焦艷娜 余 冰,2 李自梅 曾亭軒 陳 香 敬杰瀅 蘇澤鑫 蔡景義,2 田 剛,2*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，成都 611130；2.動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，成都 611130)

腸道作為營養(yǎng)物質(zhì)吸收和代謝的主要場所，對動物的健康生長發(fā)揮著重要作用[1]。在家兔養(yǎng)殖過程中，腸道健康問題一直備受關注，斷奶前后經(jīng)常發(fā)生腸道疾病，引起腸道黏膜受損、免疫功能和消化吸收能力降低等問題，導致腹瀉率增加，生長性能下降，給家兔養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[2]。家兔的腸道健康與營養(yǎng)密切相關，為了保障家兔的腸道健康，通過營養(yǎng)調(diào)控的方法開展疾病防治是家兔生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié)，對優(yōu)化家兔營養(yǎng)方案具有重要意義。蘇氨酸作為機體的必需氨基酸，被廣泛應用于畜禽生產(chǎn)中。蘇氨酸具有改善腸道形態(tài)發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[3]、參與黏蛋白和免疫球蛋白的合成[4-6]、維護腸道屏障等功能[7]，對改善動物腸道健康具有重要意義。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)在動物營養(yǎng)學中是常見的誘導腸道損傷的化學方法，其可誘導機體氧化應激，阻礙腸道形態(tài)發(fā)育與消化吸收，從而降低生長性能[8]。在其他動物的研究中表明，飼糧添加蘇氨酸可調(diào)節(jié)腸道屏障功能，緩解應激和攻毒造成的腸道炎癥反應[3-4]。但蘇氨酸能否緩解LPS應激對肉兔腸道健康的影響還鮮見報道。因此，本試驗通過研究飼糧中添加表觀可消化蘇氨酸(AFDT)對LPS應激肉兔營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、腸道形態(tài)和氧化還原狀態(tài)的影響，以闡明蘇氨酸對生長肉兔腸道健康的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘇氨酸含量為98.5%。LPS來源于大腸桿菌(Escherichiacoli)，血清型O127∶B8，購自美國Sigma試劑公司。

1.2 試驗設計及飼養(yǎng)管理

選取180只平均體重為(808.11±12.17) g、健康的35日齡斷奶新西蘭白兔，采用2×3雙因子試驗設計，隨機分為6組，每組30個重復，每個重復1只兔。試驗飼糧參照De Blas等[9]育肥兔營養(yǎng)需要標準進行配制，3種飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，飼糧中AFDT水平分別為0.43%、0.54%和0.65%(實測值分別為0.43%、0.54%和0.64%)，分別為推薦量的100%、125%和150%，試驗飼糧以蘇氨酸替代基礎飼糧中的玉米和丙氨酸，達到等能等氮處理。于試驗第17天和第20天腹腔注射100 μg/kg BW LPS或等量滅菌生理鹽水，注射前12 h進行結(jié)料，正常飲水，LPS血清型和注射劑量參照Grasa等[10]標準進行。試驗期為35 d，在試驗第22天從各組中隨機選取6只接近平均體重的肉兔進行屠宰，取腸道組織和黏膜樣。試驗期間自由采食和飲水，自然通風和光照。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) %

續(xù)表1項目Items飼糧Diets123中性洗滌纖維NDF35.08(44.78)35.08(45.85)35.07(45.43)酸性洗滌纖維ADF19.34(23.90)19.34(25.20)19.34(24.93)酸性木質(zhì)素ADL4.32(4.61)4.32(4.61)4.32(4.18)粗脂肪EE2.41(2.98)2.41(2.95)2.41(2.91)粗灰分Ash6.42(5.79)6.42(6.44)6.42(6.15)鈣Ca0.600.600.60總磷TP0.400.400.40可消化賴氨酸AFDL0.570.570.57可消化蘇氨酸AFDT0.43(0.43)0.54(0.54)0.65(0.64)

