李海濤 林勁 韓麗珍 王裕岱 滕麗峰

(海南省人民醫(yī)院(海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院) 1心血管內(nèi)科,海南 海口 570311;2病案室)

糖尿病(DM)是目前臨床高發(fā)的慢性疾病，隨疾病發(fā)展可出現(xiàn)多種并發(fā)癥，威脅患者生命安全。其中糖尿病神經(jīng)病變(DNP)屬于DM常見并發(fā)癥，患者主要癥狀表現(xiàn)為活動(dòng)能力下降、下肢感覺障礙等，甚至部分患者因控制不佳需截肢〔1,2〕。DNP早期癥狀一般為下肢刺痛感、麻刺感或手腳麻木等，因癥狀特異性差往往被忽視。研究指出，DNP癥狀的發(fā)生與神經(jīng)末梢病變有關(guān)，受疾病影響神經(jīng)末梢軸突可塑性降低，導(dǎo)致神經(jīng)再生困難〔3〕。DM患者最顯著表現(xiàn)為糖代謝失衡，而隨機(jī)體糖代謝失衡，多種激素介質(zhì)分泌失調(diào)，使遠(yuǎn)端神經(jīng)纖維生長(zhǎng)受限。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(NRG)-1屬于神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白家族，其胞外結(jié)構(gòu)域與表皮生長(zhǎng)因子相似，但是其具有較為保守的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NRG-1-ICD)。不過(guò)NRG-1對(duì)DM背根神經(jīng)節(jié)的作用未見相關(guān)報(bào)道。本研究以1型DM大鼠為研究對(duì)象，探究NRG-1對(duì)DM背根神經(jīng)節(jié)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取成年SPF級(jí)雄性健康大鼠，體重180～210 g，平均體重(200.5±2.4)g，所有大鼠購(gòu)自賽業(yè)生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 青鏈霉素混合液、鏈脲佐菌素(STZ)、谷氨酰胺購(gòu)于青島浩賽科技股份有限公司；NRG-1、胰酶粉購(gòu)于ProSpec公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)于北京百普賽斯生物科技有限公司；即用型正常山羊血清購(gòu)于上海昊海生物科技有限公司；生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP)-43一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、整合素(ITG)B1一抗、磷酸化黏著斑激酶(p-FAK)一抗、Tau 一抗均購(gòu)于CST公司；微管蛋白(Tubulin)-βⅢ 一抗購(gòu)于Proteintech 公司；局部黏著斑激酶(FAK)一抗、蛋白激酶B(AKT)一抗、Tau 一抗均購(gòu)于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于上海鼎科科學(xué)儀器有限公司；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡購(gòu)于上海萬(wàn)衡精密儀器有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)板購(gòu)于美國(guó) Thermo 公司；多功能酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀購(gòu)于貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司；定量PCR儀購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；共聚焦顯微鏡購(gòu)于上海聚儀檢測(cè)科技有限公司。

1.3造模 進(jìn)行DM大鼠誘導(dǎo)，采用STZ法進(jìn)行，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行1 w的適應(yīng)性飼養(yǎng)，在進(jìn)行DM誘導(dǎo)前需禁食12 h，誘導(dǎo)當(dāng)天對(duì)所有大鼠進(jìn)行稱重，并進(jìn)行標(biāo)記，抽取尾靜脈血，對(duì)其血糖濃度進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行檸檬酸鈉緩沖液配制，將STZ按65 mg/kg的劑量為大鼠進(jìn)行腹腔注射。對(duì)照組大鼠檸檬酸緩沖液注射劑量根據(jù)其重量進(jìn)行計(jì)算。體重及尾靜脈血糖濃度檢測(cè)時(shí)間為完成注射72 h后，當(dāng)大鼠持續(xù)1 w血糖濃度在16.8 mmol/L以上時(shí)，則確定本次DM大鼠模型造模成功。

1.4分離培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞 處死DM大鼠及對(duì)照組大鼠，斷頭后將脊柱取出，使用含雙抗的平衡鹽溶液(D-Hank)進(jìn)行3次沖洗，使近端的椎管口進(jìn)一步暴露，棘突向上，橫斷剪開與椎管二分之一處，該操作過(guò)程中注意保護(hù)背根神經(jīng)節(jié)，分離脊髓雙側(cè)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，在顯微鏡下進(jìn)行解剖，并使用顯微剪剪碎處理好的DRG組織，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12和1×trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)1 ml，經(jīng)過(guò)濾、離心處理，棄上清后進(jìn)行重懸，計(jì)數(shù)細(xì)胞后將阿糖胞苷加入。

1.5免疫熒光檢測(cè) 對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，步驟如下：①爬片固定；②細(xì)胞通透；③封閉；④一抗孵育；⑤二抗孵育；⑥細(xì)胞核染色；⑦制片；⑧拍照。

