何瓊姿,韋鵬,劉歡歡,張俊芝,劉彤彤,石琨群,徐藝,劉史佳

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院,江蘇 南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210023;3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis, UC)屬于炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)的范疇,是一種慢性特發(fā)性腸道疾病，其特征是從直腸近端延伸的持續(xù)性黏膜炎癥[1]。目前對于UC的治療藥物主要為氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、英夫利西單抗(IFX)等，這些藥物能在一定程度上緩解結(jié)腸炎癥,但仍然存在治療局限性、療效差、患者不耐受等情況[2]。中醫(yī)藥治療UC由來已久,并且已經(jīng)在臨床上取得較好療效,其中以白頭翁湯為代表的仲景方最為多用。白頭翁湯由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮組成,主治熱毒痢疾,廣泛應(yīng)用于濕熱型UC?，F(xiàn)代研究表明白頭翁湯可通過調(diào)節(jié)腸道菌群、改善短鏈脂肪酸代謝、維持Th17/Treg平衡、抑制IL-6/STAT3信號通路等方式改善結(jié)腸炎癥[3-5]。

mTORC1是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)中的一種復(fù)合物。越來越多的證據(jù)表明,mTORC1與結(jié)腸炎癥的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。結(jié)腸上皮mTORC1-STAT3-COX信號軸能介導(dǎo)輔助性T細(xì)胞17(Th17)炎性浸潤，從而促進(jìn)UC的發(fā)生[6]。然而mTORC1相關(guān)的信號通路在白頭翁湯緩解UC的作用機制中還未被報道。本課題擬采用3.5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)構(gòu)建小鼠UC模型,造模同時每日給予小鼠白頭翁湯干預(yù),并以mTORC1抑制劑雷帕霉素給藥組小鼠作為陽性對照,通過檢測白頭翁湯給藥對mTORC1-STAT3-COX-2信號通路的影響,探討其預(yù)防UC的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6雌鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所,動物許可證號:SYXK(蘇)2018-0008，飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)院藥理實驗室SPF動物房。飼養(yǎng)條件:12 h亮/暗循環(huán),相對濕度50%～60%,室內(nèi)溫度25 ℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周左右,待體質(zhì)量達(dá)20 g左右進(jìn)行造模。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批號：2022DW-16-02。

1.2 實驗藥物

白頭翁湯中藥飲片由白頭翁15 g，黃柏6 g，黃連12 g，秦皮12 g組成,購自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。按照5∶2∶4∶4的比例稱取白頭翁、黃柏、黃連、秦皮藥材飲片,加10倍水煎2次,每次30 min。合并2次藥液,濾去殘渣,按給藥劑量濃縮到所需濃度,儲存于4 ℃;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,上海源葉生物科技有限公司,批號:20210107);雷帕霉素(Rapamycin,上海源葉生物科技有限公司,批號:H03A10Y94335),給藥劑量為2 mg·kg-1;DSS(美國MP Biomedicals公司,批號:S6132),用純水溶解,造模濃度為3.5%。

1.3 試劑與儀器

核糖體S6蛋白激酶(P70S6K)抗體、磷酸化核糖體S6蛋白激酶(p-P70S6K)抗體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)抗體、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)抗體(美國Cell Signaling Technology公司,批號:9202、9234、4904、9134);哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)抗體、內(nèi)參Tubulin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號:66878-1-Ig、67778-1-Ig,11224-1-AP); LEGENDplex多因子檢測試劑盒(美國BioLegend公司,批號:B328132);總RNA提取試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司,批號:M2114061);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司,批號:7E581J1);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司,批號:B6102060);RIPA裂解液(北京索萊寶生物科技有限公司,批號:20211123);蛋白酶抑制劑Cocktail(Biosharp生物科技公司,批號:21340508);磷酸酶抑制劑(Biosharp生物科技公司,批號:21291683);高速離心機(美國賽默飛世爾科技公司,型號:Legend Micro 21R);酶標(biāo)儀(杭州奧盛儀器有限公司,型號:AMR-100);熒光分子成像系統(tǒng)(上海弘基電腦有限公司,型號:C500×);電泳儀(美國Bio-Rad公司,型號:Mini-PROTEAN Tetra);熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾科技公司,型號:QuantStudio3);流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司,型號:Navios)。

