李玉琴 黃 新 高鵬翔 趙小博 王 慧 蔣林樹(shù)

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

瘤胃是反芻動(dòng)物特有的消化器官。飼糧中的干物質(zhì)在瘤胃中被消化，合成微生物蛋白(MCP)和參與瘤胃發(fā)酵，為奶牛提供機(jī)體所需的氨基酸和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，VFA被瘤胃壁吸收，是奶牛機(jī)體主要的能量來(lái)源[1]。因此，瘤胃干物質(zhì)消化機(jī)能直接關(guān)系著奶牛的生理健康,也影響著正常的生產(chǎn)[2]。自禁抗以來(lái)，益生菌在動(dòng)物生產(chǎn)中的使用大幅增加[3]。目前，益生菌已被認(rèn)為是一種潛在的綠色飼料添加劑，在反芻動(dòng)物中，益生菌主要是通過(guò)調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式，提高飼料利用率，來(lái)提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，改善動(dòng)物健康狀況[4]。

解淀粉芽孢桿菌是廣泛存在于自然環(huán)境中的革蘭氏陽(yáng)性需氧細(xì)菌，能分泌多種抗菌物質(zhì)，對(duì)各種致病性真菌、致病性弧菌等細(xì)菌的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用[5]。作為一種多功能和潛在的益生菌，解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生多種胞外酶，包括α-淀粉酶、纖維素酶、金屬蛋白酶和蛋白酶，這些酶在動(dòng)物腸道內(nèi)定植，可增強(qiáng)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，而且對(duì)人畜無(wú)毒害，不污染環(huán)境，在動(dòng)物生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛[6]。研究表明，補(bǔ)飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌可以提高奶牛的乳蛋白率，增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力和抗氧化能力[7]；飼喂羔羊添加3%解淀粉芽孢桿菌的微生態(tài)制劑能夠顯著提高羔羊血清免疫力，通過(guò)改善羔羊胃腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，顯著防治羔羊腹瀉[8]；飼喂1×109CFU/mL解淀粉芽孢桿菌增加了黑山羊瘤胃微生物的多樣性和豐富度，通過(guò)改善瘤胃中有益微生物系統(tǒng)來(lái)減少瘤胃中致病細(xì)菌的數(shù)量，以促進(jìn)黑山羊營(yíng)養(yǎng)代謝，提高生長(zhǎng)性能和免疫力[9]；在畜禽飼糧中添加解淀粉芽孢桿菌還可以減少糞便中含氮物質(zhì)和含磷物質(zhì)等的排放，改善畜禽養(yǎng)殖環(huán)境[10-11]。以上結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌可以作為一種飼料添加劑在反芻動(dòng)物中應(yīng)用。目前，解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)研究解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃干物質(zhì)消化率、發(fā)酵參數(shù)及代謝物的影響，為解淀粉芽孢桿菌在奶牛養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用解淀粉芽孢桿菌粉劑由某有限公司提供(儲(chǔ)存方法：陰涼干燥處儲(chǔ)存；保質(zhì)期：24個(gè)月)，該菌劑含解淀粉芽孢桿菌活菌數(shù)為1×1011CFU/g。尼龍袋制備參照《反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究方法》[12]：購(gòu)買(mǎi)孔徑42 μm的尼龍過(guò)濾布，制成8 cm×12 cm規(guī)格的尼龍袋，然后用滌綸線雙線縫合，酒精燈火焰對(duì)其密封、標(biāo)號(hào)，用自來(lái)水進(jìn)行浸泡以及沖洗，65 ℃烘24 h至恒重備用。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物試驗(yàn)在奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室延慶基地進(jìn)行。

選用6頭胎次(2～3胎)、體重[(662±57) kg]、泌乳天數(shù)[(160±22) d]、產(chǎn)奶量[(36.1±3.8) kg/d]相近的安裝永久性瘺管的奶牛，隨機(jī)分為3組，每組2頭。采用3×3拉丁方設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，每組分別投喂0、5×109、5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌，試驗(yàn)期為3期，每期13 d，其中預(yù)試期10 d，正試期3 d，在正試期開(kāi)始時(shí)用尼龍袋法測(cè)定奶牛瘤胃干物質(zhì)消化率。試驗(yàn)期間采用全混合日糧(TMR)飼喂，每天飼喂3次，散欄飼養(yǎng)，自由采食，飲水充足。

