李 寧 岳雙明 李夢(mèng)雅 王之盛 薛 白 王立志 彭全輝*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，成都 611130；2.四川水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，成都 611230)

反芻動(dòng)物自身不能合成β-胡蘿卜素，主要依賴飼糧提供。我國(guó)肉牛養(yǎng)殖大多以舍飼為主，與放牧條件相比，舍飼肉牛青綠飼料缺乏，粗飼料大多以青貯干草為主。據(jù)報(bào)道，β-胡蘿卜素是最容易破壞的養(yǎng)分，田間曬干干草的β-胡蘿卜素?fù)p失高達(dá)90%～95%，牧草在制成青貯后其損失量在40%～60%[1]。新鮮羊茅牧草含有的β-胡蘿卜素大約是干草的10倍[2]。β-胡蘿卜素容易被氧化，隨著收割時(shí)間的延長(zhǎng)，苜蓿中β-胡蘿卜素量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而減少[3]。β-胡蘿卜素缺乏容易導(dǎo)致肉牛生產(chǎn)性能下降[4]、卵巢功能受損和流產(chǎn)發(fā)生率增加[5]，以及犢牛生出生后6日齡出現(xiàn)腹瀉的幾率提高[6]。適當(dāng)補(bǔ)充β-胡蘿卜素有助于反芻動(dòng)物生產(chǎn)潛力的發(fā)揮。

前人研究表明，微生物可以利用β-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素含量和檸檬酸桿菌、小球菌屬和乳球菌呈負(fù)相關(guān)[7]。絲狀酵母屬和許旺酵母菌能分解胡蘿卜素產(chǎn)生2,2,6-三甲基環(huán)己酮、β-環(huán)檸檬醛和β-紫羅蘭酮等物質(zhì)[8]。Hino等[9]在體外培養(yǎng)的添加紅花油抑制劑的瘤胃細(xì)菌中加入β-胡蘿卜素，能顯著增加細(xì)菌數(shù)量，提高脂肪酸的利用，還能通過(guò)促進(jìn)纖維素分解菌的生長(zhǎng)增強(qiáng)對(duì)纖維素的消化。這說(shuō)明β-胡蘿卜素可以調(diào)控菌群。目前，還沒有關(guān)于β-胡蘿卜素對(duì)體內(nèi)瘤胃微生物影響的研究，而犏牛是高原地區(qū)獨(dú)有牛種，既能很好地適應(yīng)高原環(huán)境，又能改善牦牛生長(zhǎng)緩慢的劣勢(shì)，探究β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛瘤胃微生物組成的影響具有理論和現(xiàn)實(shí)意義。因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)飼養(yǎng)和消化試驗(yàn)考察β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、瘤胃發(fā)酵特征及微生物區(qū)系的影響，為β-胡蘿卜素改善瘤胃功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用β-胡蘿卜素購(gòu)自成都某生物科技有限公司，純度為10%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目Items含量Content預(yù)混料Premix1)0.30白酒糟Distilledgrain30.00皇竹草青貯SilageofhybridgiantNapiergrass30.00合計(jì)Total100.00營(yíng)養(yǎng)水平Nutrientlevels2)綜合凈能NEmf/(MJ/kg)5.11粗蛋白質(zhì)CP12.00酸性洗滌纖維ADF27.55中性洗滌纖維NDF47.77鈣Ca0.73磷P0.48

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)牛采用單欄飼養(yǎng)。預(yù)試期內(nèi)，讓牛只熟悉飼養(yǎng)人員和操作流程。牛糞早晚各清1次，每2周牛舍消毒1次。試驗(yàn)期間，牛舍溫度保持在10～25 ℃，每天飼喂2次(07：30和18：00)，自由飲水，保證每天試驗(yàn)牛料槽中存在剩料。

1.4 樣品采集和指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

正試期第82～84天連續(xù)3 d收集飼糧和糞便樣品，將飼糧樣品混合均勻后采用四分法收集飼糧；每隔4 h采集1次糞便，將3 d收集的糞便混勻后，每頭牛取300 g糞便樣品加入10%的硫酸30 mL，-20 ℃保存待測(cè)。

參照張麗英[11]的方法測(cè)定飼糧和糞便樣品中干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、鈣(Ca)和磷(P)含量。各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的計(jì)算公式如下：

某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=100×[(食入該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量-糞便排出該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量)/食入該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量]。

