王銀龍 彭啟敏 賈 盛 王璐瑤 喬獻琦 陳偉麗 蘇戰(zhàn)強 王金泉

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

禁止在飼料中使用抗生素作為生長促進劑已成為全球農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖的流行趨勢，因此，使用益生菌作為抗生素替代品在家畜養(yǎng)殖中已變得越來越廣泛，可以最大限度地減少動物腸道疾病的發(fā)生[1-2]。研究稱同源益生菌可更好地在宿主腸道定植，因此候選益生菌應從目標動物的腸道中分離[3]。芽孢桿菌屬在高熱環(huán)境和低溫儲存過程中具有良好的穩(wěn)定性[4]，此外，芽孢桿菌屬還被證明具有排除病原體、抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)的能力[5-7]。龍舌蘭芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，能形成生物膜，且具有抗真菌生長的作用，可促進植物的生長[8]。Abid等[9]研究發(fā)現(xiàn)，從山羊奶中得到的龍舌蘭芽孢桿菌-GM，可抑制和破環(huán)病原微生物的成膜能力，可用作乳制品的發(fā)酵劑。Parveen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，雞源龍舌蘭芽孢桿菌FR9胞外多糖的含量較多且能與多種病原體聚集，對HCT-116人結(jié)腸癌細胞系具有很強的黏附性并能減少李斯特菌和糞腸球菌的數(shù)量。駱駝可以充分利用荒漠的自然資源，對其生態(tài)環(huán)境條件有很強的適應能力，不同于一般畜禽，飼養(yǎng)環(huán)境一般在荒漠，所用抗生素種類數(shù)量較少，從其腸道分離的益生菌獲得性耐藥的可能性較小。且國內(nèi)外研究駱駝源益生菌集中從駝奶中分離，而關(guān)于駱駝源腸道益生菌的研究很少。因此，本研究旨在尋找具有優(yōu)良益生特性的駱駝源菌株，以及證明其安全性，為雙峰駝的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

提供糞便樣品的駱駝來源于阿勒泰地區(qū)吉木乃縣萬駝園實踐基地。雄性昆明種小鼠[4周齡，無特定病原體(SPF)級，體重(20±2) g]共48只，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，自由飲水和采食。

1.1.2 試驗試劑及供試菌

LB固體及液體培養(yǎng)基、牛膽鹽，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；芽孢桿菌生化鑒定條，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；細菌藥敏紙片(批號：20172400206)，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、總蛋白檢測試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌株由新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院臨床獸醫(yī)學實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

無菌收集駱駝新鮮糞便共計23份。

1.2.2 芽孢桿菌初分離

取駱駝新鮮糞便放入無菌的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，渦旋混勻，在水浴鍋80 ℃加熱處理15 min，預培養(yǎng)16～18 h，梯度稀釋，取10-4、10-5和10-6稀釋度的菌液于LB瓊脂平板上涂布，倒置培養(yǎng)。挑出不同形態(tài)的單菌落，接種純化3代，直至平板上的菌落形狀、大小、顏色一致，革蘭氏染色法觀察菌體形態(tài)，然后將其與50%滅菌甘油按1∶1混合，在-80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 分離菌株的益生菌潛力篩選

1.2.3.1 耐酸性

將分離菌株接種于新鮮的LB營養(yǎng)肉湯中，37 ℃、180 r/min過夜，在室溫下6 000 r/min離心3 min。無菌PBS洗滌3次，再懸浮于10 mL無菌PBS(pH 2.5)中，以無菌PBS(pH 7.2)為對照[11]。培養(yǎng)3 h，在培養(yǎng)過程中分別于1、2、3 h測定600 nm處的吸光度(OD600)值，試驗重復3次，計算相對存活率。

相對存活率(%)=(試驗組平均OD600/對照組平均OD600)×100。

1.2.3.2 耐膽鹽

用牛膽鹽配制膽鹽濃度0.3%的LB肉湯，以不加膽鹽的LB肉湯作為對照，將各菌液分別接種于新鮮的LB肉湯中擴增培養(yǎng)，37 ℃、180 r/min過夜，在室溫下6 000 r/min離心3 min。無菌PBS洗滌3次，以1%接種量再懸浮在0.3%膽鹽的LB液體培養(yǎng)基中[12]。培養(yǎng)6 h，然后分別于2、4、6 h測定OD600，試驗重復3次，計算相對存活率，計算公式同上。