1.4 實驗分組及給藥

40只成年雌性C57BL/6小鼠隨機分為空白組、模型組、白頭翁湯組及雷帕霉素組,每組10只?？瞻捉M小鼠正常飲水,其他3組小鼠每日給予3.5%的DSS溶液誘發(fā)炎癥。從造模第1天開始同時伴隨給藥處理。白頭翁湯組每日予以0.2 mL藥液進(jìn)行灌胃,雷帕霉素組小鼠每日腹腔注射0.2 mL雷帕霉素藥液,空白組和模型組則對應(yīng)用等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。每日在固定時間段記錄各組小鼠體質(zhì)量及糞便性狀,并進(jìn)行DAI評分。7 d后處死小鼠進(jìn)行取材,眼眶取血,摘取結(jié)腸并測量盲腸中部到結(jié)腸末端的長度,取1 cm干凈組織放入4%多聚甲醛固定液,剩余結(jié)腸組織保存在-80 ℃。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 DAI評分 DAI評分由體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)、糞便性狀分?jǐn)?shù)與便血分?jǐn)?shù)組成。質(zhì)量每下降5%為1分,以此類推,最高4分;糞便形態(tài)從正常到水樣不成型分別記0～4分;便血程度從無血便到肉眼可見明顯血便分別記0～4分。三者相加,即為DAI評分。

1.5.2 組織病理學(xué)分析 將固定在多聚甲醛中的結(jié)腸組織依次進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色及封片,最后用顯微鏡鏡檢,并分析采集圖片。病理評分標(biāo)準(zhǔn)分為上皮損傷及黏膜炎細(xì)胞浸潤2個方面。按照損傷或浸潤程度分別計0～4分,兩者相加即為組織病理學(xué)評分。

1.5.3 高通量流式技術(shù)檢測炎癥因子 小鼠眼眶取血后,3 000 r·min-1離心15 min,吸取上清液置于干凈的無酶EP管。血清樣本處理步驟按照LEGENDplex多因子試劑盒說明書執(zhí)行,使用貝克曼流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5.4 Western blot檢測結(jié)腸組織p-P70S6K、p-STAT3、p-mTOR蛋白表達(dá)水平 稱取20 mg小鼠結(jié)腸組織,加入200 μL RIPA-PMSF-磷酸酶抑制劑混合液,勻漿后置于冰上裂解30 min,充分裂解后12 000 r·min-1離心10 min,吸取上清,按照BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品存于-20 ℃。每次使用20 μg總蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳,電泳電壓恒定200 V。將凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上在300 mA下轉(zhuǎn)膜1.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用5%脫脂牛奶將NC膜封閉0.5 h。封閉結(jié)束后清洗條帶,按說明書稀釋抗體,4 ℃孵育搖床過夜?；厥找豢?清洗條帶,按1∶10 000的比例配制二抗,室溫條件孵育1 h。倒掉二抗,條帶用PBST清洗3次。按1∶1比例配制發(fā)光顯影液,進(jìn)行曝光。保存圖片并用ImageJ對圖像灰度進(jìn)行定量分析。

1.5.5 免疫組化檢測結(jié)腸組織p-P70S6K的陽性表達(dá) 將存于固定液中的結(jié)腸組織進(jìn)行蠟塊包埋后,依次進(jìn)行石蠟切片、脫蠟脫水、檸檬酸抗原修復(fù)、PBS洗滌、3%雙氧水緩沖液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、3%BSA封閉、加一抗孵育過夜、加二抗孵育60 min、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、干燥脫水、封片處理。最后鏡檢,并將白光顯微鏡下的圖像陽性面積所占比例進(jìn)行評分,評分越高,表明陽性比例越大。

1.5.6 qPCR檢測結(jié)腸組織中COX-2 mRNA表達(dá) 剪取12 mg左右小鼠結(jié)腸組織,按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA,采用超微量熒光紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度。依照試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,將合成的cDNA 作為熒光定量的模板,對內(nèi)參β-actin及COX-2的基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增引物由擎科生物科技有限公司合成。引物序列:β-actin上游5'-CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT-3',β-actin下游5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3';COX-2上游5'-GCGACATACTCAAGCAGGAGCA-3',COX-2下游5'-AGTGGTAACCGCTCAGGTGTTG-3'。實驗結(jié)果利用2-ΔΔCt公式進(jìn)行計算。

2 結(jié)果

2.1 白頭翁湯對UC小鼠一般情況的影響

白頭翁湯對DSS誘導(dǎo)的小鼠UC的影響通過DAI評分、體質(zhì)量下降百分比、結(jié)腸長度來評估。圖1A是小鼠的體質(zhì)量下降百分率圖,由圖可知空白組小鼠呈自然增長,曲線平緩,模型組小鼠隨著時間增長,炎癥逐步加重從而導(dǎo)致體質(zhì)量持續(xù)下降,而白頭翁湯組與雷帕霉素組曲線介于模型組與空白組之間,且數(shù)值與模型組均有顯著性差異(P<0.001)。圖1B是小鼠第7天的DAI評分圖,由體質(zhì)量減失率分?jǐn)?shù)、糞便性狀分?jǐn)?shù)和便血分?jǐn)?shù)相加而得,能綜合地評估小鼠的炎癥程度?？瞻捉M小鼠DAI評分最低,模型組最高,雷帕霉素組與白頭翁湯組DAI評分與模型組相比顯著下調(diào)(P<0.001)。圖1C分別為小鼠結(jié)腸長度定量統(tǒng)計,可以看到空白組小鼠結(jié)腸長度最長,模型組結(jié)腸長度最短,而雷帕霉素組與白頭翁湯組則明顯改善了這種縮短趨勢(P<0.01,P<0.001)。

