曹亦芹，程碧真，李 州

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科技學(xué)院，四川 成都 611130)

全球有20%可利用耕地受到鹽脅迫的危害[1]，我國鹽堿地面積約為9.91×107公頃，占我國可用耕地面積的25%[2-3]。鹽脅迫對種子萌發(fā)和植物正常生長產(chǎn)生的抑制作用主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是高鹽濃度的外部環(huán)境與植物自身水勢存在水勢差，使植物難以吸收水分和代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)[4-5]；二是植物被迫吸收過量的鹽離子(尤其是Na+)，破壞了細(xì)胞內(nèi)離子濃度平衡，造成離子毒害，植物正常生理代謝活動(dòng)受阻[6-7]。此外，植物受到鹽脅迫時(shí)會(huì)激活體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，通過提高抗氧化酶活性清除體內(nèi)過量的活性氧，保護(hù)細(xì)胞膜完整性；此外植物內(nèi)滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)也會(huì)適應(yīng)脅迫，增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力[8-11]。

白三葉(Trifoliumrepens)又名白車軸草，為豆科(Leguminosae)車軸草屬(Trifolium)的多年生草本植物，其葉量豐富、營養(yǎng)價(jià)值高、葉形優(yōu)美且侵占性強(qiáng)，是我國與國外廣泛應(yīng)用的重要牧草和草坪草[11]。草坪草作為城鎮(zhèn)綠化必不可少的組成部分，覆蓋地表后能減少水分蒸發(fā)，從而減輕可溶性鹽類在地表的積累[12]。此外，白三葉根部可以與菌根真菌形成共生關(guān)系[13]，兼具有保土護(hù)坡和生態(tài)修復(fù)的功能。白三葉喜冷涼濕潤氣候，屬溫帶草種，耐澇性[14]和耐陰性較好，林下、建筑下均可生長。但是耐旱和耐鹽堿能力較差，脅迫消耗了大量植物體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致牧草產(chǎn)量降低、品質(zhì)下滑，對觀賞草坪的外觀也會(huì)造成嚴(yán)重威脅，造成草坪觀賞性降低、草坪質(zhì)量下降甚至植株死亡[15]，這限制了白三葉在許多地區(qū)的種植和推廣利用[16]。劉偉等人的研究表明，鹽濃度大于50 mmol·L-1時(shí)，白三葉種子的萌發(fā)受到嚴(yán)重影響[11]。鹽濃度達(dá)到100 mmol·L-1時(shí)，白三葉種子的發(fā)芽率顯著降低，只能達(dá)到正常條件下萌發(fā)水平的一半，這嚴(yán)重限制了白三葉的利用[17]。

除選育耐鹽性強(qiáng)的品種外，使用外源添加物質(zhì)增強(qiáng)植物的耐鹽性是常見的研究手段[18]。胺鮮酯(DA-6，Diethyl aminoethyl hexanote)是一類新型植物生長調(diào)節(jié)劑，具有安全性好[19]和廉價(jià)等特性。DA-6為一種高效的細(xì)胞分裂素類似物，具有很高的生物活性，能夠促進(jìn)作物生長、生根和增強(qiáng)肥效，提高各種作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。DA-6已應(yīng)用于多種農(nóng)作物、果樹、林木等。有研究發(fā)現(xiàn)，噴施DA-6可以提高小麥(Triticumaestivum)種子活力[20]，也有助于草莓(Fragaria×ananassa)生長，并延緩植株衰老[21]。此外，DA-6的施用可以提高植物對非生物脅迫的抗逆性。有研究發(fā)現(xiàn)，20 mg·L-1DA-6提高了茄子(Solanummelongena)幼苗的抗熱性[22]。李東霞等[23]研究發(fā)現(xiàn)添加少量DA-6后，可以改善椰棗(Phoenixdactylifera)種子鹽脅迫下的萌發(fā)情況。DA-6浸種前處理可以通過調(diào)節(jié)植株抗氧化防御能力顯著提高白三葉在萌發(fā)期的耐鉻性[24]。已有大量研究證實(shí)DA-6對農(nóng)作物的生長與萌發(fā)具有一定的調(diào)節(jié)作用，可以增強(qiáng)植物對非生物脅迫的抵抗能力。但目前對DA-6影響鹽脅迫下白三葉種子萌發(fā)的研究未見報(bào)道。大多數(shù)植物在幼苗期是最為脆弱的時(shí)期，對不利的環(huán)境因素異常敏感，種子在萌發(fā)與幼苗生長階段對鹽脅迫的適應(yīng)能力尤為重要[25]。因此，本研究通過測定發(fā)芽特性、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化防御等方面，探討鹽脅迫下DA-6浸種前處理能否改善白三葉種子的萌發(fā)情況，并對DA-6誘導(dǎo)的耐鹽機(jī)理進(jìn)行初步研究，為提高鹽脅迫下白三葉的牧草質(zhì)量與產(chǎn)量尋找有效便潔的新方法，為草坪草在城市綠化的栽培管理中提供新參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和設(shè)計(jì)

