冀思同 沙 萍 曹佩佩 馬燕芬

(寧夏大學農學院，寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細胞育種重點實驗室，銀川 750021)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴性組蛋白去乙?；窼irtuin在新陳代謝、氧化應激、炎癥及線粒體功能等方面發(fā)揮重要作用[1]。Sirtuin利用NAD+依賴性去乙?；赶芏嘟M蛋白與非組蛋白中的乙?；?，以調控下游轉錄因子。Sirtuins共含7種亞型，分別是位于細胞質的沉默信息調節(jié)因子2相關酶(silent information regulator 2 related enzyme，SIRT)2，位于細胞核的SIRT1、SIRT6、SIRT7，以及位于線粒體的SIRT3、SIRT4、SIRT5[2]。過去針對Sirtuin家族的研究主要集中于SIRT1，目前其他成員的研究同樣成為焦點，特別是在機體內部多個器官均有分布的SIRT3，在細胞代謝、生物合成、細胞凋亡和氧化應激等方面均可以發(fā)揮調控作用[3]。近年來，有研究證實SIRT3介導奶牛乳腺炎的發(fā)病過程，炎癥的發(fā)病過程與SIRT3的豐度相關，而SIRT3的豐度受到底物與表達水平的雙重調控。因此，了解SIRT3的調控機制及在奶牛乳腺炎中發(fā)揮的作用對于靶向防治炎性疾病有重要意義。

1 Sirtuin結構和催化機制

沉默信息調節(jié)因子2(silent information regulator 2，SIR2)是在20世紀70年代于釀酒酵母細胞沉默轉錄時被發(fā)現(xiàn)的蛋白家族，其性質高度保守，產物對基因組穩(wěn)定性存在影響[4]，后將真核生物中與SIR2同源的蛋白稱為Sirtuin。Sirtuin屬于Ⅳ類組蛋白去乙酰化酶(histone deacetvlase，HDAC)中的第Ⅲ類。Sirtuin蛋白家族在不同的生物學過程如細胞凋亡、脂質代謝、線粒體合成、細胞應激、胰島素分泌和衰老等都發(fā)揮著重要的作用[5]。對真核生物和原核生物的催化核心區(qū)域進行系統(tǒng)分類可將Sirtuin分為5個主要類型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和U)[6]。SIRT3屬于第Ⅰ類，通常被認為分布于線粒體中，但最近的研究發(fā)現(xiàn)SIRT3在線粒體外也有分布，在受到應激刺激的細胞內全長型SIRT3可被酶裁剪為成熟SIRT3，因成熟SIRT3缺乏線粒體定位信號，會非特異性地分布于細胞的細胞核、細胞質以及線粒體中[3]。

哺乳動物Sirtuin的催化核心區(qū)域包含一大一小2個基本結構域，較大的結構域具有較強的保守性，由Rossmann折疊構成，較小的結構域包含1個鋅指結構和螺旋構件[7]。大小結構域之間的催化口袋包括A、B、C 3個活性位點，其中A點參與NAD+腺嘌呤-核糖部分的結合，B點參與煙酰胺-核糖部分的結合，C點是NAD+結合口袋深處。底物乙酰基被Sirtuin去乙?；筠D移到NAD+的二磷酸腺苷(ADP)-核糖基部分，同時1分子NAD+連接的ADP-核糖部分與煙酰胺之間的糖苷鍵被切斷，分裂為1分子O-乙?；?ADP-核糖(O-acetyl-ADP-ribose)和1分子煙酰胺(nicotinamide，NAM)[8]。Sirtuin偶聯(lián)了去乙?；蚇AD+斷裂2種催化活性，并產生了重要產物——O-乙?；?ADP-核糖。上文提到并非所有Sirtuin蛋白都具有去乙?；富钚裕琒IRT1、SIRT2、SIRT3和SIRT7具有去乙?；富钚裕玈IRT7的活性較弱或檢測不到，而SIRT4則主要表現(xiàn)ADP-核糖基轉移酶活性[9]。