1.3 指標測定及方法

1.3.1 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測定

采用四分法采集3種飼糧各1 000 g。飼養(yǎng)試驗結(jié)束后的第3天和第6天，每組選取15只健康且接近平均體重的肉兔，腹腔注射100 μg/kg BW LPS稀釋液和等量無菌生理鹽水。采用酸不溶灰分(AIA)指示劑法，待試驗結(jié)束后的第4天至第7天每組收集10只肉兔的糞便，連續(xù)收集4 d[11]。每日收集到的糞便噴灑10%的鹽酸進行固氮，將4 d收集到的同一只肉兔的糞樣進行充分混勻，放入烘箱65 ℃烘干至恒重，粉碎過篩，-20 ℃保存。參照Papadomichelakis等[11]的方法對飼糧和糞便樣品中AIA含量進行測定。飼糧和糞便中干物質(zhì)(DM)、有機物(OM)、總能(GE)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、無氮浸出物(NFE)、粗纖維(CF)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、酸性木質(zhì)素(ADL)和氨基酸含量參照張麗英[12]的方法進行測定和計算。采用下列公式計算營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率：

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=100-100×(飼糧中指示劑含量/糞樣中指示劑含量)×(糞樣中營養(yǎng)物質(zhì)含量/飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)含量)[13]。

1.3.2 腸道形態(tài)的測定

在試驗第22天空腹稱重后，從每組隨機選取6只接近平均體重的肉兔進行屠宰，取腸道組織樣后保存于4%多聚甲醛溶液瓶中，取腸道黏膜樣-80 ℃保存?zhèn)溆?。將保存于多聚甲醛溶液中的十二指腸、空腸和回腸樣品組織經(jīng)脫水、修剪、浸蠟、包埋和切片等處理后，進行蘇木精-伊紅(HE)染色。用光學顯微鏡(40倍成像)對腸道組織進行形態(tài)的觀察，隨機選取形態(tài)完整的目的區(qū)域進行拍照，每個樣品選取10個絨毛形態(tài)完整和延展均勻的視野進行絨毛高度(VH)和隱窩深度(CD)的測定，并計算絨隱比(V/C)。腸道組織樣品送至四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院病理研究室測定。

1.3.3 腸道抗氧化能力的測定

采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定肉兔腸道黏膜中的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和黃嘌呤氧化酶(XOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量。具體操作嚴格按照試劑盒中的說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行初步處理，用SAS 9.2的GLM模型進行2×3雙因子方差分析。主效應包括飼糧AFDT水平和LPS應激以及兩者互作。在交互作用顯著時，用Duncan氏法進行多重比較。結(jié)果用平均值及均值標準誤(SEM)表示，并以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05≤P<0.10表示差異有顯著趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 AFDT對LPS應激肉兔營養(yǎng)物質(zhì)和氨基酸表觀消化率的影響

2.1.1 AFDT對LPS應激肉兔營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表2可知，LPS應激對肉兔GE、CP、CF、NDF和EE的表觀消化率均無顯著影響(P>0.05)，但LPS應激顯著降低了DM、OM、GE、NFE和ADF的表觀消化率(P<0.05)。AFDT對肉兔GE、CP、CF、ADF、NDF、EE和OM的表觀消化率均無顯著影響(P>0.05)，且與AFDT 0.54%和0.64%組相比，AFDT 0.43%組顯著增加了DM和NFE的表觀消化率(P<0.05)。飼糧AFDT水平與LPS應激對肉兔營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率無顯著交互效應(P>0.05)。

表2 LPS應激和不同AFDT水平對生長肉兔營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響Table 2 Effects of LPS challenge and different levels of AFDT on apparent digestibility of nutrients of meat rabbits (n=10) %

