shù)的影響

長(zhǎng)枝木霉菌對(duì)水稻幼苗光合參數(shù)的影響，如圖7所示，鹽堿脅迫，使水稻的光合參數(shù)下降。在鹽堿脅迫條件下，接菌后，凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、葉片胞間CO2總量均有不同程度的升高。接菌后，在無(wú)菌水條件下，水稻葉片光合速率上升13.2%，蒸騰速率上升31.8%，氣孔導(dǎo)度上升6.8%，胞間CO2的含量上升22.2%。在鹽脅迫條件下，凈光合速率含量上升13.8%，蒸騰速率含量上升41.8%，氣孔導(dǎo)度含量上升24.6%，胞間CO2含量上升9.4%。在堿脅迫條件下，凈光合速率含量上升13.5%，蒸騰速率含量上升17.9%，氣孔導(dǎo)度含量上升65.3%，胞間CO2含量上升18.4%。

*表示P<0.05;**表示P<0.01；***表示P<0.001。白色柱表示未接種對(duì)照；黑色柱表示接種長(zhǎng)枝木霉菌株。

**表示P<0.01; ***表示P<0.001。白色柱表示未接種對(duì)照；黑色柱表示接種長(zhǎng)枝木霉菌株。

3 討論

木霉菌是一種有益真菌，普遍存在于土壤、植物根際和植物組織中，是重要的微生物資源[15-16]。木霉菌能夠產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)，提高植物抗病性，同時(shí)也能產(chǎn)生植物激素，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[16-17]。目前人們對(duì)木霉菌的研究主要集中在生物防治方面，而在鹽堿條件下，木霉菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)展開(kāi)的研究較少。本研究從松嫩平原鹽堿地蒙古柳根部分離出長(zhǎng)枝木霉菌，并分析長(zhǎng)枝木霉菌對(duì)植物的解鹽促生能力。發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)枝木霉菌在生物量、生理生化、光合參數(shù)等方面增強(qiáng)了水稻幼苗對(duì)鹽堿脅迫的耐受性，能夠促進(jìn)水稻生長(zhǎng)。

本研究中，進(jìn)行3組6個(gè)處理，分別為水、水+菌、鹽、鹽+菌、堿、堿+菌。以水、鹽、堿分別作為每組的對(duì)照。在無(wú)菌水和鹽堿條件下，長(zhǎng)枝木霉菌接種水稻種子后，顯著提高水稻種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，且在鹽堿條件下經(jīng)長(zhǎng)枝木霉菌處理后水稻種子的發(fā)芽率接近于無(wú)菌水條件下，能夠基本消除鹽堿脅迫對(duì)水稻種子萌發(fā)的抑制作用，提高水稻種子的發(fā)芽能力。接種長(zhǎng)枝木霉菌后水稻地下部分和地上部分的干鮮重都得到了顯著的提升，說(shuō)明長(zhǎng)枝木霉菌緩解了鹽堿離子對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的抑制作用；還發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫顯著降低水稻幼苗中的葉綠素含量，但在接種長(zhǎng)枝木霉菌后，水稻幼苗中的葉綠素含量上升。由此可見(jiàn)，長(zhǎng)枝木霉菌顯著促進(jìn)水稻幼苗的生長(zhǎng)，并幫助其在鹽堿脅迫下積累光合產(chǎn)物，為植株自身的生理活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 Mastouri等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在非生物脅迫下，哈茨木霉(Trichodermaharzionnum)T22通過(guò)減少滲透脅迫和脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量，從而緩解氧化性損傷,同時(shí)還可以提高種子的萌發(fā)率。張樹(shù)武等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，長(zhǎng)枝木霉T6菌株處理小麥種子7 d后，小麥種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)提高，其種子胚芽長(zhǎng)度的增長(zhǎng)率為9%～34%，胚根長(zhǎng)度的增長(zhǎng)率為9%～31%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)濃度100倍和50倍的深綠木霉發(fā)酵液對(duì)白三葉幼苗的葉綠素、抗性相關(guān)酶活性有較為明顯的提升，且不同濃度的發(fā)酵液對(duì)白三葉草幼苗的影響不同。廉華等[22]發(fā)現(xiàn)合適濃度的棘孢木霉菌劑能促進(jìn)黃瓜幼苗的形態(tài)建成和物質(zhì)積累，也可增加葉片中總?cè)~綠素含量和根系活力等指標(biāo)。陳伯清等[23]將木霉菌孢子懸浮液作用于番茄幼苗根際后，發(fā)現(xiàn)番茄幼苗葉片中葉綠素含量上升，促進(jìn)番茄光合作用。這些研究與本研究一致。

