楊勁威，曹媛

寶雞市人民醫(yī)院兒科1、藥學(xué)部2，陜西 寶雞 721000

川崎病常發(fā)生于嬰幼兒時期，可繼發(fā)成年后的心血管疾病。目前川崎病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤、壞死等從而阻礙細(xì)胞功能進(jìn)而促進(jìn)促炎因子等分泌，這一系列反應(yīng)在動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展過程中可發(fā)揮重要作用[1-2]。中醫(yī)藥成分具有減緩川崎病發(fā)展進(jìn)程的作用[3-4]。積雪草苷是積雪草的提取物，研究表明積雪草苷可抑制炎癥因子分泌從而發(fā)揮抗肺纖維化作用[5]。但積雪草苷與川崎病相關(guān)性研究尚未見報道。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)在川崎病中表達(dá)水平升高，并可能促進(jìn)川崎病發(fā)生及發(fā)展[6]。因此，本研究采用腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導(dǎo)人冠狀動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞建立川崎病血管損傷模型，探討積雪草苷是否可通過調(diào)控MMP-9表達(dá)而影響川崎病血管損傷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 南京廣潤生物制品有限公司提供積雪草苷(純度≥98%)；江蘇普諾生生物科技有限公司提供人冠狀動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞；美國Invitrogen公司提供Lipofectamine2000；美國Thermo Fisher公司提供Trizol試劑；北京天根生化科技有限公司提供反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒；蘇州派普泰克生物科技有限公司提供TNF-α；上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供pcDNA、pcDNA-MMP-9；北京索萊寶提供CCK-8試劑、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒；上海酶聯(lián)生物提供IL-6、IL-1檢測試劑盒；美國Santa Cruz公司提供兔抗人Bax、Bcl-2、MMP-9抗體、內(nèi)參GAPDH與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗處理及分組 血管內(nèi)皮細(xì)胞放入含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)胞接種于6孔板(1×104個/孔)，加入含有濃度為40 ng/mL TNF-α的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h[7]，記為TNF-α組。同時將正常培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞記為con組。分別加入含有濃度為40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL的積雪草苷[8]和40 ng/mL TNF-α的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，分別記為TNF-α+低積雪草苷組、TNF-α+中積雪草苷組、TNF-α+高積雪草苷組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液與pcDNA、pcDNA-MMP-9混合后室溫孵育5 min(A液)，用不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液與Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑充分混合(B液)，A液與B液充分混勻后室溫孵育20 min后加入血管內(nèi)皮細(xì)胞，6 h棄上清液后更換正常培養(yǎng)液，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用上述轉(zhuǎn)染方法將pcDNA、pcDNA-MMP-9分別轉(zhuǎn)染至血管內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后加入含有濃度為160μg/mL的積雪草苷和40 ng/mLTNF-α的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，分別記為TNF-α+積雪草苷+pcDNA組、TNF-α+積雪草苷+pcDNA-MMP-9組。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗檢測細(xì)胞增殖 血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板(1×103個/孔)，采用0 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、60 ng/mL、80 ng/mL的TNF-α作用血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，每孔中加入CCK-8溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值(OD 450 nm)。選40 ng/mL TNF-α做后續(xù)實(shí)驗，TNF-α對不同時間(0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)下內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性。同時收集各組血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板(1×103個/孔)后置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性。

1.2.3 qRT-PCR檢測MMP-9 mRNA的表達(dá)水平 Trizol法提取血管內(nèi)皮細(xì)胞中總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，采用2-ΔΔCt法計算MMP-9 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組血管內(nèi)皮細(xì)胞后加入500μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC與PI各5μL，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 ELISA法檢測IL-6、IL-1的水平 收集各組血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法檢測IL-6、IL-1的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6 Western blot檢測Bax、Bcl-2、MMP-9蛋白表達(dá)量 收集各組血管內(nèi)皮細(xì)胞加入400μL RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE，分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜后用5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)一抗與內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 000)稀釋液，4℃孵育24 h，加入二抗稀釋液(1∶3 000)后室溫孵育1 h，滴加ECL顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響 不同濃度的TNF-α作用24 h后，隨著TNF-α濃度的升高細(xì)胞活性降低，其中TNF-α濃度為40 ng/mL時細(xì)胞活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而60 ng/mL組、80 ng/mL組細(xì)胞活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因而選用40 ng/mL TNF-α進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗，見表1。在40 ng/mL TNF-α作用下，0～12 h時細(xì)胞活性無明顯變化，而16 h、20 h、24 h時細(xì)胞活性降低且隨著時間的延長而明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因而選用12 h做后續(xù)實(shí)驗，見表2。

