劉 競，張 蘭，曾 利，馬 麗

(巴中市中心醫(yī)院產(chǎn)科，四川 巴中 636000)

稽留流產(chǎn)指胚胎死亡或發(fā)育停止后稽留于宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出者[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，稽留流產(chǎn)發(fā)病率從2013年的24.14%上升到2018年的30.50%[2]。稽留流產(chǎn)受遺傳、免疫缺陷、內(nèi)分泌異常、感染等多因素影響，但病因仍不清楚[3]。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是具有促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖或侵蝕作用的細(xì)胞因子，對胚胎植入、發(fā)育有調(diào)控作用[4]；E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間黏附作用的跨膜糖蛋白，對維持正常子宮功能有重要意義[5]；微血管密度(microvessel density，MVD)降低可造成胎盤微循環(huán)障礙，嚴(yán)重時(shí)引起胚胎死亡[6]?；袅鳟a(chǎn)可引起宮壁粘連，宮內(nèi)組織機(jī)化，纖維組織水腫變性，孕囊不易完全排出，臨床上多采用米非司酮片配伍米索前列醇片序貫治療稽留流產(chǎn)，但仍存在完全流產(chǎn)率低、陰道出血多等不足[7]。本研究通過檢測IGF-1、E-cadherin和MVD在進(jìn)行米非司酮配伍米索前列醇治療的稽留流產(chǎn)和正常早孕患者絨毛組織中的表達(dá)情況，分析研究其表達(dá)與藥物治療結(jié)局的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1研究對象

收集2019年9月至2021年8月在巴中市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的，進(jìn)行米非司酮配伍米索前列醇治療的稽留流產(chǎn)患者95例為研究組，正常早孕患者108例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究組均符合《婦產(chǎn)科學(xué)》中稽留流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②對照組血清人絨毛膜促性腺激素檢測陽性，B型超聲檢查可見胚芽或(和)心管搏動(dòng)以證實(shí)胚胎存活；妊娠囊大小與停經(jīng)天數(shù)相符合；③年齡在20～40歲之間；④妊娠時(shí)間在6～10周之間；⑤自愿參與試驗(yàn)并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①對本研究治療藥物過敏或有其他禁忌證者；②生殖道結(jié)構(gòu)畸形、月經(jīng)周期不規(guī)律、生殖道感染等；③妊娠期有毒物、藥物、射線接觸史、家族遺傳史等。

1.2藥物治療

所有患者均采用米非司酮配伍米索前列醇的統(tǒng)一藥物方案進(jìn)行治療，即第一天口服米非司酮25mg/次(國藥準(zhǔn)字H10950003，規(guī)格：25mg)，早晚各一次，第二天早上50mg，第三天晨空腹口服米索前列醇0.6mg(國藥準(zhǔn)字H20000668，規(guī)格：0.2mg)；患者服用藥物3h后，觀察宮縮情況，如未出現(xiàn)宮縮則再給予0.4mg米索前列醇口服，或?qū)?.2mg米索前列醇置于陰道后穹窿處，據(jù)患者陰道出血情況及胚胎排出情況判斷是否進(jìn)行清宮術(shù)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)本采集

收集兩組患者藥物治療后自行排出的絨毛組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈后，進(jìn)行固定、脫水、包埋，制成切片，進(jìn)行免疫組化染色檢測。

1.3.2免疫組織化學(xué)法檢測絨毛組織中IGF-1、E-cadherin和MVD的表達(dá)

取上述石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化，利用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗3次，分別加入IGF-1、E-cadherin和CD34抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)過夜孵育，PBS洗3次后分別加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)室溫孵育1h，PBS洗2次后加3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)孵育10min；復(fù)染5min，水洗分化、藍(lán)化，最后脫水封片后由2名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立觀察染色情況，判讀免疫組織化學(xué)結(jié)果。