選用30頭胎次[(2.5±0.3)胎]、初始體重[(559.2±37.4) kg]、產(chǎn)奶量[(35.2±1.5) kg/d]、泌乳天數(shù)[(99±2) d]相近的荷斯坦奶牛，采用隨機(jī)分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)分成3組，每組10頭。3組奶牛在晨飼前分別口腔投喂0(對(duì)照組)、5×109、5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌，于2019年5月21日至2019年8月1日進(jìn)行為期52 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)，其中預(yù)試期10 d，正試期42 d。試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。牛舍內(nèi)每隔5 m裝有1臺(tái)懸掛式風(fēng)扇(青州市開(kāi)發(fā)區(qū)潤(rùn)江溫控設(shè)備廠)，當(dāng)環(huán)境溫度高于20 ℃時(shí)，風(fēng)扇以2 m/s的速度運(yùn)轉(zhuǎn)，牛舍日平均相對(duì)濕度為(48.8±0.3)%。試驗(yàn)期間采用TMR飼喂，每天飼喂3次(07:00、13:00、19:00)，散欄飼養(yǎng)，自由采食，飲水充足。正試期最后1 d采集奶牛瘤胃液樣品、糞樣和尿樣。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目Items含量Content中性洗滌纖維NDF31.34鈣Ca0.68磷P0.41

1.3 樣品的采集與測(cè)定

1.3.1 瘤胃干物質(zhì)消化率的測(cè)定

尼龍袋(尺寸為8 cm×12 cm，孔徑為42 μm)中放入10 g烘干的飼糧干物質(zhì)，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組再分別放入0(對(duì)照組)、0.05(活菌數(shù)為5×109CFU)、0.5 g(活菌數(shù)為5×1010CFU)解淀粉芽孢桿菌粉劑，于晨飼后2 h從瘤胃瘺管中投入瘤胃中，按“同時(shí)投入，依次取出”的原則，在瘤胃中分別培養(yǎng)0、2、6、12、24、36、48、72 h，0時(shí)間點(diǎn)的尼龍袋作為空白對(duì)照，不需要置于瘤胃中，直接放入39 ℃溫水中，培養(yǎng)30 min后取出，放入烘箱中65 ℃烘干。培養(yǎng)結(jié)束后，取出的尼龍袋立即放入冷水中終止微生物活動(dòng)，用自來(lái)水沖洗黏附在袋子外的飼料顆粒，用洗衣機(jī)洗15 min，將尼龍袋放置于65 ℃烘箱內(nèi)，烘至恒重(大約24 h)并稱(chēng)重，按如下公式計(jì)算瘤胃干物質(zhì)消化率:

A=[(B-C)/B]×100。

式中：A為瘤胃干物質(zhì)消化率(%)；B為培養(yǎng)前干物質(zhì)的重量+尼龍袋的重量(g)；C為培養(yǎng)后尼龍袋的總重量(g)。

1.3.2 瘤胃液的采集

在正試期最后1 d，晨飼前1 h通過(guò)口腔采液器進(jìn)行瘤胃液采集，每頭牛采取200 mL，4層紗布過(guò)濾后測(cè)定pH，將瘤胃液分裝于15 mL離心管(添加25%偏磷酸)和5 mL凍存管中，保存于-80 ℃冰箱。分裝于15 mL離心管(添加25%偏磷酸)的瘤胃液用于氨態(tài)氮(NH3-N)、MCP、VFA含量的測(cè)定。分裝于5 mL凍存管的瘤胃液，用液氮速凍后用冰袋送往上海凌恩生物科技有限公司測(cè)定代謝物。

1.3.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

pH：使用PHS-10型便捷式pH計(jì)測(cè)定。

NH3-N含量：參照王加啟[12]介紹的比色法測(cè)定。

VFA含量：采用內(nèi)標(biāo)法，使用安捷倫7890B 型號(hào)氣相色譜儀測(cè)定。取5 mL瘤胃液，10 000×g離心10 min，取1.5 mL上清液至2 mL離心管中，加入0.15 mL 25%偏磷酸溶液，用渦流混合器混勻，靜置30 min，10 000×g離心15 min，取上清液1.5 mL置于測(cè)樣瓶中。采用安捷倫7890B型號(hào)氣相色譜儀測(cè)定瘤胃液中各種VFA和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)的含量。測(cè)定條件：檢測(cè)器溫度280 ℃，柱溫100 ℃，氣化室200 ℃，高純氮?dú)庾鳛檩d氣，壓力90 kPa，總流量為37.2 mL/min，空氣流量400 mL/min，氫氣流量40 mL/min，吹掃流量3 mL/min，分流比50∶1，線速度為23.4 cm/s。