表1 不同濃度的TNF-α作用24 h對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響(±s)Table 1 Effect of TNF-αat different concentrations for 24 h on endothelial cell activity(±s)

表1 不同濃度的TNF-α作用24 h對內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響(±s)Table 1 Effect of TNF-αat different concentrations for 24 h on endothelial cell activity(±s)

注：與0 ng/mL組比較，a P<0.05；與20 ng/mL組比較，b P<0.05；與40 ng/mL組比較，c P<0.05；與60 ng/mL組比較，d P<0.05。Note:Compared with 0 ng/mL group,a P<0.05;Compared with 20 ng/mL group,b P<0.05;Compared with 40 ng/mL group,c P<0.05;Compared with 60 ng/mL group,d P<0.05.

TNF-α(ng/mL)0 20 40 60 80 F值P值例數(shù)9 9 9 9 9 OD(450 nm)1.39±0.07 1.37±0.08 1.12±0.08ab 1.07±0.07abc 1.06±0.06abc 46.323<0.05

表2 TNF-α對不同時間下內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響(±s)Table 2 Effects of TNF-αon endothelial cell activity at different times(±s)

表2 TNF-α對不同時間下內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響(±s)Table 2 Effects of TNF-αon endothelial cell activity at different times(±s)

注：與0 h組比較，a P<0.05；與4 h組比較，b P<0.05；與8 h組比較，c P<0.05；與12 h組比較，d P<0.05；與16 h組比較，e P<0.05；與20 h組比較，f P<0.05。Note:Compared with 0 h group,a P<0.05;Compared with 4 h group,b P<0.05;Compared with 8 h group,c P<0.05;Compared with 12 h group,d P<0.05;Compared with 16 h group,e P<0.05;Compared with 20 h group,f P<0.05.

時間(h)0 4 8 12 16 20 24 F值P值例數(shù)9 9 9 9 9 9 9 OD(450 nm)1.39±0.12 1.37±0.10 1.37±0.09 1.33±0.13 1.16±0.05abcd 0.99±0.08abcde 0.78±0.05abcdf 57.489<0.05

2.2 積雪草苷對TNF-α處理的內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響 與con組比較，TNF-α組細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，IL-6、IL-1的水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與TNF-α組比較，TNF-α+低積雪草苷組、TNF-α+中積雪草苷組、TNF-α+高積雪草苷組細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，IL-6、IL-1的水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見圖1、圖2、表3。

圖2 積雪草苷對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of asiaticoside on expression of apoptotic protein in endothelial cells

表3 積雪草苷對內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響(±s，n=9)Table3 Effectsof asiaticoside on endothelial cell injury and inflammatory factors(±s,n=9)

表3 積雪草苷對內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響(±s，n=9)Table3 Effectsof asiaticoside on endothelial cell injury and inflammatory factors(±s,n=9)

注：與con組比較，a P<0.05；與TNF-α組比較，b P<0.05；與TNF-α+低積雪草苷組比較，c P<0.05；與TNF-α+中積雪草苷組比較，d P<0.05。Note:Compared with con group,a P<0.05;Compared with the TNF-αgroup,bP<0.05;Compared with TNF-α+low asiaticoside group,c P<0.05;Compared with TNF-α+asiaticosidegroup,d P<0.05.