1.4.2 瘤胃液采集

正試期第85天，用胃管法采集瘤胃液，立即測(cè)定pH。然后先取10 mL瘤胃液裝于10 mL離心管中并編號(hào)，用于微生物測(cè)定；后取15 mL瘤胃液用于瘤胃發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定。

1.4.3 瘤胃發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定

氨態(tài)氮(NH3-N)含量采用堿性次氯酸鈉-苯酚比色法測(cè)定，微生物蛋白(MCP)含量采用Brandford法測(cè)定[12]，揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量采用氣相色譜儀(CP-3800，Varian，美國(guó))測(cè)定[13]。

1.4.4 瘤胃微生物區(qū)系測(cè)定

采用微生物DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA后，用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA完整性，然后用帶有Barcode的細(xì)菌特異性引物515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)樣本的16S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及條件參照前人研究[14]。PCR結(jié)束后的產(chǎn)物與6倍上樣緩沖液混合，隨后使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行目的片段電泳檢測(cè)?；厥帐褂肸ymoclean Gel DNA Recovery Kit(D4008)，用Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

采用Flash軟件對(duì)高通量測(cè)序的片段進(jìn)行拼接，并用QIIME進(jìn)行質(zhì)控。使用UCHIME算法和Gold數(shù)據(jù)庫(kù)去除嵌合體，得到有效片段(Effective Reads)。基于USEARCH(http://drive.com/uparse/)軟件，使用UPARSE算法在97%的一致性水平上進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，選出OTU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTU的代表性序列。使用UCLUST分類法與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋分析。使用R軟件(3.6.0)Picante包計(jì)算系統(tǒng)發(fā)育多樣性(PD)指數(shù)，其他α多樣性指數(shù)指數(shù)使用Vegan包計(jì)算。主坐標(biāo)分析(PCoA)使用R軟件的ape包。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行初步整理，然后采用SPSS 19.0軟件中的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P≤0.05視為差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表2可知，試驗(yàn)組母犏牛ADF和NDF表觀消化率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但2組之間DM、CP和EE表觀消化率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響Table 2 Effects of β-carotene on nutrient apparent digestibility of female yak-cattle hybrid %

2.2 β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛瘤胃發(fā)酵特征的影響

由表3可知，試驗(yàn)組母犏牛瘤胃NH3-N含量和乙酸/丙酸值顯著低于對(duì)照組(P≤0.05)，瘤胃MCP和丙酸含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量有高于對(duì)照組的趨勢(shì)(P=0.096)；2組之間瘤胃pH、乙酸和丁酸含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛瘤胃發(fā)酵特征的影響Table 3 Effects of β-carotene on rumen fermentation characteristics of female yak-cattle hybrid

2.3 β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

2.3.1 α多樣性分析

由表4可知，試驗(yàn)組母犏牛瘤胃微生物的OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和PD指數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但2組之間的Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛瘤胃微生物區(qū)系α多樣性的影響Table 4 Effects of β-carotene on α diversity in rumen microflora of female yak-cattle hybrid

2.3.2 β多樣性分析

PCoA便于觀察樣本間的變化程度和變化規(guī)律。如圖1所示，基于未加權(quán)UniFrac距離PCoA的主坐標(biāo)1和主坐標(biāo)2分別說(shuō)明存在22.7%和17.0%的菌群結(jié)構(gòu)變異量；此外，試驗(yàn)組6個(gè)樣品能很好地聚在一起，對(duì)照組樣品分布較為分散，但2組之間能明顯區(qū)分，這說(shuō)明2組之間瘤胃微生物區(qū)系存在差異，試驗(yàn)組微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)相似性高，而對(duì)照組微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)差異較大。

圖1 瘤胃微生物區(qū)系主坐標(biāo)分析Fig.1 PCoA of rumen microflora

2.3.3 瘤胃微生物區(qū)系

在門水平上，對(duì)照組共檢測(cè)到22種菌門，試驗(yàn)組共檢測(cè)到19種菌門。對(duì)2組相對(duì)豐度較高的10個(gè)菌門進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如圖2所示，試驗(yàn)組和對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌門均為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和廣古菌門(Euryarchaeota)，相對(duì)豐度平均值分別是48.74%、27.88%和8.75%。由表5可知，試驗(yàn)組擬桿菌門相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)值與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、放線菌門(Actinobacteria)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其他菌門相對(duì)豐度與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