1.2.3.3 藥敏試驗

挑選耐酸、耐膽鹽活性優(yōu)異且穩(wěn)定的分離菌株，采用K-B紙片擴散法測定菌株的抗生素抗性[13]，選取青霉素G、苯唑西林和四環(huán)素等13種藥物進行抗生素敏感性試驗。

1.2.3.4 溶血活性測定

待測菌株在LB肉湯培養(yǎng)基中活化后，在血平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)是否發(fā)生變化，周圍是否出現(xiàn)溶血環(huán)。

1.2.3.5 抗菌活性測定

采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗[14]。將3株致病菌復蘇，過夜培養(yǎng)；將分離菌株接種至LB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。取病原菌液50 μL于營養(yǎng)瓊脂平板上，涂抹均勻，上面水平放置牛津杯，在牛津杯中分別加入200 μL分離菌株的菌液(108CFU/mL)，過夜培養(yǎng)，測量抑菌圈直徑。

1.2.4 芽孢桿菌分離株的鑒定

1.2.4.1 生化鑒定

復蘇菌株，用芽孢桿菌生化鑒定條進行生化反應鑒定，結(jié)果參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》比對。

1.2.4.2 16S rRNA基因序列分析

參考水煮法提取細菌DNA作為PCR擴增模板[15]，細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)用于PCR擴增鑒定，引物序列由上海生工合成。擴增體系：Premix Taq 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，基因組DNA 5 μL，ddH2O 4 μL。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物送至上海生工測序，測序結(jié)果與NCBI進行比較[16]。

1.2.5 芽孢桿菌生長曲線測定

活化細菌，按照1%的量接種于LB液體培養(yǎng)基，在180 r/min立式智能精密搖床上37 ℃培養(yǎng)，從剛接種開始每隔2 h取樣1次，共10次，分別測定其OD600。

1.2.6 篩選出的芽孢桿菌的安全性評價

1.2.6.1 灌胃試驗

經(jīng)過7 d的適應后，24只雄性昆明小鼠被隨機分成2組(n=12)，其中對照組A灌胃無菌PBS(0.2 mL)，試驗組B灌胃1×108CFU/mL龍舌蘭芽孢桿菌LTF7(懸浮于0.2 mL無菌PBS)，持續(xù)14 d。在整個試驗過程中每天觀察動物的活動、行為和一般健康狀況。每天記錄1次體重。在試驗結(jié)束時，所有小鼠禁食12 h，然后通過腹腔注射4%水合氯醛進行麻醉；通過心臟穿刺將血樣收集到含有乙二胺四乙酸(EDTA)的試管中，并制備血清；取出心臟、肺臟、腎臟和睪丸并稱重。

1.2.6.2 腹腔注射

經(jīng)過7 d的適應后，24只雄性昆明小鼠被隨機分成2組(n=12)，其中對照組C腹腔注射0.2 mL生理鹽水，試驗組D腹腔注射1×108CFU/mL的龍舌蘭芽孢桿菌LTF7(懸浮于0.2 mL無菌PBS)，注射后第7天處死。在整個試驗過程中每天觀察動物的活動、行為和健康狀況，每天記錄1次體重，解剖觀察各組織器官是否存在病理變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20.0的單因素方差分析和GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進行處理和作圖，結(jié)果表示為平均值±標準差，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌初分離

共挑取在LB固體培養(yǎng)基呈乳白色、微凸起、表面褶皺的單菌落7個(編號LTF1～7，LTF為駱駝糞拼音的首字母縮寫，數(shù)字為挑菌順序)。進一步劃線純化(圖1-A)，革蘭氏染色后其中有2株呈革蘭氏陽性的短桿狀(圖1-B)，將短桿菌進一步純化后于-20 ℃保存。

A：LB瓊脂平板劃線 LB agar plate streaking；B：革蘭氏染色 Gram stain (100×)。圖1 分離菌株LTF7形態(tài)Fig.1 Morphology of isolated strain LTF7

2.2 分離菌株的益生菌潛力篩選

2.2.1 耐酸性

由表1可知，2個分離菌株在pH=2.5的強酸環(huán)境中培養(yǎng)3 h后，隨著時間增長相對存活率逐漸降低，從1～3 h，LTF6菌株的相對存活率高于LTF7菌株。

