陶 新 鄧 波 門小明 劉淑杰 徐子偉

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021)

斷奶被認(rèn)為是豬一生中所經(jīng)歷的最嚴(yán)重應(yīng)激事件之一。斷奶應(yīng)激造成的仔豬腹瀉問題給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1]。研究表明，小腸是斷奶應(yīng)激的主要靶點，腸黏膜受損和由此引起的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致仔豬腹瀉的主要原因之一[2]。應(yīng)激可迅速激活并啟動腸黏膜先天性免疫應(yīng)答以識別病原分子，從而過度激活免疫炎癥通路，導(dǎo)致腸黏膜系統(tǒng)促炎因子的產(chǎn)生[3]。因此，篩選調(diào)控腸黏膜免疫炎癥的關(guān)鍵因子可為斷奶仔豬腸道黏膜應(yīng)激損傷的靶向性治療提供科學(xué)依據(jù)。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類長約22 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，是體內(nèi)最大的一類基因表達(dá)調(diào)控因子，可調(diào)控超過1/3蛋白編碼基因的表達(dá)，在應(yīng)激信號通路和疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。miRNAs具有精細(xì)調(diào)控靶基因表達(dá)特性，在腸道應(yīng)激損傷、免疫炎癥中發(fā)揮重要作用[4]。在人類和鼠類上的研究表明，miRNAs在一定程度上主宰了腸道上皮細(xì)胞命運[5]。腸道特異性miRNAs的差異表達(dá)在病原感染[6]、腸道黏膜免疫[7]、腸道穩(wěn)態(tài)[8]、結(jié)直腸癌[9]和炎癥性腸病[10]等腸道病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

miR-146是近年來研究較為前沿、廣泛和深入的miRNAs之一。它包括2個miRNAs，分別為miR-146a和miR-146b。兩者成熟序列僅相差2個堿基，因此有著相似的靶標(biāo)[11]。已有研究證實，動物細(xì)胞在遭遇病原菌感染時，miR-146均呈差異表達(dá)[12-14]。在人類上的研究發(fā)現(xiàn)，miR-146參與了多種細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，與機體免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生理病理過程密切相關(guān)[15-17]。脂多糖(LPS)是在模型動物和模式細(xì)胞研究中極為常用的一種炎癥誘導(dǎo)劑，主要通過激活Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)介導(dǎo)的相關(guān)信號通路誘發(fā)機體炎癥反應(yīng)[18]。在LPS刺激的大鼠上皮細(xì)胞系IEC-6誘導(dǎo)了miR-146b的表達(dá)上調(diào)[19]。已有研究表明，miR-146可通過靶向TLR4信號通路發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，從而減輕LPS誘發(fā)的卵巢顆粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)[20]。

本課題組前期在仔豬斷奶后第4天的空腸組織中篩選到了多個差異表達(dá)的miRNAs，其中miR-146b不僅具有較高表達(dá)水平、呈最大差異倍數(shù)，且在斷奶后第7天仍呈持續(xù)性地極顯著上調(diào)表達(dá)，故引起我們的注意[21]。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，miR-146b可能參與了小腸黏膜的免疫調(diào)控和炎癥過程[22]，利用仔豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)已證實TLR4是miR-146b直接作用的靶基因[23]。本研究在上述研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以LPS刺激的IPEC-J2細(xì)胞為試驗材料，探討miR-146b對LPS刺激IPEC-J2細(xì)胞中TLR4基因表達(dá)和促炎因子產(chǎn)生的影響，以期為仔豬斷奶應(yīng)激綜合征的防治提供新的分子治療靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

IPEC-J2細(xì)胞由本實驗室于液氮罐中長期保存。主要試劑包括：mimic對照物(mimic NC)、miR-146b mimic，購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；來源于大腸桿菌的LPS，血清型O55∶B5，購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶，購自美國Gibco；脂質(zhì)體(Lipofectamine 3000)，購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑，購自美國Life Technologies公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script RT Master Mix)、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green Real-time PCR Master Mix)，購自日本TaKaRa公司；干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒，購自北京四正柏生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)ELISA試劑盒，購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將液氮保存的IPEC-J2細(xì)胞在37 ℃水浴中解凍復(fù)蘇，在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。達(dá)完全融合時，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。傳代5次后的細(xì)胞用于LPS刺激試驗和細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗。