1.6Western印跡檢測(cè) 步驟如下：①制備蛋白樣品；②測(cè)蛋白濃度；③蛋白變性；④配膠；⑤電泳；⑥轉(zhuǎn)膜；⑦封閉、抗體孵育；⑧曝光。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 步驟如下：①提取樣本細(xì)胞總RNA；②RNA濃度與純度分析；③cDNA合成；④PCR引物設(shè)計(jì)與合成；⑤PCR。引物ITGB1上游：5′-ATGCTATOCCAACTACACTGGC-3′，下游:5′-CACCAAGGCAGGTCTGACAG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游:5′-CGCTAACATCAAATGGOGTG-3′，下游5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′。

1.8siRNA轉(zhuǎn)染 合成siRNA并將合成的siRNA置于-20℃冰箱中保存，期間注意避光。在DMEM/F12中對(duì)提取DM的DRHs細(xì)胞進(jìn)行4～6 h培養(yǎng)，將樣本按照隨機(jī)方法將DM大鼠DRGs細(xì)胞隨機(jī)分為4組，第1組為空白對(duì)照組(DM組)，第2組在培養(yǎng)基中加入濃度為20 ng/ml的NRG-1(DM+N組)，第3組在第2組基礎(chǔ)上加入ITGB1-siRNA(DM+N+si組)，第4組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加入ITGB1-siRNA (DM+si組)。每組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取無(wú)菌的EP管進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，加入對(duì)應(yīng)試劑，待DRGs細(xì)胞完成貼壁后將雙抗的Neurobasal/B27 培養(yǎng)液加入進(jìn)行72 h孵育。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1鑒定DRG神經(jīng)元細(xì)胞 外形呈梭形或多角形，胞體較小，無(wú)突起，折光度差，邊緣毛躁的細(xì)胞可能是成纖維細(xì)胞。經(jīng)染色后，神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)為綠色，細(xì)胞核為藍(lán)色，在將B、C圖進(jìn)行融合后，可明顯觀察到孤立藍(lán)色著色點(diǎn)，猜測(cè)該類染色細(xì)胞可能為雜質(zhì)細(xì)胞，對(duì)于染色細(xì)胞核占比進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定本次研究細(xì)胞純度在90%以上，見圖1。

A:顯微鏡下神經(jīng)元細(xì)胞；B：Tubulin-βⅢ特異性染色的神經(jīng)元細(xì)胞；C：染色后的神經(jīng)元細(xì)胞核；D：B和C兩圖融合后成像

2.2ITGB1、AKT、FAK在DM大鼠DRGs細(xì)胞中的表達(dá) NC組為大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞，DM組為DM大鼠神經(jīng)元細(xì)胞。DM組神經(jīng)元細(xì)胞ITGB1mRNA含量明顯低于NC組(P<0.05)，DM組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ITGB1、FAK、p-FAK及AKT表達(dá)均明顯低于NC組(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 ITGB1、AKT、FAK在DM大鼠DRGs細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 兩組ITGB、FAK、AKT蛋白表達(dá)

2.3不同NRG-1濃度對(duì)神經(jīng)元突觸再生能力的影響 NRG-1可使GAP-43與Tau表達(dá)上調(diào)，與0 ng/ml比，20 ng/ml濃度時(shí)其上調(diào)效果最為明顯，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NRG-1可促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，且20 ng/ml濃度時(shí)其促進(jìn)作用作為明顯，各組間軸突長(zhǎng)度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖3、圖4。

表2 不同NRG-1濃度對(duì)神經(jīng)元突觸再生能力的影響對(duì)比

圖3 各組細(xì)胞Tubulin-βⅢ軸突長(zhǎng)度免疫熒光染色(μm，×50)

1～5:0 ng/ml NRG-1組、10 ng/ml NRG-1組、20 ng/ml NRG-1組、50 ng/ml NRG-1組、100 ng/ml NRG-1組

2.4在軸突再生過(guò)程中ITGB1/FAK/AKT通路作用分析 DM+N組、DM+N+si組ITGB1、FAK、p-FAK、AKT及Tubulin-βⅢ表達(dá)明顯高于DM組，而DM+si組明顯低于DM組(P<0.05)，見圖5、表3。

圖5 各組ITGB1/FAK/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 各組軸突再生過(guò)程中ITGB1/FAK/AKT通路作用對(duì)比