以白三葉‘海發(fā)’品種為研究對象，先進(jìn)行浸種處理。海發(fā)原產(chǎn)于澳大利亞，耐旱性與耐酸鋁性較強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于人工草地建植和城市綠化[16]。DA-6浸種處理為將種子浸入蒸餾水中1 h，然后浸泡在不同濃度(0，0.1，0.8，2和5 mmol·L-1)的DA-6溶液中2 h；對照為蒸餾水中浸泡3 h。種子浸種前處理后用蒸餾水反復(fù)沖洗數(shù)次，并將種子表面的水分輕輕擦干備用。選取飽滿健康、色澤均勻、大小一致的50粒種子放置于墊有四層濾紙的培養(yǎng)皿中，分別在蒸餾水和100 mmol·L-1NaCl溶液誘導(dǎo)的鹽脅迫下發(fā)芽7天，每組50粒種子，每個(gè)濃度設(shè)置5次重復(fù)。培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱內(nèi)。篩選出最有效提高種子萌發(fā)的DA-6濃度為0.8 mmol·L-1(圖1)，之后的試驗(yàn)共設(shè)置四個(gè)處理：C(蒸餾水浸種+發(fā)芽床使用蒸餾水)、C+DA-6(0.8 mmol·L-1DA-6溶液浸種+發(fā)芽床使用蒸餾水)、S(蒸餾水浸種+發(fā)芽床使用100 mmol·L-1NaCl溶液)、S+DA-6(0.8 mmol·L-1DA-6溶液浸種+發(fā)芽床使用100 mmol·L-1NaCl溶液)。每天上午9點(diǎn)更換新濾紙以保證培養(yǎng)皿內(nèi)鹽濃度一致。每天上午9點(diǎn)記錄萌發(fā)種子數(shù)量。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1種子發(fā)芽指標(biāo)與鮮干重的測定 在種子萌發(fā)七天的過程中每天統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù)量并觀察萌發(fā)情況，以胚根長度與種子等長視為萌發(fā)。在發(fā)芽第3天計(jì)算發(fā)芽勢(Germination vigor，GV)，第7天計(jì)算發(fā)芽率(Germination percentage，GP)。相關(guān)公式如下：

并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)(Germination index，GI)和平均萌發(fā)時(shí)間(Mean germination time，MGT)。相關(guān)公式如下：

GI=∑Gt/Dt

MGT=∑(Dt×Gt)/∑Gt

其中Gt是浸種t日后的發(fā)芽數(shù)；Dt是對應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

在種子萌發(fā)七天后，每一個(gè)處理隨機(jī)抽取10株完整健全的幼苗，用直尺測量根長度(Root length，RL)與芽長度(Stem length，SL)，并稱取其鮮重(Fresh weight，F(xiàn)W)，然后將樣品至于105℃烘箱，殺青30 min，接著調(diào)至80℃烘干直至恒重，然后測定幼苗干重(Dry weight，DW)。并計(jì)算活力指數(shù)(Vitality index，VI)[26]。

