崔 婷，王 勇，?？e，董文科，張 然，馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070)

鎘(Cadmium，Cd)是典型的土壤重金屬污染物，主要來自于工礦“三廢”的排放及人類農(nóng)事活動中農(nóng)藥化肥的過量使用[1]。Cd是植物非必要的微量金屬元素，當其進入植物體并積累到一定程度時，就會表現(xiàn)為生長抑制、失綠、萎蔫，甚至死亡等毒害癥狀[2-3]。因而尋求一種安全有效的土壤Cd污染治理手段是當務之急。植物修復是一種高效、經(jīng)濟、環(huán)保的重金屬污染土壤修復技術[4-5]。由于草地早熟禾對Cd的吸收效率高、抗Cd能力強、生物量高、生長快[6]。因此，草地早熟禾在Cd污染土壤修復中具有潛在優(yōu)勢[7]。

Cd的亞細胞分布和化學形態(tài)會影響其在植物體的積累和耐受性[8-9]。植物細胞壁沉積和液泡區(qū)隔化在重金屬脫毒、耐受和過量積累中起著重要作用[10]。細胞壁是阻止Cd進入植物體的第一道屏障，Cd進入后可以被細胞壁成分的活性基團如果膠、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等螯合，從而改變植物結合Cd的能力，并提高植物對Cd的耐受性[11-12]。液泡是細胞可溶性組分中最重要的組成部分，能夠儲存代謝物、信號物質(zhì)和潛在毒性物質(zhì)，是大多數(shù)植物提高重金屬耐性的主要途徑[13-14]。此外，植物中Cd存在的不同化學形態(tài)是另一種重要的Cd解毒機制。有研究表明，以無機和有機形式存在的水溶性Cd的生物利用率、遷移性和毒性高于與果膠和蛋白質(zhì)結合的Cd，而難溶性Cd磷酸鹽和與草酸結合的Cd毒性較小[15-16]。植物根細胞中的無機態(tài)Cd、水溶性有機酸和H2PO4結合的Cd以及與果膠和蛋白質(zhì)結合的Cd，一部分被區(qū)隔在液泡中，另一部分被裝載到木質(zhì)部中，通過長距離運輸從根轉(zhuǎn)運至地上部[17]。難溶解的Cd磷酸鹽和草酸結合的Cd則是貯存在液泡和細胞壁中[16]。這些化學形態(tài)具有較低的移動性和植物毒性，在Cd的解毒中起著關鍵作用。

在本課題組前期研究中，發(fā)現(xiàn)高濃度的Cd脅迫會抑制草地早熟禾的生長及代謝[7]。然而，關于Cd在草地早熟禾中的分配和解毒機制尚不明確。本試驗以耐Cd品種‘午夜’(‘Midnight’，M)和敏感品種‘橄欖球2號’(‘Rugby II’，R)為研究材料，探究600 μmol·L-1Cd脅迫對草地早熟禾的亞細胞分布和化學形態(tài)的影響。試驗結果旨在為重金屬污染土壤的草地早熟禾修復提供理論及實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及來源

供試材料為耐Cd草地早熟禾品種‘午夜’(Midnight)和敏感品種‘橄欖球2號’(RugbyⅡ)，均為本課題組前期篩選所得[18]。種子購買自北京克勞沃草業(yè)技術開發(fā)中心。

1.2 試驗設計

1.2.1試驗材料培養(yǎng) 供試種子經(jīng)0.1%(W/V)次氯酸鈉溶液消毒15 min，滅菌水沖洗5～6次，晾干后均勻撒播0.2 g草地早熟禾種子至以蛭石為基質(zhì)的育苗盤中(8 cm×10 cm)，發(fā)芽后置于人工氣候箱(光強2 000 lx，光期14 h，25℃，濕度70%；暗期10 h，20℃，濕度60%)繼續(xù)培養(yǎng)。每天噴灑蒸餾水待幼苗長至3 cm時改用Hoagland營養(yǎng)液澆灌，每5 d更換一次營養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)30 d后，挑選長勢一致的幼苗移栽至水培盒(長×寬×高:12 cm × 8 cm ×11 cm)，每盒移栽18株草地早熟禾，Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)7 d后進行Cd脅迫處理。