1.3 LPS刺激試驗

用DMEM培養(yǎng)基配制5 mg/mL的LPS儲備液，使用時稀釋至適宜濃度的稀釋液。將IPEC-J2細(xì)胞按常規(guī)方法在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至單層，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量為1×105個/孔。當(dāng)細(xì)胞鋪滿80%～90%的孔面積時，加入終濃度為5 μg/mL的LPS稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞及上清液待測。每個處理4個復(fù)孔。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗

將IPEC-J2細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至達(dá)60%融合時，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗。采用DMEM培養(yǎng)基配制mimic NC和miR-146b mimic溶液，其終濃度均為50 nmol/L，根據(jù)說明書采用Lipofectamine 30000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。將24孔培養(yǎng)板放置在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后加入終濃度為5 μg/mL的LPS稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞及上清液待測。每個處理4個復(fù)孔。

1.5 熒光定量PCR

利用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，用Nanodrop 1000超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度。根據(jù)試劑盒說明書利用Prime Script RT Master Mix將細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，供合成mRNA和miRNA，反應(yīng)體系均為20 μL，其中miR-146b反轉(zhuǎn)錄引物序列為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACGCCTATG-3′；U6反轉(zhuǎn)錄引物序列為：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。所得cDNA保存至-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒說明書利用SYBR Green Real-time PCR Master Mix分別以上述所得的cDNA為模板，采用相應(yīng)基因上、下游引物合成熒光定量PCR所需的mRNA和miRNA，反應(yīng)體系均為20 μL，其中miR-146b的內(nèi)參基因為U6，其他基因的內(nèi)參基因為三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。miR-146b上游引物序列為：5′-TGCGGTGAGAACTGAATTCCATAG-3′；U6上游引物序列為：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；通用下游引物序列為：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。熒光定量PCR檢測基因的引物序列信息見表1。熒光定量PCR試驗在StepOne Plus Real-time PCR系統(tǒng)上運行完成。每個處理4個復(fù)孔。

表1 熒光定量PCR檢測基因的引物序列信息Table 1 Information of primer sequences for real-time PCR detected genes

1.6 ELISA檢測

按照相關(guān)ELISA試劑盒說明書，收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液在3 000 r/min、4 ℃離心10 min，采用ELISA方法，用抗豬TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8單抗包被于酶標(biāo)板上，使標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的待測因子與單抗結(jié)合，加入酶標(biāo)抗體，形成免疫復(fù)合物鏈接在板上，加入酶底物，經(jīng)完全反應(yīng)后加入終止液，然后在Epoch酶標(biāo)儀上于450 nm處檢測吸光度。每個處理4個復(fù)孔。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

熒光定量PCR試驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行處理計算，結(jié)果以mRNA相對表達(dá)量表示。ELISA試驗數(shù)據(jù)通過采用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中待測因子含量。所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-wayANOVA)和Duncan氏多重比較法檢驗。試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism 8.0完成圖表繪制。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS刺激IPEC-J2細(xì)胞中TLR4的mRNA表達(dá)及促炎因子的產(chǎn)生

2.1.1 TLR4和促炎因子的mRNA表達(dá)結(jié)果

由圖1可知，與未刺激處理相比，LPS刺激處理IPEC-J2細(xì)胞中TLR4的mRNA相對表達(dá)量極顯著增加了86.80%(P<0.01)，IL-1β、TNF-α、IL-8和IFN-γ的mRNA相對表達(dá)量分別極顯著增加了57.18%(P<0.01)、245.30%(P<0.01)、247.30%(P<0.01)和184.10%(P<0.01)，IL-6的mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注**表示差異極顯著(P<0.01)。Value columns with ** mean significant difference (P<0.01).圖1 脂多糖刺激IPEC-J2細(xì)胞中TLR4和促炎因子的mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.1 Results of mRNA expression of TLR4 and pro-inflammatory cytokines in IPEC-J2 cells stimulated by LPS (n=4)