注:Control.空白組;DSS.模型組;BTW.白頭翁湯組;RAPA.雷帕霉素組;與空白組比較,###P<0.001;與模型組比較,***P<0.001,**P<0.01。圖1 白頭翁湯改善了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀Fig.1 Baitouweng decoction ameliorated the symptoms of DSS-induced colitis

2.2 UC小鼠的組織病理學(xué)分析

小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果如圖2所示,空白組小鼠黏膜層上皮完整,細(xì)胞排列緊密,形態(tài)正常,排列緊密,杯狀細(xì)胞豐富,無炎性浸潤。模型組組織廣泛潰瘍,黏膜上皮及腸腺丟失,伴大量杯狀細(xì)胞丟失,有較多炎性細(xì)胞浸潤,黏膜下層出現(xiàn)水腫。白頭翁湯和雷帕霉素給藥組小鼠結(jié)腸組織炎性細(xì)胞浸潤更少,組織損傷程度減輕。病理學(xué)評分如表1所示,空白組最低,模型組最高。與模型組相比,白頭翁湯組和雷帕霉素組評分均下降(P<0.01，P<0.001)。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織的代表性HE染色圖(×200)Fig.2 Representative hematoxylin-eosin (HE) staining of colon tissues of mice in each group (×200)

表1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分Table 1 Histological scores of colon tissues of mice

2.3 白頭翁湯對UC小鼠炎癥因子表達(dá)的影響

與空白組相比,模型組小鼠血清中炎癥因子IL-6、TNF-α含量明顯升高(P<0.001)。與模型組相比,在給予白頭翁湯與雷帕霉素干預(yù)的小鼠中,IL-6含量下降(P<0.001),TNF-α也發(fā)生下調(diào)(P<0.001，P<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠血清IL-6和TNF-α的含量Table 2 Contents of IL-6 and TNF-α in mouse

2.4 小鼠結(jié)腸組織中p-mTOR、p-STAT3、p-P70S6K蛋白表達(dá)情況

如圖3,各組小鼠結(jié)腸組織中mTOR、STAT3和P70S6K總蛋白表達(dá)情況接近。空白組p-mTOR、p-STAT3和p-P70S6K表達(dá)最少,而模型組小鼠結(jié)腸中這三種磷酸化蛋白表達(dá)最高。與模型組相比,白頭翁湯組和雷帕霉素組小鼠結(jié)腸組織p-mTOR、p-STAT3和p-P70S6K蛋白表達(dá)減少。目的蛋白定量結(jié)果如表3,與模型組相比,白頭翁湯組和雷帕霉素組p-mTOR/mTOR、p-STAT/STAT3和p-P70S6K/P70S6K值均下降(P<0.05，P<0.01,P<0.001)。

圖3 小鼠結(jié)腸組織免疫印跡電泳圖Fig.3 Western blot images of mouse colon tissues

表3 各組小鼠結(jié)腸組織p-P70S6K/P70S6K、p-STAT/STAT3和p-mTOR/mTOR值比較Table 3 Comparison of p-P70S6K/P70S6K、p-STAT/STAT3 and p-mTOR/mTOR in colon tissue of mice in each

2.5 免疫組化檢測小鼠結(jié)腸組織p-P70S6K蛋白表達(dá)

如圖4與表4所示,p-P70S6K在空白組少量腸黏膜上皮細(xì)胞胞漿中呈陽性表達(dá),在模型組腸黏膜上皮及炎細(xì)胞中表達(dá)明顯增加。與模型組相比,白頭翁湯組和雷帕霉素組小鼠結(jié)腸組織中p-P70S6K表達(dá)明顯下降,組化評分也顯著降低(P<0.001)。

2.6 小鼠結(jié)腸組織COX-2 mRNA表達(dá)情況

與空白組相比,模型組小鼠結(jié)腸組織中COX-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)。與模型組相比,白頭翁湯及雷帕霉素給藥組小鼠結(jié)腸組織中COX-2 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.001)。見表5。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織p-P70S6K免疫組化圖片(×200)Fig.4 The immunohistochemical staining of p-P70S6K in mouse colon tissues (×200)

表4 各組小鼠結(jié)腸組織p-P70S6K免疫組化評分Table 4 The immunohistochemical score of p-P70S6K in