1.2.2試驗設計與處理 M和R品種各挑選8盒上述水培盒中長勢一致的幼苗，處理組(Cd)在營養(yǎng)液條件下根施600 μmol·L-1Cd脅迫，對照組(CK)繼續(xù)用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，每個處理包含4個水培盒作為重復。期間每5 d更換一次處理液，處理14 d后進行各項指標測定。

1.3 指標測定與方法

1.3.1幼苗生長指標測定 株高：采用厘米尺測定。葉片和根系鮮重：采用分析天平稱量。

1.3.2亞細胞組分分離與Cd含量測定 亞細胞組分的分離參照Wu等[4]的方法，稱取1 g新鮮草地早熟禾葉片或根系用10 mmol·L-1EDTA-Na2解離表面吸附的Cd2+20 min，然后用蒸餾水沖洗干凈后，加入20 mL預冷的提取液[0.25 mmol·L-1蔗糖+50 mmol·L-1Tris-HCI緩沖液(pH=7.5)]及植物樣品至研缽中，研磨勻漿。混合液離心10 min(2 000 g，4℃)，沉淀為細胞壁，上清液繼續(xù)離心45 min(12 000 g，4℃)，沉淀為細胞器，上清液為可溶性部分。細胞壁和細胞器組分在105℃烘至恒重，并加入7 mL HNO3和1 mL H2O2在微波消解儀中消解至澄清，1%HNO3定容至50 mL，而后用原子吸收分光光度計(AA-6800，島津，日本)測定細胞壁、細胞器及可溶性部分的Cd含量。

1.3.3植物組織分離、組織Cd含量測定及Cd的化學形態(tài)提取 植物組織分離參照以下方法[17]，分別將2.5 g草地早熟禾葉片或根系剪碎后，加入80%乙醇冰浴研磨至葉肉和維管束分離，根系皮層和中柱分離，勻漿通過0.15 mm尼龍網(wǎng)過濾，在光學顯微鏡下觀察根系中柱和葉片維管束，不含有皮層和葉肉時結束分離，即葉片分離為表皮和葉肉(濾液)及維管束(殘渣)，根系分離為表皮和皮層(濾液)及中柱(殘渣)。不同組織分離物在80℃烘至恒重用于后續(xù)試驗。不同組織Cd含量消解與測定方法同1.3.2。

Cd的化學形態(tài)的提取采用五步連續(xù)提取法[19]，將0.2 g草地早熟禾葉片或根系干燥粉碎，依次加入5種不同的萃取劑進行提取，每種萃取劑加入40 mL，每次提取24 h，萃取劑的加入和相應的Cd的化學形態(tài)如下：

(1)80%乙醇，提取水溶性無機態(tài)Cd;

(2)去離子水，提取水溶性的有機酸鹽及Cd(H2PO4)2；

(3)1 mol·L-1NaCl，提取果膠和蛋白結合態(tài)Cd；

(5)0.6 mol·L-1HCl，提取草酸結合態(tài)Cd。

最后為殘留態(tài)，加入混合酸10 mL(HNO3∶HClO4=5∶1)，蓋上彎頸漏斗，放置于通風櫥內(nèi)浸提過夜，將樣品轉(zhuǎn)移到溫度可調(diào)的電熱板上，微熱至反應物顏色變淺，用少量去離子水沖洗錐形瓶內(nèi)壁，逐步提高溫度至消化液處于微沸狀態(tài)，消解至澄清后用原子吸收分光光度計測定Cd含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 25.0進行顯著性檢驗，測定結果用“平均值±標準誤”表示，使用GraphPad Prism 9.0.0作圖。

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫對草地早熟禾生長的影響

Cd脅迫下，敏感品種R與耐Cd品種M相比，表現(xiàn)出嚴重的失綠癥狀(圖1A～1B)。Cd脅迫顯著抑制草地早熟禾株高，與CK相比，M和R株高在Cd脅迫處理下分別降低18.83%和22.03%，差異顯著(P<0.05)。Cd處理下M品種葉片鮮重與CK相比無顯著差異，但Cd脅迫顯著降低R品種葉片鮮重(P<0.05)。另外，M和R根系鮮重在Cd脅迫下均被顯著抑制，R品種下降幅度更大(P<0.05)。這些結果證明M品種具有更高的Cd耐受性。