3 討 論

DM最常見的并發(fā)癥包含DPN，隨疾病發(fā)展，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。對(duì)單純DM及DNP患者進(jìn)行神經(jīng)活檢，發(fā)現(xiàn)DNP患者神經(jīng)纖維數(shù)量明顯降低，認(rèn)為神經(jīng)纖維丟失是導(dǎo)致DNP發(fā)病的關(guān)鍵因素〔4〕。有研究指出，在對(duì)DNP患者神經(jīng)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，該類患者存在神經(jīng)周圍血管基底膜增厚及神經(jīng)內(nèi)膜血管缺損情況，認(rèn)為在DM患者中存在較為嚴(yán)重的軸突萎縮或節(jié)段性脫髓鞘情況〔5〕。TIG由α和β亞基組成，可對(duì)細(xì)胞表面配體或細(xì)胞外基質(zhì)配體進(jìn)行識(shí)別。在大鼠感覺神經(jīng)中存在ITGβ1廣泛表達(dá)情況，可在結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)后發(fā)揮生物效應(yīng)。ITG的眾多配體中包含層黏連蛋白，可使ITG亞基的mRNA上調(diào)，對(duì)軸突中相應(yīng)蛋白的免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響，在神經(jīng)突觸再生過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用〔6〕。有研究指出，周圍神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘化速度會(huì)因ITGβ1等表達(dá)升高而呈現(xiàn)速度加快情況〔7〕。也有報(bào)道指出，缺乏α7亞基會(huì)降低小鼠外周神經(jīng)損傷后的再生能力〔8〕。本研究結(jié)果提示，ITGB1/FAK/AKT通路與DM神經(jīng)病變存在密切聯(lián)系。

ErbB受體酪氨酸激酶(RTK)與ITG之間可產(chǎn)生相互作用，根據(jù)其作用方式不同可將其分為兩種情況，一種是相互之間的協(xié)作關(guān)系，RTK及ITG在激活過(guò)程中均需要相應(yīng)配體的支持，然后兩者下游共同靶點(diǎn)FAK對(duì)兩者之間的協(xié)作進(jìn)行介導(dǎo)。已有大量研究指出，ErbB2和ITG在腫瘤細(xì)胞中的串?dāng)_關(guān)系。過(guò)表達(dá)的ErbB2受體可導(dǎo)致上皮腫瘤細(xì)胞系中α5β1表達(dá)升高，進(jìn)而對(duì)于細(xì)胞存活起到改善作用〔9～11〕。有報(bào)道指出，ErbB2通過(guò)激活轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞中的磷脂酰肌酸-3激酶(PI3K)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白(mTOR)和蛋白激酶(PK)B信號(hào)通路，影響整聯(lián)蛋白β1活性，使膠原蛋白表面的黏附和擴(kuò)散受損〔12〕。ErbB2依賴的DNA合成及翻譯可收到β4 ITG的調(diào)節(jié)。對(duì)于FAK及Src的特異性磷酸化NRG-1β可以起到誘導(dǎo)作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的產(chǎn)生，對(duì)于心肌細(xì)胞伸長(zhǎng)縱向的片狀偽足可以起到促進(jìn)作用〔13〕。本研究結(jié)果顯示，外源性NRG-1可使DM大鼠DRGs細(xì)胞中的ITGB1及相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，對(duì)于神經(jīng)元軸突再生起到促進(jìn)作用。GAP-43可參與突觸前囊泡功能，對(duì)于軸突重建及結(jié)構(gòu)可塑起到促進(jìn)作用，而Tau蛋白在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡及神經(jīng)細(xì)胞支架蛋白形成過(guò)程中均發(fā)揮著非常重要的作用。在大鼠和兔眼內(nèi)進(jìn)行43 kD多肽注射，8 d后可在遠(yuǎn)端神經(jīng)束內(nèi)檢測(cè)到，且軸突向外生長(zhǎng)與GAP-43 mRNA分布或蛋白質(zhì)表達(dá)存在密切聯(lián)系，而這與突觸前重排和神經(jīng)元損傷有著密切聯(lián)系〔14，15〕。GAP-43在高Ca2+環(huán)境內(nèi)可被PKC磷酸化，在與其他蛋白進(jìn)行反應(yīng)后，影響囊泡循環(huán)及軸突伸長(zhǎng)。Tau是一種神經(jīng)元軸突微管裝飾蛋白，對(duì)于運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的軸突運(yùn)輸具有調(diào)節(jié)作用。高度激活的磷酸化Tau會(huì)導(dǎo)致軸突轉(zhuǎn)運(yùn)受損，圍觀動(dòng)態(tài)失衡。有報(bào)道指出，對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠進(jìn)行淫羊藿次苷Ⅱ治療，可有效提高Tau蛋白表達(dá)，促進(jìn)微管形成，對(duì)于神經(jīng)再生微環(huán)境可以起到調(diào)節(jié)作用〔16〕。并且在研究中指出，在完成軸突再生后Tau表達(dá)逐漸恢復(fù)至正常水平。本研究在對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行NRG-1刺激時(shí)發(fā)現(xiàn)，NRG-1可促進(jìn)大鼠神經(jīng)突觸生長(zhǎng)，且20 ng/ml為最佳濃度。NRG刺激可使DRGs細(xì)胞軸突生長(zhǎng)能力增強(qiáng)。

綜上，對(duì)于1型DM大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)NRG-1干預(yù)可起到促進(jìn)作用，猜測(cè)NRG-1可能是通過(guò)調(diào)節(jié)ITGB1/FAK/AKT通路發(fā)揮作用。