組別Con組TNF-α組TNF-α+低積雪草苷組TNF-α+中積雪草苷組TNF-α+高積雪草苷組F值P值凋亡率(%)6.90±0.51 24.55±1.39a 21.60±0.81b 16.23±0.76bc 11.91±0.50bcd 623.634<0.05 Bax 0.21±0.02 0.85±0.06a 0.72±0.04b 0.50±0.03bc 0.27±0.03bcd 467.331<0.05 Bcl-2 0.75±0.04 0.15±0.02a 0.23±0.02b 0.39±0.03bc 0.60±0.04bcd 576.551<0.05 IL-6(pg/mL)72.78±8.56 426.96±25.28a 350.72±19.12b 255.21±24.37bc 144.85±12.18bcd 518.871<0.05 IL-1(pg/mL)44.53±5.46 307.93±14.23a 238.96±13.13b 167.18±12.66bc 98.92±7.93bcd 798.637<0.05

圖1 積雪草苷對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響Figure1 Effect of asiaticoside on endothelial cell apoptosis

2.3 積雪草苷對TNF-α處理的內(nèi)皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)的影響 與con組比較，TNF-α組MMP-9 mRNA及蛋白水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與TNF-α組比較，TNF-α+低積雪草苷組、TNF-α+中積雪草苷組、TNF-α+高積雪草苷組MMP-9 mRNA及蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且劑量依賴性，見圖3、表4。

圖3 MMP-9蛋白表達(dá)的檢測Figure3 Detection of MMP-9 protein expression

表4 積雪草苷對內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的影響(±s,n=9)Table4 Effect of asiaticosideon the expression of MMP-9 in endothelial cells(±s,n=9)

表4 積雪草苷對內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的影響(±s,n=9)Table4 Effect of asiaticosideon the expression of MMP-9 in endothelial cells(±s,n=9)

注：與con組比較，a P<0.05；與TNF-α組比較，b P<0.05；與TNF-α+低積雪草苷組比較，c P<0.05；與TNF-α+中積雪草苷組比較，d P<0.05。Note:Compared with con group,a P<0.05;Compared with the TNF-α group,b P<0.05;Compared with TNF-α+low asiaticoside group,c P<0.05;Compared with TNF-α+asiaticosidegroup,d P<0.05.

組別con組TNF-α組TNF-α+低積雪草苷組TNF-α+中積雪草苷組TNF-α+高積雪草苷組F值P值MMP-9 mRNA 1.00±0.06 3.20±0.09a 2.87±0.10b 2.33±0.09bc 1.32±0.08bcd 1 138.836<0.05 MMP-9蛋白0.27±0.04 0.88±0.05a 0.72±0.05b 0.52±0.04bc 0.33±0.02bcd 347.076<0.05

2.4 MMP-9過表達(dá)對積雪草苷作用的內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響 與TNF-α+積雪草苷+pcDNA組比較，TNF-α+積雪草苷+pcDNA-MMP-9組MMP-9 mRNA及蛋白水平升高，細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，IL-6、IL-1的水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、圖5、表5。

表5 MMP-9過表達(dá)對積雪草苷作用的內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響(±s，n=9)Table 5 Effect of MMP-9 overexpression on endothelial cell injury and inflammatory factorsinduced by asiaticoside(±s,n=9)

表5 MMP-9過表達(dá)對積雪草苷作用的內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥因子的影響(±s，n=9)Table 5 Effect of MMP-9 overexpression on endothelial cell injury and inflammatory factorsinduced by asiaticoside(±s,n=9)

注：與TNF-α+積雪草苷+pcDNA組比較，a P<0.05。Note:Compared with TNF-α+asiaticoside+pcDNA group,a P<0.05.