在屬水平上，共檢測(cè)到332個(gè)屬，其中試驗(yàn)組共檢測(cè)到217個(gè)屬，對(duì)照組共檢測(cè)到330個(gè)屬，共享菌屬215個(gè)。以相對(duì)豐度>1%進(jìn)行篩選共篩選出22個(gè)屬，如圖3所示，其中普雷沃氏菌屬1(Prevotella1)的相對(duì)豐度最高，其次是甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)和理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae RC9 gut group)。由表5可知，試驗(yàn)組普雷沃氏菌屬1、鼠桿菌科(Muribaculaceae)和瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，甲烷短桿菌屬相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其他菌屬相對(duì)豐度與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 門水平和屬水平相對(duì)豐度較高或差異顯著的瘤胃微生物Table 5 Rumen microflora with higher relative abundance or significant difference at phylum level and genus level

T1～T6表示試驗(yàn)組樣本，C1～C6表示對(duì)照組樣本。圖3同。T1 to T6 represented samples of the experimental group,and C1 to C6 represented samples of the control group.The same as Fig.3.圖2 瘤胃微生物區(qū)系門水平相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of rumen microflora at phylum level

圖3 瘤胃微生物區(qū)系屬水平相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of rumen microflora at genus level

3 討 論

3.1 β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

β-胡蘿卜素作為飼料添加劑在反芻動(dòng)物上運(yùn)用已有較長(zhǎng)歷史，但目前關(guān)于β-胡蘿卜素對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響還未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，試驗(yàn)組ADF和NDF表觀消化率顯著高于對(duì)照組，2組的DM、CP和EE表觀消化率無(wú)顯著差異。研究表明，阿爾泰馬鹿飼糧中添加12 800 IU/kg維生素A可顯著提高磷的表觀消化率，對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率無(wú)顯著影響[15]。結(jié)果不一致的原因可能是由于飼糧種類和動(dòng)物品種差異導(dǎo)致的，雖然都是反芻動(dòng)物，但生產(chǎn)目的不同，飼糧結(jié)構(gòu)和瘤胃菌群存在差異，因而會(huì)出現(xiàn)不同結(jié)果。此前關(guān)于β-胡蘿卜素影響纖維消化率的解釋則是其能促進(jìn)纖維素分解菌的生長(zhǎng)從而促進(jìn)纖維素的消化[9]。近日，Honarbakhsh等[16]進(jìn)一步表明與維生素A缺乏的小鼠相比，補(bǔ)充維生素A使得腸道厚壁菌門相對(duì)豐度顯著提高。這說(shuō)明β-胡蘿卜素對(duì)ADF和NDF表觀消化率的影響可能是通過(guò)影響厚壁菌門等纖維分解菌的相對(duì)豐度來(lái)發(fā)揮作用的。

3.2 β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛瘤胃發(fā)酵特征的影響

瘤胃pH是反映瘤胃發(fā)酵狀態(tài)的綜合指標(biāo)，本試驗(yàn)中瘤胃pH在6.3左右，屬于正常范圍(5.5～7.5)。但也有研究表明，體外發(fā)酵瘤胃液中加入β-胡蘿卜素，1～3 h內(nèi)瘤胃pH在6.7～7.3，但在5 h以后，添加200 g/L β-胡蘿卜素組的pH下降到了5.87，顯著低于對(duì)照組。這說(shuō)明胡蘿卜素對(duì)pH的影響受采樣時(shí)間的影響。NH3-N和MCP一定程度上反映了瘤胃微生物對(duì)含氮物質(zhì)的利用情況。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組NH3-N含量降低，MCP合成增加，造成該結(jié)果的原因可能是由于β-胡蘿卜素能夠刺激瘤胃與蛋白質(zhì)合成相關(guān)微生物的增長(zhǎng)，從而增加了對(duì)NH3-N的利用。Ulziisaikhan[17]研究在奶牛飼糧中添加300 mg/(頭·d)β-胡蘿卜素，結(jié)果與本研究結(jié)果一致。VFA是碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)物，而其中的丙酸是糖異生底物，可為反芻動(dòng)物提供70%～80%的能量[18]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組瘤胃丙酸含量顯著提高，瘤胃乙酸/丙酸值顯著降低，說(shuō)明試驗(yàn)組瘤胃發(fā)酵模式主要以丙酸型發(fā)酵為主，可以為機(jī)體代謝提供更多能量。這一點(diǎn)也在劉利林等[19]的研究中得到證實(shí)，飼糧添加0.005%和0.008% β-胡蘿卜素均能促進(jìn)瘤胃中TVFA含量的升高，且有降低瘤胃乙酸/丙酸值的趨勢(shì)。瘤胃丙酸含量升高主要與飼糧類型有關(guān)，可能是由于β-胡蘿卜素能提高精飼料的利用率所致。