圖1 Cd脅迫對草地早熟禾表型(A，B)、株高(C)及鮮重(D，E)的影響

2.2 Cd在草地早熟禾不同組織中的分布

Cd在在不同組織中的分布與其植物毒性及轉(zhuǎn)移能力密切相關。圖2顯示了Cd在不同抗性草地早熟禾表皮+葉肉、維管束、表皮+皮層、中柱中的分布。耐Cd品種M葉片的表皮+葉肉、維管束及根系表皮+皮層中的Cd含量顯著低于R品種(P<0.05)，而根系中柱中的Cd含量兩個品種之間差異不顯著(圖2A和2B)。因此，敏感品種R對Cd具有更高轉(zhuǎn)運能力。

圖2 Cd在草地早熟禾不同組織中的分布

2.3 Cd在不同抗性草地早熟禾中的亞細胞分布

Cd的亞細胞分布與其生物毒性密切相關。圖3A顯示，M品種細胞壁組分Cd含量顯著低于R品種(P<0.05)。R品種葉片和根系細胞器部分Cd含量均高于M品種(圖3B)，且在葉片中差異顯著(P<0.05)。而根系可溶性部分Cd含量(圖3C)M品種顯著高于R品種(P<0.05)。亞細胞組分Cd的分布比例分析發(fā)現(xiàn)(圖3D)，R品種葉片中可溶性部分Cd含量占比小于M品種，而細胞器部分Cd含量占比高于R品種。根系中，M品種可溶性部分Cd含量高于R品種。這些結果表明，R品種細胞器組分含有較高的Cd含量及可溶性部分含有較低Cd含量。

圖3 Cd在耐Cd及Cd敏感品種草地早熟禾的亞細胞中分布

2.4 Cd在草地早熟禾不同組織中的化學形態(tài)

Cd在植物中的化學形態(tài)與其可移動性及植物毒性密切相關。圖4A顯示，R品種表皮+葉肉、維管束、根表皮+皮層組織中乙醇提取的無機態(tài)Cd含量顯著高于M品種(P<0.01)。而水溶性的有機酸鹽和可溶性磷酸鹽態(tài)的Cd在M品種根表皮+皮層和中柱中顯著高于R品種(P<0.05)，但在表皮+葉肉中R品種有機酸鹽和可溶性磷酸鹽態(tài)的Cd含量較高(圖4B)。圖4C顯示，NaCl提取的果膠酸鹽結合的Cd在M品種各組織均低于R品種(P<0.05)。圖4D和4F表明，M品種中HAc提取的難溶性磷酸鹽態(tài)的Cd及殘渣態(tài)的Cd在表皮+葉肉、維管束、根表皮+皮層組織中顯著高于低于R品種(P<0.05)。另外，HCl提取的草酸鹽態(tài)的Cd在M品種表皮+葉肉、根表皮+皮層中顯著低于R品種，但在根系中柱中M品種草酸鹽態(tài)的Cd含量顯著高于R品種(圖4E)。

圖4 Cd在草地早熟禾不同組織中的化學形態(tài)

2.5 不同組織中各化學形態(tài)Cd的分布比例

R品種各組織中果膠酸鹽和蛋白質(zhì)結合的Cd含量占比最高(圖5)。在葉片表皮+葉肉和維管束中，M品種中水溶性有機酸鹽和可溶性磷酸鹽態(tài)Cd占比最高(圖5A和5B)。但在M品種根表皮+皮層和中柱中果膠酸鹽和蛋白質(zhì)結合的Cd含量占比最高(圖5C和5D)。M品種中水溶性有機酸鹽和可溶性磷酸鹽態(tài)Cd占比在各組織中均高于R品種(圖5)。另外，M品種維管束中HAc提取的難溶性磷酸鹽態(tài)的Cd占比高于R品種(圖5B)。M品種HCl提取的草酸鹽態(tài)的占比Cd在維管束、根表皮+皮層、中柱中含量均高于R品種(圖5B～5D)。

