孫向茹，蔡炳，張麗麗，劉蔚菁，劉海鵬，劉奇志

1.廣州市番禺區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 511400；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 510080

不育癥影響著全球大約1/6的夫婦，其中因男性因素引起的不孕約占50%，且男性不孕患者逐年增多[1]。精索靜脈曲張、隱睪癥、性腺機(jī)能減退、遺傳因素及病毒感染均可能導(dǎo)致男性不育，尤其是病毒感染對男性生育力的影響越來越引起學(xué)者的關(guān)注。我國是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的高發(fā)區(qū)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HBV作為非單一的嗜肝病毒，不僅可以感染肝細(xì)胞導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化及肝癌等相關(guān)疾病，而且可以通過血-睪屏障進(jìn)入男性生殖系統(tǒng)，進(jìn)而整合到人類精子細(xì)胞的染色體上[2-3]。因此，研究HBV感染與男性生殖的關(guān)系是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要問題之一。目前，關(guān)于HBV感染是否影響精液質(zhì)量、降低男性生育力還存在爭議[4-6]。既往的研究依賴的評價(jià)指標(biāo)主要是精子濃度、活力和正常精子形態(tài)等常規(guī)精液參數(shù)，由于HBV與男性生殖系統(tǒng)的交互作用存在于分子級別，導(dǎo)致常規(guī)精液參數(shù)評價(jià)存在一定的局限性。研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)精液參數(shù)正常的不育患者，在體外授精(in vitrofertilization，IVF)治療中也會(huì)發(fā)生受精率低下或完全不受精[7]。精漿生化參數(shù)是近年來發(fā)現(xiàn)的描述精子功能和受精能力等方面的指標(biāo)，也逐漸成為精液質(zhì)量和男性生育力評估的重要內(nèi)容，但是，目前有關(guān)HBV感染對精漿生化指標(biāo)影響的研究較少，尚不能全面評估HBV感染對精液質(zhì)量及男性生育力的影響。此外，由于HBV感染人體后機(jī)體的免疫反應(yīng)是不同的，導(dǎo)致人群中HBV感染的血清學(xué)模式也是多種多樣的，因此，不同HBV標(biāo)志物模式對男性精液質(zhì)量的影響是否存在差異是本文的研究重點(diǎn)。本研究旨在探討男性HBV感染及不同標(biāo)志物模式對精液常規(guī)參數(shù)及精漿生化指標(biāo)的影響，為評估HBV感染對精液質(zhì)量及男性生育力的影響提供更加全面的證據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年6月在廣州市番禺區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科接受第一次宮腔內(nèi)人工授精(intrauterineinsemination，IUI)治療的557例男性患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無明顯影響精液質(zhì)量的疾病、遺傳因素及生活習(xí)慣；(2)肝功能正常；(3)除HBV外，無其他細(xì)菌或病毒感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)精索靜脈曲張、隱睪癥、性腺機(jī)能減退及男性遺傳因素；(2)肝功能異常；(3)酗酒；(4)其他急、慢性傳染性疾病(如丙型肝炎、艾滋病及梅毒)；(5)支原體、衣原體感染。根據(jù)男方血清乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是否陽性分為HBV感染組和未感染組。再根據(jù)男方乙肝病毒五項(xiàng)分為不同標(biāo)志物模式組，乙肝五項(xiàng)均為陰性或僅HbsAb陽性設(shè)為對照組，選取病例數(shù)大于10例的乙肝標(biāo)志模式組與對照組進(jìn)行比較。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 一般臨床資料收集 回顧性收集患者的年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、肝功能檢測、飲酒史、傳染性疾病和感染性疾病等一般臨床資料。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測

1.2.2.1 乙肝病毒五項(xiàng)檢測 通過中山生物公司試劑盒使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測乙肝病毒五項(xiàng)(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb)。

1.2.2.2 精液常規(guī)參數(shù)檢測 禁欲3～7 d，手淫法取精后放37℃恒溫箱內(nèi)液化。嚴(yán)格按照世界衛(wèi)生組織(WHO)《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》第5版要求進(jìn)行檢測。精液體積采用稱重法，精子濃度及活力檢測采用計(jì)算機(jī)輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)(computer assisted sperm analysis，CASA)分析精液。精子形態(tài)學(xué)分析用Diff-Quik快速染色法，以正常形態(tài)百分率4%作為參考值下限。所有技術(shù)人員均進(jìn)行規(guī)范化培訓(xùn)并通過考核，并在本省組織的男科實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)評中各項(xiàng)檢測結(jié)果均在控。

1.2.2.3 精漿生化指標(biāo)檢測 精子頂體酶活性和精漿鋅含量檢測按照南京欣迪生物藥業(yè)工程有限公司提供的試劑盒的檢查方法，頂體酶活性檢測采用改良Kennedy法，精漿鋅含量檢測采用化學(xué)比色法。中性α-葡糖苷酶含量檢測采用深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供的檢測試劑盒(改良PAR法)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布和方差齊，采用M(P25，P75)表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或例(%)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1一般情況 557例男性患者中HBsAg陽性105例，HBsAg陰性452例。根據(jù)乙肝病毒五項(xiàng)檢測結(jié)果共有12種乙肝標(biāo)志物模式，構(gòu)成比中比例較高的模式依次為模式3、6和4；HBsAg陽性的感染模式有4種：模式1(小三陽)、2(大三陽)、7和11；除對照組外(模式3和4)，病例數(shù)大于10例的標(biāo)志物模式有7種，見表1。