結(jié)果判定：①IGF-1、E-cadherin免疫組織化學(xué)結(jié)果判定[9]：隨機(jī)選取高倍視野5個(gè)，聯(lián)合染色的強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行計(jì)分，其中染色強(qiáng)度不著色計(jì)0分、淺黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分及棕褐色計(jì)3分；其中陽性細(xì)胞所占視野內(nèi)細(xì)胞的百分比<5%計(jì)0分、5%～<25%計(jì)1分、25%～50%計(jì)2分、>50%計(jì)3分；然后取兩者得分乘積為最終分?jǐn)?shù)，判定0分為陰性(-)，1～2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)，后3者均視為陽性表達(dá)；②MVD免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：用CD34的表達(dá)量代表MVD。CD34分布于細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。微血管計(jì)數(shù)參考1992年Weidner等計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)：凡標(biāo)記清晰，著色強(qiáng)，與背景明顯有別的單個(gè)染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞、管腔直徑小于8個(gè)紅細(xì)胞的血管或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇，不論是否形成管腔或管腔內(nèi)是否有紅細(xì)胞，只要不和臨近的微血管、細(xì)胞及其他結(jié)締組織相連，就作為一個(gè)微血管。管壁有平滑肌的血管不予計(jì)數(shù)。先在低倍鏡下尋找新生血管最密集區(qū)，然后在200倍視野下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)微血管染色數(shù)目，其平均值即該病例的MVD。

1.4療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

藥物治療后效果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[10]：藥物治療效果分為完全流產(chǎn)、不完全流產(chǎn)和治療失敗。①完全流產(chǎn)：接受藥物治療24h內(nèi)出現(xiàn)宮縮等癥狀，陰道出血量在正常范圍內(nèi)，妊娠物完全排出，經(jīng)B超檢查確認(rèn)宮腔內(nèi)無組織殘留物；②不完全流產(chǎn)：接受藥物24h內(nèi)排出部分妊娠物，陰道出血量較大，B超檢查發(fā)現(xiàn)宮腔內(nèi)仍有部分殘留物，需要進(jìn)行清宮術(shù)；③治療失?。夯颊呓邮芩幬镏委熀蟀l(fā)生腹痛，出現(xiàn)少量陰道出血但無妊娠物排出，經(jīng)B超檢查確認(rèn)宮腔內(nèi)存在妊娠物，需進(jìn)行清宮術(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組患者一般資料比較

研究組平均年齡(26.45±4.17)歲，孕周(8.29±1.45)周；對照組平均年齡(26.56±3.98)歲，孕周(8.35±1.58)周；兩組患者的年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、痛經(jīng)比例間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者的一般資料比較

2.2兩組患者絨毛組織中IGF-1、E-cadherin和MVD的表達(dá)情況

兩組患者絨毛組織中均有IGF-1、E-cadherin、MVD的表達(dá)，見圖1；研究組絨毛組織中IGF-1的陽性表達(dá)率(3.16%)低于對照組(11.11%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.67，P=0.03)；研究組絨毛組織中E-cadherin的陽性表達(dá)率(75.79%)低于對照組(96.30%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.43，P<0.01)；研究組絨毛組織中MVD的相對表達(dá)量(7.56±0.62)低于對照組(13.78±1.16)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=46.71，P<0.01)，見表2。

表2 兩組患者絨毛組織中IGF-1、E-cadherin和MVD的表達(dá)情況

注：(A：研究組，B：對照組)為IGF-1的表達(dá)；(C：研究組，D：對照組)為E-cadherin的表達(dá)；(E：研究組，F(xiàn)：對照組)為MVD的表達(dá)；箭頭為陽性表達(dá)區(qū)域；(標(biāo)尺=100μm)。

2.3兩組患者接受藥物治療后的不同結(jié)局發(fā)生情況

兩組患者接受藥物規(guī)范治療后，發(fā)生完全流產(chǎn)共165例(81.28%)，不完全流產(chǎn)38例(18.72%)，無治療失敗病例發(fā)生；研究組患者不完全流產(chǎn)發(fā)生率(28.42%)高于對照組(10.19%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.05，P<0.01),見表3。