2.1.2 促炎因子的分泌結(jié)果

由表2可見，與未刺激處理相比，LPS刺激處理的細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和IL-6含量均無顯著差異(P>0.05)，TNF-α、IL-8和IFN-γ含量分別極顯著增加4.383倍(P<0.01)、1.742倍(P<0.01)和2.245倍(P<0.01)。

表2 脂多糖刺激IPEC-J2細(xì)胞促炎因子的分泌結(jié)果Table 2 Results of pro-inflammatory cytokines secretion in IPEC-J2 cells stimulated by LPS (n=4) pg/mL

2.2 miR-146b的過表達(dá)

將50 nmol/L的miR-146b mimic轉(zhuǎn)染至IPEC-J2細(xì)胞并經(jīng)LPS刺激后，采用熒光定量PCR檢測miR-146b的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖3所示。與LPS處理相比，LPS+mimic NC處理的miR-146b的相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，LPS+miR-146b mimic處理的miR-146b的相對表達(dá)量極顯著增加了984.8倍(P<0.01)。這表明miR-146b mimic可成功轉(zhuǎn)染至IPEC-J2細(xì)胞并誘導(dǎo)miR-146b的過表達(dá)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05),and with different capital letters mean significant difference (P<0.01),while with the same small letter or no letters mean no significant difference (P>0.05).The same as below.圖2 miR-146b在脂多糖刺激IPEC-J2細(xì)胞中的過表達(dá)Fig.2 Over-expression of miR-146b in IPEC-J2 cells stimulated by LPS (n=4)

2.3 miR-146b過表達(dá)對LPS刺激IPEC-J2細(xì)胞中TLR4的mRNA表達(dá)和促炎因子產(chǎn)生的影響

2.3.1 miR-146b過表達(dá)對脂多糖刺激IPEC-J2細(xì)胞中TLR4和促炎因子mRNA表達(dá)的影響

鑒于LPS刺激對IPEC-J2細(xì)胞中IL-6的mRNA相對表達(dá)量無顯著影響，因此主要檢測了TLR4、IL-1β、TNF-α、IL-8和IFN-γ的mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果如圖3所示。與LPS處理相比，LPS+mimic NC處理的IPEC-J2細(xì)胞中各促炎因子的mRNA相對表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)；LPS+miR-146b mimic處理的IPEC-J2細(xì)胞中TLR4、TNF-α、IL-8和IFN-γ的mRNA相對表達(dá)量分別顯著或極顯著降低了53.85%(P<0.01)、45.16%(P<0.05)、77.74%(P<0.01)和57.90%(P<0.01)，IPEC-J2細(xì)胞中IL-1β的mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

圖3 miR-146b過表達(dá)對脂多糖刺激IPEC-J2細(xì)胞中TLR4和促炎因子mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of miR-146b over-expression on mRNA expression of TLR4 and pro-inflammatory cytokines in IPEC-J2 cells stimulated by LPS

2.3.2 miR-146b過表達(dá)對脂多糖刺激IPEC-J2細(xì)胞促炎因子分泌的影響

由表3可見，與LPS處理相比，LPS+mimic NC處理的細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8和IFN-γ含量無顯著差異(P>0.05)，LPS+miR-146bmimic處理的細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8和IFN-γ含量分別極顯著降低了23.10%(P<0.01)、25.40%(P<0.01)和19.09%(P<0.01)。

表3 miR-146b過表達(dá)對脂多糖刺激IPEC-J2細(xì)胞促炎因子分泌的影響Table 3 Effects of miR-146b over-expression on secretion of pro-inflammatory cytokines in IPEC-J2 cells stimulated by LPS (n=4) pg/mL