表1 557例IUI人群中男性HBV感染標(biāo)志物模式流行病學(xué)情況Table 1 Epidemiology of HBV infection in 557 males following IUI treatment

2.2 HBV感染對精液常規(guī)參數(shù)和精漿生化指標(biāo)的影響 感染組和未感染組間的男方年齡和BMI指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組間的精液量、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)和正常精子形態(tài)百分率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。精漿生化指標(biāo)中，感染組的精漿鋅含量和頂體酶活性明顯低于未感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而兩組間的中性α-葡糖苷酶含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 HBV感染組與未感染組精液常規(guī)參數(shù)和精漿生化指標(biāo)比較[M(P25，P75)]Table2 Comparison on standard sperm parametersand seminal plasma biochemical parametersof maleswith and without HBV infection[M(P25,P75)]

2.3 不同標(biāo)志物模式對精液常規(guī)參數(shù)和精漿生化指標(biāo)的影響 基礎(chǔ)參數(shù)中，模式1組、5組和6組的男方年齡高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而各模式組的男性BMI指數(shù)和對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。常規(guī)精液參數(shù)中，模式6和9組間的精子濃度高于對照組，模式2組和9組間的前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)高于對照組，模式7組的精子正常形態(tài)百分率高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而其余參數(shù)與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。精漿生化指標(biāo)中，模式1組(小三陽)和2組(大三陽)的精漿鋅含量明顯低于對照組，而模式5組的精漿鋅含量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模式1組、2組和7組間的頂體酶活性與對照組比較有降低趨勢，但是均沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；所有標(biāo)志物模式組的中性α-葡糖苷酶含量與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同HBV感染標(biāo)志物模式組與對照組精液常規(guī)參數(shù)和精漿生化指標(biāo)比較[M(P25，P75)]Table 3 Comparison on standard sperm parameters and seminal plasma biochemical parameters of males with different HBV serostatus and their controls[M(P25,P75)]

3 討論

精液常規(guī)檢測是男性生育力初步評估的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)項(xiàng)目，精子濃度和精子總數(shù)等指標(biāo)反映精子的生成狀態(tài)，精子活力及前向運(yùn)動(dòng)率反映精子的運(yùn)動(dòng)能力，這些常規(guī)參數(shù)意義重大，但均存在波動(dòng)性大、穩(wěn)定性差、主觀性強(qiáng)等缺點(diǎn)。而基于化學(xué)比色法的精漿生化參數(shù)分析在精子功能和受精能力等方面提供了更加全面的信息，且更為客觀和穩(wěn)定，其中頂體酶活性、精漿鋅和中性α-葡糖苷酶是較為重要且臨床應(yīng)用比較廣泛的精漿生化指標(biāo)。精液常規(guī)檢查聯(lián)合精漿生化分析有助于對男性生育力進(jìn)行全面而精確的診斷及預(yù)后評估。我國HBV感染率約為10%，HBV感染對男性精液質(zhì)量及生育力的影響受到學(xué)者的關(guān)注。本研究在接受IUI治療的男性中發(fā)現(xiàn)了12種乙肝標(biāo)志物模式，通過分析HBV感染及不同標(biāo)志物模式對精液常規(guī)參數(shù)和精漿生化指標(biāo)的影響，全面而客觀地評估了HBV感染對男性精液質(zhì)量的影響。

一些研究者認(rèn)為男性HBV感染者的精子濃度、活力和正常精子形態(tài)百分率低于未感染者[4-5，8-9]，另一些研究者認(rèn)為HBV感染者與未感染者的精液常規(guī)參數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[6,10]。由此可見，目前關(guān)于HBV感染是否影響精液常規(guī)參數(shù)還存在一定爭議。本研究結(jié)果顯示，接受IUI治療的夫婦中男性HBsAg陽性率為18.85%，高于我國平均感染水平，提示HBV感染可能與男性生育力降低有關(guān)；但是，HBV感染組與未感染組的精液量、精子濃度、活力和正常精子形態(tài)百分率等常規(guī)參數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示HBV感染沒有對精液常規(guī)參數(shù)產(chǎn)生明顯不利的影響。此外，本研究將12種乙肝標(biāo)志物模式中病例數(shù)大于10例的7個(gè)模式組與對照組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，HBsAg-的標(biāo)志物模式中模式6組和9組間的精子濃度高于對照組，模式9組的前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)高于對照組；HBsAg+的標(biāo)志物模式中模式2組(大三陽)的前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)高于對照組，模式7組的精子正常形態(tài)百分率高于對照組，而模式1組(小三陽組)的精液常規(guī)參數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HBV不同標(biāo)志物模式組間的精液常規(guī)參數(shù)存在一定的差異，但是各標(biāo)志物模式(即使是HBsAg+的標(biāo)志物模式)均未對精液常規(guī)參數(shù)產(chǎn)生不利影響。與本研究結(jié)果不同，溫子娜等[11]在研究HBV不同感染狀態(tài)對精液質(zhì)量的影響中發(fā)現(xiàn)，男方大三陽組和小三陽組的精液常規(guī)參數(shù)低于未感染對照組。可能原因是：人群差異；精液常規(guī)參數(shù)本身易受多種因素的影響，波動(dòng)性大，重復(fù)性差。