鹽堿脅迫會(huì)使細(xì)胞內(nèi)積累大量的活性氧(ROS)，氧化損傷細(xì)胞內(nèi)的膜脂、蛋白質(zhì)等。為了抵御鹽堿脅迫對(duì)植物的傷害，植物進(jìn)化出有效的抗氧化系統(tǒng)，防止植物受到氧化損傷。人們常用抗氧化酶來(lái)評(píng)價(jià)植物的氧化還原狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)菌水條件下，長(zhǎng)枝木霉菌使各抗氧化酶的活性提升，有利于植物體內(nèi)活性氧的清除。在鹽堿脅迫下，長(zhǎng)枝木霉菌使各種抗氧化酶的活性下降，說(shuō)明其有效緩解鹽堿離子對(duì)幼苗的毒害作用。丙二醛含量反映細(xì)胞質(zhì)膜受損傷的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，接菌后，丙二醛明顯下降，說(shuō)明受氧化脅迫的幼苗生長(zhǎng)得到緩解。李艷娟等[24]通過(guò)試驗(yàn)證明哈茨木霉與綠色木霉2種木霉菌混合作用于杉木幼苗，可提高杉木幼苗過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶活性，降低了丙二醛含量，顯著提高幼苗的抗逆性。尹大川等[25]發(fā)現(xiàn)綠木霉T43接種樟子松苗木后，過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性顯著上升，表現(xiàn)出較高的酶活性，可以提高植物的抗逆性。這些研究結(jié)果與本研究一致。

本研究中，在鹽堿條件下，水稻幼苗用長(zhǎng)枝木霉孢子懸浮液處理后，與對(duì)照組相比，光合參數(shù)指標(biāo)得到提升，促進(jìn)植物光合作用。此結(jié)果與他人研究一致，周曉馥等[26]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌液灌根處理黃瓜幼苗，黃瓜植株的總根長(zhǎng)、根尖數(shù)、分支數(shù)明顯增加。葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度等明顯提高，促進(jìn)植物的光合作用。陳雙臣等[27]發(fā)現(xiàn)木霉菌可以提高番茄的光合作用，可提高番茄葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度等指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)枝木霉菌可以提高水稻的光合指標(biāo)等參數(shù)來(lái)增加光合作用，與他人的研究一致。說(shuō)明長(zhǎng)枝木霉菌通過(guò)提升水稻葉片的光合參數(shù)來(lái)促進(jìn)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究從蒙古柳的側(cè)根中分離出長(zhǎng)枝木霉菌，并對(duì)其解鹽促生能力進(jìn)行深入研究。在鹽堿條件下，長(zhǎng)枝木霉菌提高水稻種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，促進(jìn)水稻種子胚根和胚芽的發(fā)育，提高水稻幼苗的株高、根長(zhǎng)等各項(xiàng)生物量指標(biāo)。在生理指標(biāo)方面，長(zhǎng)枝木霉菌使水稻葉片中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的含量下降。在光合參數(shù)方面，接菌后水稻葉片凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度都得到了顯著的提高。說(shuō)明長(zhǎng)枝木霉菌能減少鹽堿脅迫對(duì)植物的傷害，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化體系，提高水稻對(duì)鹽堿脅迫的抵御能力。