表5 各組小鼠結(jié)腸組織COX-2 mRNA表達(dá)情況Table 5 The mRNA level of COX-2 in mouse colon

3 討論

UC作為一種反復(fù)發(fā)作且難以治愈的慢性腸道疾病,通常認(rèn)為其發(fā)病機制與腸道微生物的改變、宿主免疫系統(tǒng)破壞、遺傳易感性等因素有關(guān)[7]。UC的主要臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏濃液、便血,可惡化為結(jié)腸癌。近年來,UC的發(fā)病率在世界各地都在持續(xù)升高[8],已經(jīng)成為了一種全球性疾病。我國在2012 IBD共識中提到中醫(yī)藥可用于防治UC。UC屬中醫(yī)“下利” “久痢”“腸癖”“痢疾”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為,濕熱內(nèi)蘊貫穿UC發(fā)生發(fā)展的始終,素體脾氣虛弱是發(fā)病基礎(chǔ),情志失調(diào)是發(fā)病誘因[9]。白頭翁湯作為仲景方中的清利名方之一,其對UC的治療效果早有記載?！督饏T要略》中提到“下利欲飲水者,以有熱故也,白頭翁湯主之”。白頭翁湯由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮組成,全方四味藥均為清熱解毒止痢要藥,四藥合用,為治療熱毒血痢之良方。

mTOR是一個對結(jié)腸炎癥的發(fā)生發(fā)展有著重要意義的信號通路。多種炎癥因子如 TNF-α、IL-10、IL-6 及 IL1-β等分泌均受 mTOR 信號調(diào)節(jié)。抑制mTOR能顯著減少了腸黏膜中的白細(xì)胞黏附和外滲、降低T細(xì)胞數(shù)量并阻斷淋巴細(xì)胞的干擾素釋放，從而改善結(jié)腸炎癥[10-11]。mTORC1是mTOR其中的一種復(fù)合物,它通過感應(yīng)來自細(xì)胞內(nèi)外的各種信號來促進(jìn)物質(zhì)代謝、參與細(xì)胞凋亡與自噬、調(diào)控細(xì)胞生長增殖等多種生理過程[12]。近來研究表明,mTORC1在UC患者及小鼠的結(jié)腸組織中表達(dá)升高,導(dǎo)致炎癥癥狀加劇[6]。這表明,mTORC1可能對UC的發(fā)展有潛在的意義。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)家族中的一員,它在誘導(dǎo)和維持炎癥環(huán)境及腫瘤形成中發(fā)揮著重要作用。STAT3的異?；罨嵌喾N疾病發(fā)生的誘因[13]。IL-6等細(xì)胞因子可通過與其表面抗體結(jié)合直接激活STAT3從而促進(jìn)炎癥[14]。COX-2 是環(huán)氧化酶(COX)的異構(gòu)體,它與炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。在動物模型中,抑制COX-2表達(dá)能明顯改善DSS誘導(dǎo)的UC小鼠體質(zhì)量減輕、腹瀉和便血癥狀[16]。COX-2通過產(chǎn)生對炎癥、疼痛有促進(jìn)作用的前列腺素(PGs)從而誘導(dǎo)UC[17]。其中最主要的PGs為前列腺素E2(PGE2),高水平的PGE2通過激活樹突細(xì)胞(DCs)過表達(dá)白細(xì)胞介素23(IL-23)使結(jié)腸炎癥惡化,并且促進(jìn)Th17細(xì)胞分化從而進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)[18]。在mTORC1-STAT3-COX-2信號軸中,mTORC1在Ser727位點磷酸化STAT3[19],活化的STAT3激活COX-2轉(zhuǎn)錄[20],從而促進(jìn)IL-6等炎癥因子的釋放以及Th17浸潤從而導(dǎo)致結(jié)腸炎癥[21-22]。

在本次實驗中,白頭翁湯方劑和mTORC1抑制劑雷帕霉素均體現(xiàn)出了對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥的預(yù)防作用。相較于模型組,白頭翁湯和雷帕霉素組小鼠體質(zhì)量下降幅度更小,DAI評分更低,結(jié)腸長度更長,組織病理學(xué)評分更低,炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)更少。P70S6K是mTORC1下游標(biāo)志性底物之一,其磷酸化程度可作為檢測mTORC1活性的重要指標(biāo)。與模型組相比,白頭翁湯組和雷帕霉素組小鼠結(jié)腸組織中p-P70S6K/P70S6K值下降,證明了白頭翁湯和雷帕霉素對mTORC1的抑制作用。同時,在2組小鼠結(jié)腸組織中,p-STAT3/STAT3值和COX-2 mRNA的表達(dá)水平也發(fā)生了下降。綜上,本次研究證明了mTORC1可作為UC治療的靶標(biāo),白頭翁湯能有效預(yù)防DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥,其作用通過抑制mTORC1-STAT3-COX-2信號通路來實現(xiàn)。