表1 在強酸環(huán)境下的相對存活率Table 1 Relative survival rate in strong acid environment %

2.2.2 耐膽鹽

由表2可知，2株分離菌株在0.3%的膽鹽中都能夠存活，在培養(yǎng)的前1 h內(nèi)均有較高的相對存活率，在6 h時LTF7菌株生長優(yōu)勢較為明顯，表明LTF7菌株耐受膽鹽的能力相對較強。

表2 在0.3%膽鹽環(huán)境下的相對存活率Table 2 Relative survival rate under 0.3% bile salt environment %

2.2.3 藥敏試驗

選取13種常用藥物對2個分離菌株做藥敏試驗，試驗結(jié)果表明：LTF6菌株對頭孢噻肟、卡那霉素、四環(huán)素、紅霉素中度敏感，LTF7菌株僅對四環(huán)素中度敏感，對其他藥物均敏感(表3)。分離菌株LTF7部分藥敏試驗結(jié)果見圖2。

A：青霉素G penicillin G；B：氨芐西林 ampicillin；C：頭孢噻肟 cefotaxime；D：苯唑西林 oxacillin；E：鏈霉素 streptomycin；F：卡那霉素 kanamycin；G：四環(huán)素 tetracycline。圖2 分離菌株LTF7部分藥敏試驗Fig.2 Partial drug susceptibility test of isolated strain LTF7

表3 分離菌株對藥物的敏感性Table 3 Sensitivity of isolated strains to drugs

2.2.4 溶血活性測定

如圖3所示，2株分離菌的菌落在血平板上菌生長良好，形態(tài)無變化，無溶血現(xiàn)象。

A：LTF6菌株 LTF6 strain；B：LTF7菌株 LTF6 strain。圖3 分離菌株在血平板上的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of isolated strains on blood plate

2.2.5 抗菌活性測定

由表4可知，2株分離菌對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有獨特的抗菌能力，以LTF7菌株對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果較好，選取LTF7菌株進行鑒定。

表4 分離菌株對病原菌的抑制圈直徑Table 4 Inhibitory zone diameter of isolated strains against pathogenic bacteria mm

2.3 芽孢桿菌分離菌株的鑒定

2.3.1 生化鑒定

表5顯示，LTF7菌株的生化鑒定結(jié)果為V-P試驗陽性、不水解淀粉，可使明膠液化等。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步判斷LTF7菌株為芽孢桿菌屬。

表5 分離菌株LTF7生化鑒定結(jié)果Table 5 Biochemical identification results of isolated strain LTF7

2.3.2 16S rRNA基因序列分析

由圖4可知，在約為1 500 bp的位置出現(xiàn)特異性條帶，與預期相符。將得到的序列與NCBI比對，發(fā)現(xiàn)LTF7菌株與龍舌蘭芽孢桿菌(NR104919.1)相似性為100%(圖5)。結(jié)合LTF7菌株的形態(tài)特征及生理生化鑒定結(jié)果，判定LTF7菌株為龍舌蘭芽孢桿菌，將其命名為龍舌蘭芽孢桿菌LTF7。

M：Maker；Y：陰性對照 negative control；7：LTF7菌株 LTF7 strain。圖4 分離菌株LTF7 PCR擴增電泳結(jié)果Fig.4 PCR amplification and electrophoresis results of isolated strain LTF7

圖5 分離菌株LTF7的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of isolated strain LTF7

2.4 龍舌蘭芽孢桿菌LTF7生長曲線測定

分離到的龍舌蘭芽孢桿菌LTF7在LB肉湯中經(jīng)37 ℃培養(yǎng)20 h后，其生長情況如圖6所示。當培養(yǎng)到2 h時，菌株開始對數(shù)生長期。

圖6 分離菌株LTF7的生長曲線Fig.6 Growth curve of isolated strain LTF7

2.5 龍舌蘭芽孢桿菌LTF7安全性評價

2.5.1 灌胃試驗

2.5.1.1 小鼠剖檢

試驗過程中，各組小鼠均表現(xiàn)活躍，每日進食量和飲水量均正常；此外，未發(fā)現(xiàn)腹瀉、死亡或其他疾病癥狀。剖檢顯示各組小鼠各臟器及腸各節(jié)段外觀正常，肉眼檢查未見明顯病理改變(圖7)。

2.5.1.2 體重和臟器指數(shù)