3.3 β-胡蘿卜素對(duì)母犏牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

反芻動(dòng)物瘤胃菌群與其生長(zhǎng)和健康密切相關(guān)[20]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組母犏牛瘤胃菌群的OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和PD指數(shù)均顯著低于對(duì)照組，這說(shuō)明添加β-胡蘿卜素會(huì)減少菌群物種總數(shù)和微生物的豐富度以及多樣性，該物種多樣性的降低可能與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的提高有關(guān)；而2組的Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異，這說(shuō)明二者群落多樣性相似。

在瘤胃中，厚壁菌門和擬桿菌門是瘤胃內(nèi)豐度最高的2個(gè)菌門，二者與纖維素的降解有關(guān)[21]。研究表明，在肥胖病人和小鼠模型中，肥胖與擬桿菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度有關(guān)，擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度高，則表明機(jī)體對(duì)食物的消化吸收能力強(qiáng)[22]。還有研究表明，飼料利用率低的牦牛瘤胃擬桿菌門相對(duì)豐度較低[23]。本研究中，試驗(yàn)組瘤胃擬桿菌門相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，這可能就是ADF和NDF表觀消化率提高的原因?；ヰB(yǎng)菌門具有蛋白質(zhì)降解功能[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，互養(yǎng)菌門與牙周炎的發(fā)生密切相關(guān)[26]；此外，目前17個(gè)互養(yǎng)菌門分離株中有12株在不同過(guò)程感染樣本中被分離到，這表明它們可能在微生物區(qū)系中發(fā)揮著功能作用，但也可能作為條件致病菌導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組瘤胃互養(yǎng)菌門相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組，這表明β-胡蘿卜素可能在減少瘤胃炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用。據(jù)報(bào)道，放線菌門、髕骨細(xì)菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門是在土壤堆肥中的優(yōu)勢(shì)菌門[28]，主要作用于纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及腐殖質(zhì)的分解[29]，但是其在瘤胃中的潛在功能還有待進(jìn)一步闡明。

本研究中，在屬水平上，試驗(yàn)組瘤胃普雷沃氏菌屬1和鼠桿菌科的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組；此外，試驗(yàn)組瘤胃球菌科UCG-014相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，這進(jìn)一步說(shuō)明β-胡蘿卜組可提高母犏牛對(duì)蛋白質(zhì)和纖維的降解能力。甲烷短桿菌屬與甲烷的產(chǎn)生有關(guān)[30]，本研究中甲烷短桿菌屬為第2大菌屬。祝伊梟等[31]研究表明，相比于荷斯坦奶牛和麥洼牦牛，犏牛的產(chǎn)甲烷菌屬更多，這與本研究結(jié)果一致。研究表明，放牧70 d后奶牛乳中β-胡蘿卜素含量顯著高于初始放牧[32]，這說(shuō)明放牧牛攝取了更多的β-胡蘿卜素并能在體內(nèi)沉積；還有研究表明，放牧牛最長(zhǎng)肌和半腱肌中β-胡蘿卜素含量高于圈養(yǎng)牛[33]；此外，有研究表明圈養(yǎng)牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量顯著高于放牧牛和放牧加補(bǔ)飼牛[34]；圈舍牦牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌屬高于放牧牛[35]，這說(shuō)明β-胡蘿卜素可能對(duì)產(chǎn)甲烷菌屬具有抑制作用。有趣的是，本研究中，試驗(yàn)組瘤胃甲烷短桿菌屬相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組，這表明β-胡蘿卜素可能可以降低瘤胃甲烷的產(chǎn)生，但該結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

① 飼糧添加β-胡蘿卜素可以提高母犏牛對(duì)ADF和NDF的表觀消化率。

② 飼糧添加β-胡蘿卜素可以提高母犏牛瘤胃丙酸和MCP含量，降低瘤胃乙酸/丙酸值，改變瘤胃發(fā)酵模式。

③ 飼糧添加β-胡蘿卜素可以降低母犏牛瘤胃甲烷短桿菌屬相對(duì)豐度，提高瘤胃擬桿菌門、普雷沃氏菌屬1和瘤胃球菌科UCG-014相對(duì)豐度，增強(qiáng)對(duì)纖維的降解能力。