頂體是由精子細(xì)胞核附近的高爾基復(fù)合體形成，為精卵結(jié)合提供條件，內(nèi)含多種水解酶，其中頂體酶是頂體反應(yīng)中最為重要的一種酶。頂體酶活性是判斷精子穿透卵子透明帶能力的重要指標(biāo)之一，是預(yù)測男性精子受精能力的重要生化指標(biāo)。郭麗媛等[12]通過檢測214例不明原因不育男性的頂體酶活性，發(fā)現(xiàn)56例精子頂體酶活性存在異常。馮星等[13]在研究不同參數(shù)精子的頂體酶活性與IVF治療中受精能力的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，頂體酶活性正常值組的精子濃度高于頂體酶活性低值組，且前者IVF受精率高于后者。提示精子頂體酶活性在男性生育能力評估和男性不育癥診治方面具有重要的臨床意義。本研究結(jié)果顯示，HBV感染組的精子頂體酶活性低于未感染組，提示HBV感染對男性精液質(zhì)量產(chǎn)生了不利影響。此外，HBsAg+的標(biāo)志物模式1組(小三陽)、2組(大三陽)和7組間的精子頂體酶活性與對照組比較有降低趨勢，但是均沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與這些標(biāo)志物模式組的樣本量小有關(guān)。相關(guān)研究認(rèn)為頂體酶活性與精子正常形態(tài)率呈正相關(guān)，精子形態(tài)學(xué)畸形率高會(huì)影響頂體酶活性并導(dǎo)致受精能力下降[14]。本研究結(jié)果顯示，HBV感染組的精子頂體酶活性降低，但是精子正常形態(tài)百分率與未感染組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。可能原因是：大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的精子形態(tài)學(xué)分析的染色和讀片都由人工完成，人為影響因素較多；形態(tài)學(xué)上的細(xì)微差異很難通過人眼來識(shí)別。這也正是精漿生化分析更為客觀而穩(wěn)定的優(yōu)勢所在。

隨著男性不育患者的逐年增多，精漿中的鋅含量與男性不育的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明，精漿中的鋅可能通過影響垂體分泌促性腺激素及睪丸生精功能來調(diào)節(jié)精子的產(chǎn)生和運(yùn)動(dòng)；另外，鋅直接參與精子的生成、成熟和獲能的過程，還可保護(hù)精子膜，對精子的運(yùn)動(dòng)性和功能都有著重要作用。多項(xiàng)研究表明精漿鋅含量降低會(huì)對精液質(zhì)量產(chǎn)生不利的影響[15-17]，但是目前國內(nèi)外關(guān)于HBV感染對精漿鋅含量的影響還未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，HBV感染組的精漿鋅含量明顯低于未感染組；不同標(biāo)志物模式組中HBsAg+的標(biāo)志物模式1組(小三陽)、2組(大三陽)和7組的精漿鋅含量與對照組比較有降低趨勢，但只有模式1組(小三陽)和2組(大三陽)低于對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示HBV感染雖然沒有對精液常規(guī)參數(shù)(如精子濃度和活力)產(chǎn)生明顯不利的影響，但是HBV感染(特別是大三陽和小三陽感染模式)影響精漿中的鋅含量，可能對男性生育產(chǎn)生不利的影響。

目前，HBV感染影響精液質(zhì)量的具體機(jī)制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)HBV能夠增加氧化應(yīng)激丙二醛的含量以及誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-17和白細(xì)胞介素-18的異常表達(dá)，降低精子的抗氧化能力，導(dǎo)致精子功能障礙；HBV感染還會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞膜的通透性增加，破壞精子運(yùn)動(dòng)所必需的細(xì)胞內(nèi)離子濃度，導(dǎo)致精子凋亡[18-20]。此外，HBV進(jìn)入到生殖系統(tǒng)中可能與血-睪屏障的損傷有關(guān)，且HBV感染可能會(huì)造成機(jī)體免疫功能的紊亂，這是否與精漿生化指標(biāo)(頂體酶活性和鋅含量)降低有關(guān)還未可知，但本研究的相關(guān)結(jié)果為進(jìn)一步研究HBV感染影響精液質(zhì)量的具體機(jī)制提供了一個(gè)新的方向。

綜上所述，男性HBV感染及不同標(biāo)志物模式對精液常規(guī)參數(shù)未產(chǎn)生不利影響，但是HBV感染者的精子頂體酶活性和精漿鋅含量降低，尤其是HBV“小三陽”和“大三陽”感染模式者的精漿鋅含量明顯受到影響，可能對男性生育產(chǎn)生不利影響。