2.1.2 AFDT對LPS應激肉兔氨基酸表觀消化率的影響

由表3和表4可知，LPS應激顯著降低了肉兔半胱氨酸(Cys)的表觀消化率(P<0.05)，顯著提高了蛋氨酸(Met)的表觀消化率(P<0.05)，并有提高組氨酸(His)表觀消化率的趨勢(P=0.05)，而其他氨基酸表觀消化率無規(guī)律性變化。與AFDT 0.43%組相比，AFDT 0.54%組顯著降低了亮氨酸(Leu)、His和丙氨酸(Ala)的表觀消化率(P<0.05)。隨著飼糧AFDT水平的提高，蘇氨酸表觀消化率顯著提高(P<0.05)，而Ala表觀消化率顯著降低(P<0.05)。飼糧AFDT水平與LPS應激互作對肉兔氨基酸表觀消化率無顯著影響(P>0.05)。

表3 LPS應激和不同AFDT水平對肉兔必需氨基酸表觀消化率的影響Table 3 Effects of LPS challenge and different levels of AFDT on apparent digestibility of essential amino acids of meat rabbits (n=4) %

表4 LPS應激和不同AFDT水平對肉兔非必需氨基酸表觀消化率的影響Table 4 Effects of LPS challenge and different levels of AFDT on apparent digestibility of non-essential amino acids of meat rabbits (n=4) %

2.2 AFDT對LPS應激肉兔腸道形態(tài)的影響

由表5可知，LPS應激對肉兔十二指腸和空腸CD以及回腸的3個腸道形態(tài)指標均無顯著影響(P>0.05)，但LPS應激顯著降低了空腸的VH(P<0.05)，顯著增加了十二指腸的V/C(P<0.05)，有降低十二指腸VH(P=0.06)和空腸V/C(P=0.09)的趨勢。飼糧AFDT水平對肉兔的腸道形態(tài)無顯著影響(P>0.05)。飼糧AFDT水平與LPS應激對肉兔十二指腸VH存在顯著交互效應(P<0.05)。在生理鹽水組中，與AFDT 0.64%組相比，AFDT 0.54%組顯著增加了十二指腸VH(P<0.05)；在LPS應激組中，與AFDT 0.54%組相比，AFDT 0.64%組有提高十二指腸VH的趨勢(P=0.07)。

表5 LPS應激和不同AFDT水平對肉兔腸道形態(tài)的影響Table 5 Effects of LPS challenge and different levels of AFDT on intestinal morphology of meat rabbits (n=4)

2.3 AFDT對LPS應激肉兔腸道抗氧化能力的影響

由表6可知，LPS應激對肉兔十二指腸、空腸和回腸SOD、XOD和GSH-Px活性以及回腸的T-AOC和MDA含量均無顯著影響(P>0.05)，但LPS應激顯著增加了空腸MDA含量和T-AOC(P<0.05)，顯著降低了十二指腸MDA含量(P<0.05)。飼糧添加AFDT對肉兔腸道抗氧化能力無顯著改善作用，且與AFDT 0.54%和0.64%組相比，AFDT 0.43%組顯著提高了十二指腸T-AOC(P<0.05)。飼糧AFDT水平與LPS應激互作顯著影響肉兔回腸的MDA含量、T-AOC以及XOD和GSH-Px活性(P<0.05)。在生理鹽水組中，與AFDT 0.43%組相比，AFDT 0.54%組回腸MDA含量顯著降低(P<0.05)，AFDT 0.64%組回腸的T-AOC顯著提高(P<0.05)；在LPS應激組中，與AFDT 0.43%組相比，AFDT 0.54%組回腸GSH-Px活性顯著增加(P<0.05)，AFDT 0.64%組回腸XOD活性顯著降低(P<0.05)，且有增加回腸GSH-Px活性(P=0.09)以及降低回腸MDA含量的趨勢(P=0.07)。

表6 LPS應激和不同AFDT水平對肉兔腸道抗氧化的影響Table 6 Effects of LPS challenge and different levels of AFDT on intestinal antioxidant of meat rabbits (n=4)