表3 兩組患者接受藥物治療后不同結(jié)局發(fā)生情況比較[n(%)]

2.4影響藥物治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，藥物治療后不完全流產(chǎn)患者年齡及BMI偏大(t=5.05，P<0.01；t=5.62，P<0.01)、痛經(jīng)比例偏高(χ2=17.78，P<0.01)、絨毛組織中E-cadherin陽性表達(dá)率較低(χ2=33.64，P<0.01)、MVD的表達(dá)量也低于完全流產(chǎn)患者(t=5.27，P<0.01)，見表4。

表4 影響藥物治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的單因素分析

2.5影響藥物治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的多因素Logistic回歸分析

以藥物治療后是否發(fā)生不完全流產(chǎn)為因變量，以單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的因素為自變量進(jìn)行二分類多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，痛經(jīng)(OR=2.24，95%CI：1.36～3.71，P<0.01)是藥物治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；絨毛組織中E-cadherin的表達(dá)(OR=0.69，95%CI：0.55～0.70，P<0.01)和MVD的表達(dá)(OR=0.72，95%CI：0.68～0.78，P<0.01)均為患者接受藥物治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的獨(dú)立保護(hù)因素，見表5。

表5 影響藥物治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的多因素Logistic回歸分析

3討論

3.1稽留流產(chǎn)絨毛組織中IGF-1、E-cadherin、MVD表達(dá)及相關(guān)性

胎盤血管網(wǎng)的建立對胚胎的正常生長發(fā)育、保障胎兒獲取其生長所需的血液灌注量至關(guān)重要。胚胎發(fā)育早期，機(jī)體絨毛膜的一部分細(xì)胞分化為胎盤，另一部分分化為胎盤血管網(wǎng)，對子宮螺旋動(dòng)脈進(jìn)行重塑，建立起母體與胎兒之間的聯(lián)系，使胎兒能夠通過母體血液獲取自身發(fā)展所需要的營養(yǎng)[11]。若胎盤血管網(wǎng)建立受到阻礙，造成胎盤微循環(huán)障礙，則胎兒通過母體血液攝取必需物質(zhì)(充足的氧氣、免疫因子和營養(yǎng)物質(zhì)等)接收不足，造成發(fā)育不良，甚至引發(fā)胎兒死亡[12]。本研究結(jié)果也顯示，稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中MVD的相對表達(dá)量明顯低于對照組，提示稽留流產(chǎn)患者胎盤血管網(wǎng)發(fā)育不良。胎盤血管網(wǎng)的建立由多種生長因子與基因共同協(xié)調(diào)參與，若其表達(dá)過高或過低，都會(huì)對胎盤血管網(wǎng)的發(fā)育造成消極影響，使得胎盤功能不全，造成胎兒生長發(fā)育受限，最終導(dǎo)致流產(chǎn)或死胎等不良結(jié)局。