圖5 草地早熟禾不同組織中各化學形態(tài)Cd分布比例

3 討論

植物通過共質(zhì)體結合的方式將體內(nèi)大量的Cd吸附在細胞壁上，而進入細胞的Cd一部分被液泡螯合，而另一部分通過共質(zhì)體途徑進行從根系到葉片的長距離運輸[20]。通常認為，細胞壁和液泡螯合的Cd具有較低的移動性和毒性，而吸附在細胞器或細胞質(zhì)中游離的Cd具有更高的移動性和毒性[21]。本研究觀察到，未施加Cd脅迫時，M品種和R品種葉片和根系鮮重無顯著差異，R品種株高顯著高于M品種，Cd脅迫下耐Cd草地早熟禾品種M根系和葉片受到的生長抑制較小，葉片失綠較少，而Cd敏感品種R則受到更嚴重的生長抑制及葉片黃化(圖1)。進一步分析M和R品種根系和葉片各組織中的Cd含量，發(fā)現(xiàn)R品種葉片表皮+葉肉、維管束及根表皮+皮層中Cd含量顯著高于M品種(圖2)。因此，R品種對Cd敏感是可能因為更多的Cd進入共質(zhì)體途徑并向葉片轉(zhuǎn)運。

Cd在亞細胞水平的分布與其毒性密切相關，細胞壁組分果膠和半纖維素含有豐富的游離羧基和羥基，可以結合大量的Cd，從而減少Cd向細胞內(nèi)部的運輸[22]。另外，Cd脅迫通?？梢鸺毎谀举|(zhì)化，減少Cd進入細胞[23]。而進入細胞的Cd可被谷胱甘肽、植物螯合肽、有機酸、煙酰胺等金屬配位體螯合，降低Cd毒性，或者以游離態(tài)的形式吸附在細胞器和細胞膜上，造成毒害作用[24-26]。金屬配位體螯合的Cd一部分進入液泡保存，另一部分被轉(zhuǎn)運進入中柱進行長距離運輸[27]。因此，細胞壁結合與液泡區(qū)隔化在植物Cd解毒中具有關鍵作用。研究認為，細胞中可溶性Cd可以代表其液泡中保存的Cd[20]。在草地早熟禾中，大部分的Cd可與細胞壁結合或被保存在液泡中。因此，液泡區(qū)隔化及細胞壁結合兩種方式是草地早熟禾主要的解毒方式。另外，我們發(fā)現(xiàn)R品種細胞壁與細胞器部分Cd含量均高于M品種，而在M品種根系中可溶性部分Cd含量占比均高于R品種。這些結果表明，相比于R品種，M品種對Cd的吸收能力較弱，同時可將更多的Cd保存在液泡中，減輕毒害作用。而R品種吸收Cd的能力較強，同時細胞器中Cd含量較高，這可能是導致其對Cd敏感的主要原因。

Cd在植物體內(nèi)的移動性及毒性與其存在的化學形態(tài)密切相關[22]。研究表明，在低濃度Cd處理下，高Cd積累型的豆瓣菜(NasturtiumofficinaleR.Br.)水溶性Cd含量高于低Cd積累型豆瓣菜，但高Cd濃度處理可提高低Cd積累型品種水溶性Cd的比例[28]。草地早熟禾中，M品種中無機態(tài)Cd含量顯著低于R品種，這可能是由R品種較高的富集量引起。草地早熟禾M品種根表皮+皮層及中柱中水溶性有機酸和可溶性磷酸鹽結合的Cd顯著高于R品種，這可能是因為Cd脅迫促進M品種有機酸合成[29]。在R品種中果膠酸鹽和蛋白質(zhì)結合態(tài)的Cd及難溶性磷酸鹽結合的Cd顯著高于M品種，可能有利于R品種吸收大量Cd之后緩解其毒性[4]。M品種草酸鹽態(tài)Cd在中柱中的含量顯著高于R品種，由于其移動性較差，可能降低了M品種中Cd從根系向葉片的轉(zhuǎn)運[30]。而殘渣態(tài)Cd含量在R品種中顯著高于M品種可能由R品種吸收較多Cd導致。此外，M品種中較高占比的有機酸鹽態(tài)Cd(水溶性有機酸及草酸鹽)可能在提高M品種在Cd脅迫下的抗性中具有關鍵作用。

4 結論

草地早熟禾耐Cd品種M對Cd的吸收和轉(zhuǎn)運能力低于敏感品種R。細胞壁螯合與液泡區(qū)隔化作用是草地早熟禾降低Cd毒性及減少向上運輸?shù)年P鍵機制。較高的液泡區(qū)隔化作用使得M品種在Cd脅迫下抗性更高。另外，Cd脅迫下M品種可通過增加可溶性有機酸及草酸鹽結合的Cd提高其抗性并降低Cd向葉片的長距離運輸。