3 討 論

3.1 LPS應激模型建立

腸道黏膜的完整性是腸道功能正常運行的結(jié)構(gòu)基礎，可抵抗細菌和內(nèi)毒素移位。而LPS誘導的免疫應激會導致腸道屏障受損，細菌和毒素移位進入體循環(huán)，從而引發(fā)一系列的全身性炎癥反應[14]。如LPS會導致家兔的體溫升高、采食量下降、精神萎靡和腹瀉等癥狀，影響腸道的收縮與分泌，誘導腸道黏膜損傷以及腸道功能的改變，從而影響腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和吸收[15-16]。本研究前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS應激誘導肉兔體溫升高、嗜睡和生長性能下降等癥狀。在本試驗中，LPS導致肉兔腸道發(fā)生氧化應激、腸道形態(tài)受損以及營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收受阻，這說明LPS刺激可導致肉兔發(fā)生免疫應激反應。

3.2 AFDT對LPS應激肉兔營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

家兔對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收可反映它對營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況，進而反映生長性能和腸道健康狀況。研究表明，LPS應激會損害動物機體的消化吸收功能，顯著降低機體對DM、OM、CP和EE的表觀消化率[17]。在本試驗中，LPS應激顯著降低了DM、OM、NFE、GE、ADF和Cys的表觀消化率，可能是應激損害了肉兔胃腸道的消化功能，降低了蠕動速度，從而抑制了生長且影響采食量，這與本試驗前期的生長性能下降結(jié)果相對應，同時食糜在腸道中的停留時間延長，這可能是Met表觀消化率增加的原因[18]。前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低蛋白質(zhì)飼糧中額外添加0.15%蘇氨酸改善了離乳前期梅花鹿部分氨基酸的表觀消化率[19]。此外，飼糧中適宜水平的蘇氨酸可改善幼魚對脂類的消化與吸收[20]。本試驗中，飼糧額外添加AFDT對營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率無顯著改善作用，且降低了NFE、DM和Ala的表觀消化率。營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率受飼糧中營養(yǎng)水平的影響，同時機體的代謝反饋也會影響其消化吸收[21]。蘇氨酸用于腸道維持的需要量較高，因此其在腸道的周轉(zhuǎn)率更快，蘇氨酸消化率的增加有利于腸道黏蛋白和免疫球蛋白的合成，便于更好地維護腸道健康[22]。此外，蘇氨酸屬于中性氨基酸，和腸道內(nèi)其他中性氨基酸共用相同的氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，額外添加蘇氨酸會導致腸道中游離的蘇氨酸含量增加，與其他氨基酸競爭轉(zhuǎn)運載體，從而影響這些氨基酸在腸道中的消化吸收[23]，也正好解釋了額外添加AFDT在提高蘇氨酸表觀消化率的同時降低了部分氨基酸的表觀消化率。而蘇氨酸表觀消化率的增加便于更好地調(diào)節(jié)腸道免疫功能。