VI=FW×GI

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析使用SPSS 20(IBM，Armonk，NY，USA)，在P<0.05水平進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，使用鄧肯法(Duncan)進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析。采用Origin9制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)特性與表型

不同濃度DA-6溶液浸種下發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)不同,其中0.08 mmol·L-1濃度浸種后的值最高(圖1)。鹽脅迫下，白三葉種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)比起正常條件都顯著下降(P<0.05)，但平均萌發(fā)時(shí)間顯著增加(圖2)(P<0.05)。鹽脅迫顯著抑制了白三葉的發(fā)芽過程。DA-6浸種處理后鹽脅迫下種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)顯著高于水浸種后鹽脅迫下的種子(P<0.05)，但平均萌發(fā)時(shí)間沒有顯著差異(圖2)(P<0.05)。鹽脅迫處理第7天時(shí)，DA-6浸種的種子發(fā)芽率與水浸種處理的相比提高了53.17%(圖2A)。

圖1 不同濃度DA-6溶液浸種對種子萌發(fā)特性的影響

圖2 水浸種或DA-6浸種對種子萌發(fā)特性的影響

鹽脅迫下DA-6浸種處理使幼苗的根長度提高了52.15%，兩個(gè)處理的差異顯著(圖3A)(P<0.05)，同時(shí)DA-6浸種處理對鹽脅迫下白三葉種子的莖長和鮮干重均有顯著性提高(圖3B-D)(P<0.05)。值得注意的是在正常條件下，DA-6浸種顯著降低了幼苗根長與鮮重(圖3A，C)(P<0.05)，但沒有影響幼苗的干重(圖3D)。

圖3 水浸種或DA-6浸種對種子生長的影響

2.2 種子滲透調(diào)節(jié)

正常條件下DA-6浸種前處理對幼苗中的游離脯氨含量和滲透勢無顯著影響(圖4A，C)，但提高了可溶性糖含量，增幅為14.34%(圖4B)(P<0.05)。在鹽脅迫下，DA-6浸種前處理顯著提高了鹽脅迫下白三葉幼苗的滲透勢(圖4C)，但對可溶性糖和游離脯氨酸的含量沒有顯著影響(圖4A，4B)。

圖4 水浸種或DA-6浸種對種子滲透調(diào)節(jié)的影響

2.3 種子抗氧化防御

鹽脅迫顯著誘導(dǎo)了白三葉幼苗中超氧陰離子，H2O2和MDA的積累(圖5A-D)(P<0.05)。EL在鹽脅迫下也顯著高于正常條件(P<0.05)。在正常條件下，EL、超氧陰離子、H2O2和MDA含量在兩種處理的幼苗之間沒有顯著性差異(P>0.05)。經(jīng)過DA-6浸種前處理的種子在鹽脅迫下EL、超氧陰離子含量、H2O2含量和MDA含量分別降低了19.39%,26.49%,23.40%和17.24%。

圖5 水浸種或DA-6浸種對種子氧化損傷的影響

鹽脅迫顯著降低了萌發(fā)種子中SOD的活性(圖6B)(P<0.05)，但顯著提高了CAT的活性(圖6D)(P<0.05)，對于APX和POD的活性沒有顯著性影響(圖6A，C)(P>0.05)。DA-6浸種前處理顯著提高了鹽脅迫下APX、SOD和POD的活性，增幅分別為49.1%、33.0%和31.9%(圖6A-C)(P<0.05)。在正常條件下，兩種前處理幼苗的抗氧化酶活性沒有顯著性差異(圖6A-D)(P>0.05)。