如圖8所示，灌胃龍舌蘭芽孢桿菌LTF7的試驗組B小鼠與對照組A小鼠的生長情況相同，各時間點組間體重均無顯著差異(P>0.05)。

A、C：對照組A剖檢 autopsy of control group A；B、D：試驗組B剖檢 autopsy of test group B。圖7 灌胃后小鼠剖解變化及肝臟和腸道觀察Fig.7 Anatomical changes and observation of liver and intestinal tract in mice after gavage

圖8 灌胃龍舌蘭芽孢桿菌LTF7對小鼠體重的影響Fig.8 Effects of gavage of Bacillus tequilensis LTF7 on body weight of mice

由表6可知，試驗組B小鼠的心臟、肺臟、腎臟和睪丸指數(shù)與對照組A均無顯著差異(P>0.05)。

表6 灌胃龍舌蘭芽孢桿菌LTF7對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 6 Effects of gavage of Bacillus tequilensis LTF7 on organ indexes of mice %

2.5.1.3 血液學參數(shù)

由表7可知，對照組A和試驗組B小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、總蛋白和尿素氮含量均無顯著差異(P>0.05)；所檢測的血常規(guī)指標中，僅單核細胞數(shù)量在試驗組B與對照組A間存在顯著差異(P<0.05)，但在參考范圍之內(nèi)，其他指標2組之間無顯著差異(P>0.05)。

表7 灌胃龍舌蘭芽孢桿菌LTF7對小鼠血液學參數(shù)的影響Table 7 Effects of gavage of Bacillus tequilensis LTF7 on hematological parameters of mice

2.5.1.4 組織切片觀察

采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝臟、腎臟組織，顯微鏡下2組小鼠均未見明顯眼觀病理變化(圖9)。

A：對照組A肝臟 liver of control group A；B：試驗組B肝臟 liver of test group B；C：對照組A腎臟 kidney of control group A；D：試驗組B腎臟 kidney of test group B。圖9 灌胃龍舌蘭芽孢桿菌LTF7對小鼠肝臟、腎臟組織的影響Fig.9 Effects of gavage Bacillus tequilensis LTF7 on liver and kidney tissue of mice (100×)

2.5.2 腹腔注射試驗

腹腔注射后的連續(xù)7 d觀察期間對照組C和試驗組D小鼠的體重增長無明顯異常(圖10)，未見異常癥狀和死亡，小鼠剖檢腹腔內(nèi)臟器無明顯眼觀病理變化(圖11)。

圖10 體重增長Fig.10 Weight gain

3 討 論

3.1 芽孢桿菌益生特性

益生菌在宿主腸道定植并發(fā)揮作用，候選菌株必須能耐受胃的酸性和小腸的膽汁鹽，因此耐酸和耐膽鹽通常被認為是潛在益生菌的一個必要的評估標準[17]。經(jīng)pH 2.5的強酸處理3 h后，自駱駝糞便中分離的龍舌蘭芽孢桿菌LTF7的相對存活率為78.16%，和不同種屬的乳酸菌、芽孢桿菌菌株的耐酸能力[18-20]相似。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌和芽孢桿菌菌株在0.3%膽汁中3 h后仍保持其活力[17,21]。腸道膽鹽濃度平均約為0.3%，因此本試驗用0.3%的膽鹽測試龍舌蘭芽孢桿菌LTF7的抵抗能力，結(jié)果顯示其對0.3%的膽鹽具有耐受性。

A：對照組C剖檢 autopsy of control group C；B：試驗組D剖檢autopsy of test group D。圖11 腹腔注射小鼠剖檢Fig.11 Necropsy of mice injected intraperitoneally

為防止?jié)撛诘目股啬退幮赞D(zhuǎn)移到腸道微生態(tài)中，需對潛在益生菌進行抗生素耐藥性評估[22]。本試驗采用13種抗生素對龍舌蘭芽孢桿菌LTF7進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)其對四環(huán)素以外的大部分抗生素表現(xiàn)出高度敏感?？股啬退幮哉J為是細菌本身存在的，Parveen等[10]研究發(fā)現(xiàn)龍舌蘭芽孢桿菌5A2對青霉素、四環(huán)素、鏈霉素和甲氧芐氨嘧啶具有耐藥性。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果有所差異，可能由于菌株差異性導致的，說明本試驗所分離的龍舌蘭芽孢桿菌菌株耐藥性低，安全性高。

體外評估益生菌的溶血活性是評估潛在益生菌菌株安全性的必要條件之一[23]。Luis-Villaseor 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，龍舌蘭芽孢桿菌YC5-2不會發(fā)生溶血現(xiàn)象，從而證實該菌株不會對宿主造成危害，同樣，本試驗分離得到的龍舌蘭芽孢桿菌LTF7也未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