MCP含量測(cè)定：參照黃婉玉[13]介紹的考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定。取3 mL瘤胃液于離心管，13 000×g、4 ℃離心20 min，吸取上清液1 mL于1.5 mL離心管中，13 000×g、4 ℃離心20 min，棄去上清液，沉淀中加1 mL 0.25 mol/L NaOH混勻后轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，重復(fù)3次。100 ℃水浴10 min，吸取1 mL，13 000×g、4 ℃離心35 min，取上清液500 μL于10 mL離心管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，渦旋振蕩混勻，于波長(zhǎng)595 nm處，使用酶標(biāo)儀(Multiskan FC，賽默飛世爾儀器有限公司)測(cè)定吸光度值，計(jì)算瘤胃液中MCP的含量。

1.4 瘤胃代謝物的測(cè)定

根據(jù)之前研究結(jié)果以及本試驗(yàn)飼喂解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響研究結(jié)果進(jìn)行劑量篩選，最終采用補(bǔ)飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌的奶牛的瘤胃液進(jìn)行瘤胃代謝物的檢測(cè)。仍以不補(bǔ)飼解淀粉芽孢桿菌的組為對(duì)照組(MC)，補(bǔ)飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌組為試驗(yàn)組(MT1)。

1.4.1 樣本處理

將瘤胃液樣本從-80 ℃冰箱取出，4 ℃解凍，取100 μL置于EP管中，加入400 μL質(zhì)譜級(jí)甲醇沉淀蛋白，加入500 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋振蕩，冰浴靜置5 min，15 000 r/min、4 ℃離心10 min，取一定量的上清加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中15 000×g、4 ℃離心10 min，收集上清，進(jìn)樣進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析。

色譜條件：色譜柱為Hyperil Gold column (C18)，柱溫為40 ℃，流速為0.2 mL/min，正模式下，流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為甲醇；負(fù)模式下，流動(dòng)相A為5 mmol/L醋酸銨，pH 9.0，流動(dòng)相B為甲醇。

色譜梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 色譜梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure of chromatography %

質(zhì)譜條件：采用AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定，采集樣品的一級(jí)、二級(jí)譜圖。電噴霧電離源(ESI源)條件為Ion Source Gas1(Gas1):40，Ion Source Gas2(Gas2):80，Curtain gas (CUR):30，source temperature:650 ℃，IonSapary Voltage Floating (ISVF) ±5 000 V(正負(fù)2種模式)；二級(jí)質(zhì)譜采用information dependent acquisition (IDA)獲得，并且采用high sensitivity模式，De-clustering potential (DP):±60 V(正負(fù)2種模式)，Collision Energy:(35±15) eV，IDA設(shè)置Exclude isotopes within 4 Da，Candidate ions to monitor per cycle:10。

1.4.2 代謝物鑒定與定量

將色譜-質(zhì)譜檢測(cè)的下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer (CD)軟件中，先進(jìn)行保留時(shí)間、質(zhì)荷比等參數(shù)的篩選，然后對(duì)不同樣品根據(jù)保留時(shí)間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 ppm進(jìn)行峰對(duì)齊，使鑒定更準(zhǔn)確，再根據(jù)設(shè)置的質(zhì)量偏差5 ppm、信號(hào)強(qiáng)度偏差30%、信噪比3、最小信號(hào)強(qiáng)度10 0000、加和離子等信息提取信號(hào)峰，同時(shí)根據(jù)峰面積進(jìn)行定量，通過(guò)分子離子峰和碎片離子預(yù)測(cè)分子式，并與zCloud、mzVault和MassList數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，利用空白樣本數(shù)據(jù)去除背景離子，并對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化，最后得到代謝物鑒定與定量結(jié)果。

1.4.3 多元數(shù)據(jù)分析

主成分分析(PCA)：PCA能在整體上反映2組樣本代謝的相似性或差異性。使用Bray-Curtis距離算法，不同顏色點(diǎn)代表不同分組的樣本，2組樣本點(diǎn)越接近，表明2組樣本代謝物越相似。

偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)：運(yùn)用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣品類(lèi)別之間的關(guān)系模型，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類(lèi)別的預(yù)測(cè)；同時(shí)通過(guò)變量投影重要度(VIP)來(lái)衡量各代謝物的表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類(lèi)判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，通常以VIP>1.0作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。使用MetaX軟件，建立PLS-DA模型，隨后用Y隨機(jī)排序進(jìn)行置換檢驗(yàn)，通過(guò)模擬200次PLS-DA模型，確定隨機(jī)模型的模型擬合度(R2)和預(yù)測(cè)能力(Q2)參數(shù)。R2和Q2越接近1，表明模型越穩(wěn)定可靠，一般Q2>0.5可判定模型穩(wěn)定可靠。

1.4.4 差異代謝物篩選

根據(jù)PLS-DA得到的VIP來(lái)初步篩選各組間的差異代謝物，進(jìn)一步結(jié)合t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較，驗(yàn)證差異代謝物是否具有顯著性，判別標(biāo)準(zhǔn)VIP>1且P<0.05。倍數(shù)差異(FC)表示該代謝物飼喂解淀粉芽孢桿菌前后含量的比值，F(xiàn)C>1.2表明飼喂解淀粉芽孢桿菌后含量升高，F(xiàn)C<0.833表明含量下降。

1.5 層次聚類(lèi)與KEGG富集分析

首先使用標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)(z-score)將代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后利用R語(yǔ)言中的pheatmap包繪制層次聚類(lèi)熱圖。隨后使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異代謝物的代謝通路富集分析。當(dāng)富集通路的P<0.05時(shí)，被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

瘤胃干物質(zhì)消化率：所有數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件進(jìn)行處理，采用SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行拉丁方設(shè)計(jì)的方差分析，組間采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。

瘤胃發(fā)酵參數(shù)：所有數(shù)據(jù)使用Excel 2007軟件進(jìn)行處理，采用SPSS 19.0的one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，組間采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值和SEM。

代謝組學(xué)：首先將色譜-質(zhì)譜檢測(cè)的下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer軟件中，進(jìn)行譜圖處理及數(shù)據(jù)庫(kù)搜庫(kù)，得到代謝物的定性定量結(jié)果，然后對(duì)代謝物進(jìn)行PCA和PLS-DA，揭示不同組別代謝物的差異。利用層次聚類(lèi)與KEGG富集分析，揭示樣本之間及代謝物和代謝物之間的關(guān)系，最后通過(guò)代謝通路等功能分析解釋代謝物相關(guān)的生物學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃干物質(zhì)消化率的影響

瘤胃干物質(zhì)消化率反映著奶牛對(duì)飼糧的利用程度，由表3可知，與對(duì)照組相比，補(bǔ)飼5×1010CFU解淀粉芽孢桿菌在培養(yǎng)12、24、36、48、72 h時(shí)均可顯著提高奶牛瘤胃干物質(zhì)消化率(P<0.05)；補(bǔ)飼5×109CFU解淀粉芽孢桿菌在培養(yǎng)36和48 h時(shí)可以顯著提高奶牛瘤胃干物質(zhì)消化率(P<0.05)。

表3 解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃干物質(zhì)消化率的影響Table 3 Effects of Bacillus amylolyticus on rumen dry matter digestibility of dairy cows %

2.2 解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，補(bǔ)飼5×109和5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃pH和NH3-N含量均沒(méi)有顯著影響(P>0.05)；補(bǔ)飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌可顯著提高奶牛瘤胃中異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、TVFA和MCP含量(P<0.05)；補(bǔ)飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌可顯著降低瘤胃中乙酸/丙酸(P<0.05)，使奶牛瘤胃發(fā)酵模式由乙酸型向丙酸型轉(zhuǎn)變，并且顯著提高奶牛瘤胃異戊酸和異丁酸含量(P<0.05)。綜合各項(xiàng)指標(biāo)考慮，補(bǔ)飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌時(shí)瘤胃發(fā)酵效果比較好。

表4 解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 Effects of Bacillus amylolyticus on rumen fermentation parameters of dairy cows