圖6 水浸種或DA-6浸種對種子抗氧化酶活性的影響

3 討論

植物鹽脅迫損害的典型癥狀包括葉片黃化、枯萎和生長抑制等，而在種子萌發(fā)階段，鹽脅迫帶來的傷害主要表現(xiàn)在降低種子發(fā)芽率，抑制胚芽與胚根的生長[7]。研究發(fā)現(xiàn)，NaCl濃度大于68.4 mmol·L-1時(shí)，白三葉的發(fā)芽率整體低于30%，白三葉胚根長度顯著降低[34]。這與本研究結(jié)果相一致，即鹽脅迫降低了白三葉種子的發(fā)芽率并顯著抑制胚根的生長。已有研究顯示，通過化學(xué)物質(zhì)對種子進(jìn)行浸種前處理是一種促進(jìn)脅迫條件下種子萌發(fā)的有效方法[35]。張明才等[36]研究發(fā)現(xiàn)，DA-6+Mo復(fù)配劑可以促進(jìn)甜豌豆(Lathyrusodoratus)干物質(zhì)積累，提高可溶性糖、可溶性蛋白和氨基酸的含量。本研究中，使用植物生長調(diào)節(jié)劑DA-6溶液(0.8 mmol·L-1)浸種前處理可顯著改善鹽脅迫下白三葉種子的萌發(fā)情況，顯著提高發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、根長、莖長、鮮重和干重，有效緩解鹽脅迫對白三葉種子萌發(fā)的抑制作用。然而，在正常條件下外源DA-6卻顯著降低了根長和鮮重，提高了莖長和干重，這表明DA-6對種子萌發(fā)過程中根和莖的調(diào)節(jié)效應(yīng)有所不同，但其調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)，會(huì)經(jīng)歷生理性缺水和單離子的毒性作用。細(xì)胞對高濃度Na+的吸收限制了K+的吸收，導(dǎo)致鹽脅迫期間的Na+毒性增加并引起其它營養(yǎng)元素的失衡[37-38]。在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)，植物可以通過積累可溶性糖和游離脯氨酸等有機(jī)代謝物或Na+和K+等無機(jī)離子降低滲透勢，維持自身滲透平衡[39-40]。其中，常見的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有游離脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿等[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫誘導(dǎo)了游離脯氨酸和可溶性糖的大量積累，同時(shí)伴隨著滲透勢的顯著降低。Cheng等[11]研究表明鹽脅迫顯著增加了白三葉幼苗的可溶性糖、游離氨基酸和游離脯氨酸含量，顯著降低了幼苗的滲透勢。熊韜等[42]研究表明，甜瓜(Cucumismelo)內(nèi)的游離脯氨酸和可溶性糖含量隨鹽脅迫的增強(qiáng)而提升，可溶性蛋白含量降低，甜菜堿在不同品種內(nèi)有不同的變化趨勢。然而，本研究中水浸種和DA-6浸種的種子在鹽脅迫萌發(fā)過程中可溶性糖含量和游離脯氨酸含量沒有顯著性差異，但滲透勢卻有所不同。這可能是在鹽脅迫下，除游離脯氨酸和可溶性糖等有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)影響滲透勢外，無機(jī)離子Na+和K+的吸收和積累也會(huì)導(dǎo)致鹽脅迫下細(xì)胞滲透勢顯著降低。水浸種的白三葉種子在鹽脅迫下是否吸收和積累更多的Na+離子從而導(dǎo)致了更低的細(xì)胞滲透勢，仍有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

利用DA-6(0.8 mmol·L-1)進(jìn)行浸種前處理可以改善鹽脅迫下白三葉種子的萌發(fā)。鹽脅迫下，外源DA-6提高了白三葉種子在鹽脅迫下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、莖長和鮮干重。鹽脅迫顯著誘導(dǎo)了游離脯氨酸和可溶性糖的積累，伴隨著顯著降低的細(xì)胞滲透勢。此外，DA-6浸種前處理還可以提高鹽脅迫下抗氧化酶(APX、SOD和POD)的活性，增強(qiáng)幼苗的抗氧化防御能力，這有效地緩解了由鹽脅迫引起的氧化損傷，從而穩(wěn)定細(xì)胞膜，有利于鹽脅迫下白三葉種子的萌發(fā)。