益生菌對病原菌的抑制作用有助于維持腸道菌群平衡和其他生理功能，例如減少炎癥性腸病或結(jié)直腸癌[25]。芽孢桿菌對病原菌的抑制作用，主要是次級代謝途徑抗菌蛋白和化合物的合成[26]。研究發(fā)現(xiàn)，龍舌蘭芽孢桿菌FR9菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、李斯特菌和糞腸球菌等病原體表現(xiàn)出較廣的抑制生長作用，其中對李斯特菌的抑制作用最強[10]。本試驗中的2株分離菌LTF76和LTF7都能不同程度地抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌生長，其中LTF7菌株對大腸桿菌和沙門氏菌的生長抑制效果較好。

生長曲線可以直觀地看出益生菌在培養(yǎng)液中的生長能力[27]。Anvari等[28]研究了龍舌蘭芽孢桿菌HK01的生長能力，接種后0～10 h龍舌蘭芽孢桿菌HK01生長非?？?，隨后進入平穩(wěn)期。Andriani等[29]研究巨大芽孢桿菌的生長情況時發(fā)現(xiàn)其在0～6 h內(nèi)進入對數(shù)期，6 h已達到該菌的最高生長高度。在本試驗中，龍舌蘭芽孢桿菌LTF7的生長特性均與前人的研究基本一致，在37 ℃培養(yǎng)時能更快進入對數(shù)期，具有良好的生長特性。

3.2 龍舌蘭芽孢桿菌LTF7的安全性

對于益生菌的安全性評價，目前還沒有國際通用的標準，但是嚙齒動物的急性經(jīng)口毒性試驗已被認為是一種基本的益生菌安全性評估測試，已應用于益生菌安全性的評估[30]。Dutta等[31]研究發(fā)現(xiàn)，龍舌蘭芽孢桿菌KF623287可以提高魚種的生長和免疫力以及其對養(yǎng)分的利用。目前，國內(nèi)外對龍舌蘭芽孢桿菌作為益生菌在安全性方面的研究甚少，但芽孢桿菌屬其他成員在安全性方面的研究較為廣泛。Li等[32]從牦牛腸道分離出枯草芽孢桿菌18，以小鼠為動物模型，經(jīng)過17 d的飼喂后，解剖時沒有肉眼可見的臟器病變，以此來說明分離菌株的安全性；Kim等[33]從發(fā)酵食品中分離兩種枯草芽孢桿菌和一種解淀粉芽孢桿菌后使用小鼠模型進行的體內(nèi)致病性測試，證實其安全性。在連續(xù)14 d灌胃具有較強抗菌活性的龍舌蘭芽孢桿菌LTF7的觀察期內(nèi)，解剖小鼠沒有觀察到明顯的病理變化，小鼠的體重沒有顯著變化，臟器指數(shù)、血常規(guī)指標和血清生化指標沒有顯著變化，肝腎組織未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化。有研究表明，芽孢桿菌對睪丸有明顯的增重效果，且沒有生殖毒性，對雄性小鼠生殖功能有一定的促進作用[34]。本試驗分離的龍舌蘭芽孢桿菌LTF7同樣提高了小鼠的睪丸指數(shù)。尹鳳琴等[35]用從白牦牛糞便中分離出的枯草芽孢桿菌對小鼠腹腔注射，以此來確定獲得的枯草芽孢桿菌是安全的。為了進一步評估從駱駝糞便中分離出的龍舌蘭芽孢桿菌LTF7的安全性，本試驗給小鼠腹腔內(nèi)注射龍舌蘭芽孢桿菌LTF7菌懸液，沒有觀察到小鼠行為變化或死亡，對小鼠采食、生長性能沒有影響。綜上所述，本試驗分離的駱駝源龍舌蘭芽孢桿菌具有較高的安全性。

4 結(jié) 論

本試驗分離的駱駝源龍舌蘭芽孢桿菌LTF7不僅在體外表現(xiàn)出對酸和膽鹽良好的耐受性，對臨床使用的大多數(shù)抗生素敏感，對沙門氏菌和大腸桿菌生長具有抑制作用，不具有溶血的能力，并且通過小鼠口服和腹腔注射試驗證明了安全性，其可以作為新型飼料添加劑且具有減少細菌性疾病發(fā)生的潛力。