2 SIRT3參與的主要調控機制

2.1 SIRT3與核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)

NF-κB是包含p65(RelA)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p105/p50)以及NF-κB2(p100/p52)7位成員的蛋白家族[10]。NF-κB信號通路是調節(jié)炎癥的關鍵信號通路，NF-κB主要通過參與炎性反應建立的基因轉錄而調節(jié)炎性疾病[11]。NF-κB與SIRT3存在拮抗關系，上調SIRT3的表達可以抑制NF-κB信號通路，還可以同時抑制高濃度非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids，NEFA)誘導的核易位和促炎反應的信號通路。奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)的NF-κBp65磷酸化水平會被NEFA誘導而上升，激活NF-κB信號通路，增加炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)的mRNA水平，說明高濃度的NEFA會激活BMEC內的炎性通路。在大多數情況下，靜止中的NF-κB最主要的異源二聚體NF-κBp50/p65與核因子κB抑制因子α(IκBα)結合于細胞質中；NF-κBp50/p65在機體受到刺激時與IκBα分離，易位后進入細胞核內作為轉錄因子調節(jié)炎性因子表達[12]。在此過程內，NF-κBp65誘導的磷酸化對NF-κB的轉錄活性有十分關鍵的作用，患病奶牛磷酸化p65(p-NF-κBp65)與NF-κBp65比值的升高是NF-κB信號通路被激活的證明[13]。高濃度的NEFA具有脂毒性，奶牛脂解產生的NEFA約有1/2被BMEC吸收，促進乳腺炎性反應，NEFA在肝細胞和中性粒細胞等多種細胞中也可激活炎性通路，BMEC中的IL-6、IL-1β和p-NF-κBp65的表達對NEFA的反應表現(xiàn)出劑量依賴性[14]。NF-κBp65的乙?；梢哉{節(jié)炎性反應，使RelA/p65亞基的賴氨酸-310脫乙?；种芌elA/p65亞基的轉導，從而抑制NF-κB依賴性基因表達的轉錄[15]。BMEC中SIRT3的過表達顯著降低IL-6、IL-1β和p-NF-κBp65的豐度，證實SIRT3可以抑制NF-κB信號通路的激活[13]。

2.2 SIRT3與活性氧(reactive oxygen species，ROS)

機體新陳代謝的過程中會產生有未配對電子的分子和原子，稱為自由基，正常情況下自由基的產生和清除是動態(tài)平衡的。奶牛泌乳期的代謝非常旺盛，BMEC會產生大量的ROS。高濃度的NEFA會影響到ROS的生成，圍產期奶牛耗氧量大幅增加，耗氧量越大生成的自由基也就越多，最后導致機體產生氧化應激[16]。細胞膜脂質層被ROS過氧化產生的大量丙二醛(malondialdehyde，MDA)會引起和加重DNA氧化損傷和蛋白質變性等，屬于不可逆損傷[17]，對細胞造成嚴重損害。添加抗氧化劑后，NEFA的促氧化作用得到了抑制，說明NEFA是導致氧化應激的主要原因[18]。SIRT3是ROS生成的主要調控因子，可直接去乙?；⒓せ羁巩悪幟仕崦摎涿?(isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)以及氧化因子錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)，啟動抗氧化，防止細胞內累積ROS[19]。轉錄因子叉形頭轉錄因子O亞型3a(forkhead box O3a，F(xiàn)OXO3a)會被SIRT3去乙?；T導表達，激活的FOXO3a可進一步促進MnSOD和IDH2的表達，消除已積累的ROS[3]。

2.3 SIRT3與單磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)

作為機體內重要的信號通路，AMPK同時也是主要由單磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)激活和調控的一種調節(jié)細胞物質和能量平衡穩(wěn)定的重要蛋白，通過使其下游的多種蛋白包括SIRT3和叉頭盒(forkhead box，F(xiàn)ox)磷酸化達到調控分解與合成代謝的效果[20]。叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)的轉錄活性會隨著SIRT3去乙酰化而增強，達到緩解線粒體氧化損傷的目的。SIRT3與AMPK關系密切，AMPK通過增加NAD+激活SIRT3抑制NF-κB途徑中的p65，阻止促炎細胞因子的轉錄[21]，同時也可促進MnSOD表達減輕機體氧化應激[22]，而SIRT3也會去乙酰化從而激活AMPK，在脂質代謝中發(fā)揮重要作用。