IGF-1對維持子宮內(nèi)膜正常分泌與增殖有重要意義，其在妊娠早期通過局部組織分泌產(chǎn)生，發(fā)揮調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化等過程，對于胚胎的生長發(fā)育至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1能夠增強(qiáng)體外孕早期滋養(yǎng)細(xì)胞的生物活性，調(diào)節(jié)胎盤血流動(dòng)力學(xué)，改善胎盤生理功能，促進(jìn)胎兒的生長發(fā)育[13]。本研究結(jié)果顯示，稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中IGF-1表達(dá)低于正常流產(chǎn)患者，提示IGF-1低表達(dá)與稽留流產(chǎn)的發(fā)生存在相關(guān)性。其可能原因是由于IGF-1的表達(dá)對于滋養(yǎng)細(xì)胞的黏附作用有積極影響，可與整合素相互作用，對胚胎著床的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮其介導(dǎo)作用?；袅鳟a(chǎn)患者體內(nèi)IGF-1表達(dá)過低，致使其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能障礙，進(jìn)而阻斷胚胎著床信號(hào)傳導(dǎo)，影響胚胎組織的正常生長分化[14]。E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，其在同型細(xì)胞的相互黏附中有重要作用。既往研究表明E-cadherin表達(dá)水平異常升高時(shí)會(huì)使細(xì)胞間黏附增強(qiáng)，降低細(xì)胞浸潤與遷移能力，對腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有較強(qiáng)的抑制作用[15]。妊娠期間，E-cadherin在母胎蛻膜上皮細(xì)胞與滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)廣泛，并在受精卵著床到胎盤浸潤子宮等多個(gè)環(huán)節(jié)中均有參與[16]。在本研究中，研究組患者E-cadherin陽性率明顯低于對照組，與既往研究結(jié)果基本一致，究其原因可能是E-cadherin表達(dá)下降，使其介導(dǎo)的細(xì)胞連接與黏附受到影響，進(jìn)而造成滋養(yǎng)細(xì)胞黏附與浸潤能力降低，子宮螺旋動(dòng)脈的形成出現(xiàn)障礙，血管重塑被阻斷，使胎盤血管網(wǎng)的建立被抑制，導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止，造成稽留流產(chǎn)結(jié)局。

3.2米非司酮配伍米索前列醇治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的影響因素

稽留流產(chǎn)因其特殊性，在臨床研究中日益受到重視，以往臨床治療多以清宮術(shù)為主，雖然效果較好，但易引起感染、宮頸粘連等多種并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致患者繼發(fā)性不孕，使患者生理、心理受到極大創(chuàng)傷。藥物治療作為一種簡單方便、效果較好、患者易于接受的治療方式，在臨床治療中亦有一定的應(yīng)用價(jià)值[17]。米非司酮為抗孕酮類藥物，與孕酮受體結(jié)合，表現(xiàn)出高度的受體和組織選擇性，阻斷絨毛組織供血，促進(jìn)子宮收縮，使胎盤、胎膜與子宮壁發(fā)生剝離，且可擴(kuò)張、軟化宮頸，促進(jìn)胚胎排出。米索前列醇為前列腺素衍生物，可誘發(fā)子宮平滑肌收縮，與米非司酮協(xié)同作用，能使宮頸結(jié)締組織中的膠原纖維溶解，促進(jìn)宮頸軟化成熟和擴(kuò)張，使孕囊排出，應(yīng)用于終止早孕及小孕周的中期妊娠，取得較好臨床效果[18]。

本研究結(jié)果也顯示，藥物治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)率約為18.72%，稽留流產(chǎn)患者不完全流產(chǎn)發(fā)生率高于正常早孕患者?；袅鳟a(chǎn)的發(fā)生機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為可能與母胎之間的免疫平衡失調(diào)、孕酮分泌不足、染色體異常、社會(huì)環(huán)境及各種感染等多種因素共同作用有關(guān)。對于米非司酮配伍米索前列醇治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的影響因素亦不明確[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物治療后不完全流產(chǎn)的發(fā)生率在不同年齡和BMI之間存在差異，多因素分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，痛經(jīng)是藥物治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，絨毛組織中E-cadherin的表達(dá)和MVD的表達(dá)均為患者接受藥物治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的獨(dú)立保護(hù)因素，提示稽留流產(chǎn)患者存在痛經(jīng)史，則其接受藥物治療后發(fā)生不完全流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)較高，而其E-cadherin表達(dá)水平越高，MVD越大，則發(fā)生治療后不完全流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)越低。

綜上所述，稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中IGF-1、E-cadherin表達(dá)和MVD含量較低，接受藥物治療后完全流產(chǎn)患者IGF-1、E-cadherin與MVD均高于不完全流產(chǎn)患者，E-cadherin表達(dá)水平越高，MVD越大，則出現(xiàn)不完全流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)越低。