組別TNF-α+積雪草苷+pcDNA組TNF-α+積雪草苷+pcDNA-MMP-9組t值P值MMP-9 mRNA 1.28±0.07 2.55±0.13a 25.805<0.05 MMP-9蛋白0.29±0.03 0.58±0.04a 17.400<0.05凋亡率(%)11.86±0.76 19.98±0.95a 20.023<0.05 Bax 0.28±0.03 0.66±0.04a 22.800<0.05 Bcl-2 0.60±0.05 0.26±0.02a 18.941<0.05 IL-6(pg/mL)141.54±12.51 320.74±15.17a 27.341<0.05 IL-1(pg/mL)99.79±8.10 207.68±13.73a 20.304<0.05

圖4 MMP-9過表達(dá)對積雪草苷作用的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響Figure4 Effect of MMP-9 overexpression on endothelial cell apoptosis induced by asiaticoside

圖5 MMP-9過表達(dá)對積雪草苷作用的內(nèi)皮細(xì)胞MMP-9和凋亡蛋白表達(dá)的影響Figure5 Effect of MMP-9 overexpression on theexpression of MMP-9 and apoptotic protein in asiaticosideinduced endothelial cells

3 討論

目前臨床采用靜脈輸注丙種球蛋白與口服阿司匹林等治療川崎病，但治療效果不佳。川崎病是引起兒童心臟病的重要原因之一，受到越來越多的關(guān)注，而與川崎病相關(guān)的血管損傷并發(fā)癥使其成為成人缺血性心臟病的重要危險因素[9]。遺憾的是，我們目前對川崎病血管損傷的確切發(fā)病機(jī)制的了解非常有限，仍然缺乏有效的治療策略。因此，研究川崎病血管內(nèi)皮損傷的機(jī)制和尋找治療靶點(diǎn)對川崎病的研究和臨床治療至關(guān)重要。

積雪草苷可抑制細(xì)胞凋亡而減輕腎缺血再灌注損傷[10]。積雪草苷可能通過抑制MAPK信號通路而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[11]。積雪草苷可促進(jìn)血管新生從而減輕腦梗死大鼠腦損傷[12]。但積雪草苷對川崎病血管損傷的影響尚未可知。TNF-α作為最重要的炎癥因子之一，被用來誘導(dǎo)炎癥損傷。故本研究首先使用TNF-α誘導(dǎo)人冠狀動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果顯示，TNF-α可抑制內(nèi)皮細(xì)胞活性，提高IL-6、IL-1的水平，這與Wang等[13]的研究一致，提示川崎病血管損傷模型建立成功。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，說明TNF-α誘導(dǎo)可通過調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這也證實(shí)了川崎病血管損傷模型的成功建立。Bcl-2、Bax主要定位于線粒體外膜上，細(xì)胞受到凋亡信號刺激后，Bax可增加線粒體膜通透性，其水平升高可促進(jìn)細(xì)胞色素釋放，引起細(xì)胞凋亡[14]。IL-6、IL-1屬于促炎細(xì)胞因子，其水平升高可促進(jìn)細(xì)胞損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，隨著積雪草苷濃度的升高，IL-6、IL-1的水平降低，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率下降，Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，提示積雪草苷可抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而減輕細(xì)胞損傷。這可能與積雪草苷抑制MAPK信號通路有關(guān)，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步驗證。

已有研究表明MMP-9等基因在川崎病發(fā)生及發(fā)展過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用[16-17]。抑制MMP-9表達(dá)表達(dá)可保護(hù)血腦屏障的完整性和通透性[18]。MMP-9表達(dá)下調(diào)可保護(hù)氣道上皮細(xì)胞[19]。MMP-9表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[20]。本研究結(jié)果顯示，TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-9 mRNA及蛋白水平升高，而積雪草苷能夠以濃度依賴性方式降低MMP-9的表達(dá)，提示積雪草苷對川崎病血管損傷的改善作用可能與下調(diào)MMP-9表達(dá)相關(guān)。深入研究表明，MMP-9過表達(dá)可減弱積雪草苷對TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的抑制作用，提示積雪草苷可通過抑制MMP-9表達(dá)而減輕川崎病血管損傷。

綜上所述，TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)量升高，積雪草苷可通過下調(diào)MMP-9表達(dá)而抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，MMP-9可能作為積雪草苷治療川崎病的潛在靶點(diǎn)。