3 SIRT3在奶牛乳腺炎中的作用

乳腺炎在奶牛養(yǎng)殖中危害性很強，其在治療上較高的花費制約著奶牛業(yè)的健康發(fā)展[23]。美國國家乳房炎委員會(National Mastitis Council，NMC)將乳房炎分為慢性乳房炎、臨床型乳房炎和亞臨床型乳房炎3種，區(qū)分依據是乳房和乳汁是否存在明顯變化[24]，乳腺炎發(fā)病率在12%～75%[25]。奶牛對乳腺炎的易感性在產犢后的0～21 d尤為嚴重[26]。目前普遍認為，奶牛個體因素是影響奶牛乳腺炎的主要因素[27-28]。

圍產前期(產前3周)，胎兒壓迫瘤胃，與營養(yǎng)代謝、激素紊亂等共同降低奶牛的干物質采食量，瘤胃內發(fā)酵物不足使丙酸缺乏，從而導致葡萄糖缺乏并上調脂肪分解信號，激活激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL)[29]。HSL磷酸化后轉移到脂滴促進脂肪動員，并將脂肪內的甘油三酯(triglyceride，TG)水解為NEFA和甘油[30-31]。奶牛能否成功度過能量負平衡(negative energy balance，NEB)階段取決于NEFA的濃度是否超出肝臟代謝上限[32]。當NEFA濃度超出肝臟分解代謝能力的上限時會進行不完全β-氧化，此時就會產生β-羥丁酸(beta hydroxy butyric acid，BHBA)，同時機體又會處于嚴重的NEB狀態(tài)，此時奶牛機體易患乳腺炎。

目前已知SIRT3在治療奶牛乳腺炎中發(fā)揮的作用主要包括：一是SIRT3對BMEC氧化應激產生的ROS的抑制和清除。BMEC氧化應激會使細胞受損導致奶牛乳腺炎，ROS水平的上升屬于BMEC氧化應激時的特征之一，可以激活NF-κB信號通路并誘導促炎細胞因子表達[13]。已有研究證實SIRT3是ROS生成的主要調控因子[33]，通過促進MnSOD的mRNA的表達，將MnSOD去乙酰化以清除ROS[34]。同時，SIRT3可以激活氨基酸代謝中的谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)、三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)等的活性，增強線粒體呼吸作用，減少ROS的生成[35]。BMEC的氧化應激程度因SIRT3抑制清除ROS而恢復正常水平，減少細胞受損，從而降低奶牛乳腺炎的發(fā)病率。二是SIRT3對NF-κB信號通路的抑制?；疾∧膛ｓw內通常出現(xiàn)NEFA激活NF-κB信號通路，受到刺激后NF-κB的p65亞基迅速與IκBα解離，轉移至細胞核與靶基因相應位點結合，增強細胞內的炎性應答，也增加促炎因子的釋放，最終導致機體產生炎性損傷。在BMEC中，SIRT3的過表達可以顯著降低p-NF-κBp65、IL-6和IL-1β的豐度，為SIRT3抑制NF-κB信號通路的作用提供支持[13]。NF-κB信號通路受到抑制后可減輕奶牛乳腺炎的發(fā)病。三是SIRT3對NEFA的抑制。NEB狀態(tài)是導致奶?；既橄傺椎闹饕蛑?，此狀態(tài)下脂解產生的NEFA約1/2會被BMEC吸收[36]。NEFA不僅會激活NF-κB信號通路，同時高濃度的NEFA具有脂毒性，造成BMEC炎性水平增加。研究表明，SIRT3通過去乙?；{節(jié)長鏈酰基輔酶A脫氫酶(long chain acyl-coA dehydrogenase，LCAD)的活性，促進脂肪酸氧化，從而減少TG和脂肪酸氧化中間產物的累積[37]。TG是NEFA的主要來源，SIRT3的過表達可以減少體內NEFA的累積，減弱NEFA的脂毒性及其對NF-κB信號通路的影響，減少奶牛乳腺炎的發(fā)病。

4 小 結

SIRT3通過去乙?；{控下游蛋白質，并與NF-κB、AMPK等底物和NEFA、ROS等物質相互作用，在細胞能量代謝、生物合成、細胞凋亡、熱量限制及氧化應激等方面發(fā)揮作用。目前對SIRT3的研究還未達到其同家族SIRT1的深度，對SIRT3與乳腺炎之間的確切調控關系及機制還有著很大的空白，通過深層次研究SIRT3與乳腺炎發(fā)病可為SIRT3靶向治療乳腺炎提供新的方向。