3 討 論

已有研究表明，LPS刺激可導(dǎo)致仔豬腸黏膜和腸上皮細(xì)胞中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等含量增加[24-26]。在仔豬上的研究證實，LPS主要通過誘導(dǎo)TLR4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路中關(guān)鍵基因TLR4和多個接頭蛋白基因如髓樣細(xì)胞分化因子(MyD88)、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IRAK-1)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)等的表達(dá)，導(dǎo)致腸道處于免疫應(yīng)激狀態(tài)[27-28]。在IPEC-J2細(xì)胞中的研究同樣發(fā)現(xiàn)，LPS通過激活TLR4/NF-κB信號通路誘導(dǎo)了腸道炎癥損傷[29]。這提示TLR4介導(dǎo)了仔豬斷奶應(yīng)激條件下腸道免疫炎癥的重要通路，是腸道黏膜損傷和炎癥反應(yīng)的重要開關(guān)分子。本研究結(jié)果表明，5 μg/mL的LPS刺激IPEC-J2細(xì)胞48 h，可誘導(dǎo)TLR4、IL-1β、TNF-α、IL-8和IFN-γ的基因表達(dá)以及TNF-α、IL-8和IFN-γ的分泌，提示LPS可能通過激活TLR4介導(dǎo)的腸道免疫通路誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞炎癥的發(fā)生。但本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS未能刺激IPEC-J2細(xì)胞IL-6的產(chǎn)生。這可能是與LPS刺激所用濃度以及作用時間有關(guān)。

我們前期研究已證實，TLR4是miR-146b直接作用的靶基因[23]，且TLR4信號通路中的多個基因如MyD88、IRAK-1和TRAF6等均為miR-146的靶基因，miR-146可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)方式調(diào)控內(nèi)毒素耐受性，并最終起到抗炎作用[30-32]。Kutty等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中miR-146a的誘導(dǎo)表達(dá)依賴于IL-1β，而miR-146b則依賴于IFN-γ。在人類的脂肪細(xì)胞中，促炎因子TNF-α和IL-6可顯著誘導(dǎo)miR-146b的表達(dá)。研究人員進(jìn)一步對其啟動子分析發(fā)現(xiàn)，在miR-146b上游的950 bp長度范圍內(nèi)有明顯的轉(zhuǎn)錄活性，TNF-α和IL-6可明顯激活miR-146b的啟動子活性，表明miR-146b可能在脂肪組織炎癥及肥胖形成的復(fù)雜過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[34]。在巨噬細(xì)胞中miR-146b的過表達(dá)可顯著降低LPS刺激的促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[35]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果表明，在IPEC-J2細(xì)胞中miR-146b可抑制LPS刺激的TLR4基因表達(dá)及促炎因子的產(chǎn)生，提示miR-146b的過表達(dá)可能通過調(diào)控與TLR4相關(guān)的分子信號通路，進(jìn)一步抑制下游促炎因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用，最終減輕斷奶仔豬腸黏膜應(yīng)激炎癥損傷，促進(jìn)其腸道健康。

miRNAs被認(rèn)為是生物學(xué)功能的一種新型調(diào)控中介，在調(diào)節(jié)機體生理功能中發(fā)揮不可替代的作用[36]。一些營養(yǎng)物質(zhì)和植物源生物活性成分均可通過介導(dǎo)miRNAs在調(diào)控機體生理功能和疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[37-39]。已有證據(jù)表明，植物多酚可通過誘導(dǎo)miR-146的表達(dá)在結(jié)腸成纖維細(xì)胞中發(fā)揮預(yù)防炎癥和抗炎作用[40]；中草藥復(fù)方-補腎益髓膠囊可上調(diào)腦脊髓炎小鼠血清外泌體中miR-146的水平[41]；飼糧中脂肪酸的組成可能通過調(diào)控miR-146的表達(dá)，進(jìn)一步影響機體的脂質(zhì)代謝[42]。因此，隨著對miR-146研究的不斷深入和拓展，將來有望通過在仔豬飼糧中添加靶向miR-146的調(diào)控物質(zhì)或生物活性成分，促進(jìn)斷奶仔豬的腸道健康和生長。

4 結(jié) 論

5 μg/mL的LPS刺激IPEC-J2細(xì)胞48 h可誘導(dǎo)TLR4、IL-1β、TNF-α、IL-8和IFN-γ的基因表達(dá)以及TNF-α、IL-8和IFN-γ的分泌。轉(zhuǎn)染miR-146b mimic可成功誘導(dǎo)miR-146b的過表達(dá)。miR-146b的過表達(dá)可抑制LPS刺激IPEC-J2細(xì)胞中TLR4基因表達(dá)以及促炎因子TNF-α、IL-8和IFN-γ的產(chǎn)生。