3.3 AFDT對LPS應激肉兔腸道形態(tài)的影響

腸道是動物機體消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)可反映腸道的健康狀況以及對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力[24]。VH和CD是反映腸道的吸收能力和上皮細胞成熟率的指標，VH增高可增加營養(yǎng)物質(zhì)與腸道的接觸面積，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，CD降低時表明上皮細胞成熟周期縮短，分泌增多，消化能力增強，兩者可提高對腸道營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，兩者的比值V/C在一定程度上也可反映腸道的發(fā)育和消化吸收能力[25]。有研究表明，LPS應激會破壞腸道黏膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，影響機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[26-27]。在本試驗LPS應激結(jié)束后，LPS應激降低了肉兔十二指腸和空腸的VH，破壞了腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，這與上述研究結(jié)果相似。研究表明，飼糧中蘇氨酸缺乏或過量在一定程度上會對動物的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響[28-29]。Ahmed等[22]通過給肉雞飼喂NRC(1994)推薦量的110%和120%的AFDT可顯著改善35日齡肉雞的腸道形態(tài)，提高十二指腸VH和V/C，降低CD。本試驗與前人研究結(jié)果不完全一致，飼糧添加AFDT對肉兔腸道形態(tài)沒有顯著改善作用，這與Wellington等[30]和Zarrin-Kavyani等[31]在仔豬、肉雞上的研究結(jié)果相似，這可能與動物的種屬、日齡、基因型和飼養(yǎng)管理等因素有關。本試驗還發(fā)現(xiàn)，在LPS應激條件下，AFDT 0.64%組對肉兔腸道形態(tài)的緩解效果最佳。陳躍平等[7]研究表明，在LPS應激條件下，飼糧中額外添加0.30%蘇氨酸可通過增加21日齡肉雞空腸的VH、V/C和回腸的V/C來保護腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，維護腸道健康。這與本試驗結(jié)果相似，可能原因是試驗前期高水平AFDT提高了肉兔的采食量，使營養(yǎng)物質(zhì)的攝入量增多，促進肉兔腸道發(fā)育，從而在一定程度上有利于緩解腸道損傷。由此可以推測，飼糧添加AFDT對腸道損傷條件下肉兔腸道形態(tài)的完整性發(fā)揮了一定的調(diào)節(jié)作用。

3.4 AFDT對LPS應激肉兔腸道抗氧化能力的影響

腸道黏膜可為機體提供屏障保護作用，但機體攝入的外源物質(zhì)和病原微生物等可誘導氧化損傷和腸道的炎癥反應，而胃腸道是活性氧(ROS)的關鍵來源，其內(nèi)部的抗氧化酶可保護腸道免受ROS的損傷[32]。SOD、GSH-Px和T-AOC是機體抗氧化系統(tǒng)中的主要抗氧化酶[33]。MDA是脂質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，其含量可間接反映機體的活性氧自由基水平，其在體內(nèi)積累過多會導致機體產(chǎn)生過氧化反應[34]。XOD是腸道氧自由基產(chǎn)生的關鍵酶，對腸道的損傷起著直接作用，是反映組織氧化損傷的靈敏指標[35]。LPS可誘導機體產(chǎn)生活性氧，造成氧化應激[36]。Li等[37]研究表明，腹腔注射LPS會誘導肉雞腸道氧化應激，腸道中MDA含量增加，而SOD活性降低。本試驗中，LPS應激增加了肉兔空腸MDA含量，造成空腸氧化應激，而應激引起的十二指腸MDA含量降低以及空腸T-AOC的升高可能是不同部位其氧化酶活性存在差異以及機體抗氧化能力的代償性升高所致[38]。已有研究報道，飼糧添加蘇氨酸可緩解LPS對機體造成的氧化應激，提高腸道抗氧化酶活性，降低MDA含量，從而提高機體腸道的抗氧化能力[7]。本試驗在LPS應激條件下，AFDT 0.64%組降低了肉兔回腸XOD活性和MDA含量，AFDT 0.54%組提高回腸GSH-Px活性。由此推測，在LPS應激條件下，飼糧添加AFDT可能通過抑制機體XOD活性和降低MDA含量，減少ROS的釋放從而緩解LPS應激對肉兔腸道的損傷，同時通過提高機體GSH-Px活性來清除體內(nèi)的自由基，提高肉兔腸道的抗氧化能力。原因可能是蘇氨酸能與機體的金屬元素螯合，金屬元素參與抗氧化酶的組成，飼糧添加蘇氨酸可參與這些金屬元素的儲存和運輸過程，提供抗氧化酶所需的金屬元素，從而增強機體的抗氧化能力，緩解氧化應激對肉兔腸道的損傷[33,39]。

4 結(jié) 論

在本試驗中，LPS應激誘導肉兔腸道氧化應激、腸道形態(tài)受損，從而導致營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收受阻。飼糧AFDT水平為0.64%時，可以通過提高肉兔的腸道抗氧化能力以及改善腸道形態(tài)，從而在一定程度上緩解LPS應激對肉兔腸道健康的影響。