續(xù)表4時(shí)間Time/h解淀粉芽孢桿菌添加水平AdditionlevelofBacillusamyloliquefaciens/(CFU/d)05×1095×1010均值標(biāo)準(zhǔn)誤SEMP值P-value乙酸/丙酸Aceticacid/propionicacid2.85b2.55ab2.36a0.0210.001微生物蛋白MCP/(mg/mL)44.45a70.33b63.58ab4.3570.030

2.3 解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃代謝物的影響

2.3.1 奶牛瘤胃代謝物的PCA

數(shù)據(jù)經(jīng)處理后得到添加與不添加解淀粉芽孢桿菌的2組奶牛瘤胃液樣本的分布情況，PCA圖見(jiàn)圖1。由PCA圖可知，MC組與MT1組樣本點(diǎn)較為分散，2組代謝物輪廓并不完全重疊，但由于存在重疊，需要進(jìn)一步采用有監(jiān)督模式識(shí)別方法PLS-LDA進(jìn)行判別分析。

MC:MC組 MC group；MT1:MT1 group。下圖同 the same as below。圖1 MC組與MT1組奶牛瘤胃代謝物的PCA圖Fig.1 PCA diagram of rumen metabolites of dairy cows in MC group and MT1 group

2.3.2 奶牛瘤胃代謝物的PLS-DA

為能進(jìn)一步闡釋各組瘤胃代謝物之間的差異，對(duì)各組樣品進(jìn)行PLS-DA，PLS-DA得分圖見(jiàn)圖2。由PLS-DA得分圖可知，MC組與MT1組瘤胃液樣品可明顯分離且同組樣品在組內(nèi)聚集良好，表明各組瘤胃液樣品的組內(nèi)差異不大，而組間差異明顯；同時(shí)得到能夠解釋數(shù)據(jù)可靠性的模型驗(yàn)證參數(shù)R2和Q2，置換檢驗(yàn)圖參數(shù)Q2intercept<0，表示模型未發(fā)生過(guò)擬合，且所有的Q2<0且值均小于R2值(圖3)，說(shuō)明模型未出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象，該P(yáng)LS-DA模型有效、穩(wěn)定。

圖2 MC組與MT1組奶牛瘤胃代謝物的PLS-DA得分圖Fig.2 PLS-DA score map of rumen metabolites of dairy cows in MC group and MT1 group

圖3 MC組與MT1組奶牛瘤胃代謝物的PLS-DA置換檢驗(yàn)圖Fig.3 PLS-DA replacement test map of rumen metabolites of dairy cows in MC group and MT1 group

2.3.3 差異代謝物的篩選及鑒定

通過(guò)PLS-DA得到的VIP來(lái)初步篩選各組間的差異物，根據(jù)VIP>1、P<0.05、FC>1.2 或FC<0.833的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選差異代謝物。分析結(jié)果表明，共鑒定出差異顯著的代謝物有50種，其中顯著下調(diào)差異代謝物有36種，包括DL-精氨酸、脯氨酸、DL-3-羥降纈氨酸、沙丁胺、N-乙酰谷氨酸、吲哚-3-乳酸、山奈酚、甲基苯基縮水甘油酸乙酯、金雀異黃素、L-焦谷氨酸、石竹烯氧化物、γ-谷氨酰亮氨酸、脫氧皮質(zhì)酮21-葡萄糖苷、黃豆苷元、章魚(yú)堿、糖精蛋白、芥子酸、毒扁豆堿、D-蛋氨酸、大豆皂苷Ⅰ、順式烏頭酸、反肉桂酸、前列腺素j2、D-木糖醇、3-羥基-4-甲氧基肉桂酸、L-古洛糖內(nèi)酯、D-葡萄糖酸、D-蔗糖酸等；顯著上調(diào)的差異代謝產(chǎn)物14種，包括氯苯甲酰胺、毛果蕓香堿、甲基膽堿、帕潘立酮、胸苷、D-葡萄糖6-磷酸、4-硝基苯酚、脫氧膽酸、D-七庚糖7-磷酸等。最后用火山圖形式將篩選的差異代謝物進(jìn)行可視化演示，見(jiàn)圖4。

圖4 正離子模式下奶牛瘤胃差異代謝物火山圖Fig.4 Volcano plot of differential metabolites in rumen of dairy cows in positive ion mode

對(duì)差異代謝物進(jìn)層次聚類(lèi)分析，當(dāng)同組樣本能夠出現(xiàn)在同一簇中時(shí)，表明篩選出的差異代謝物可靠性較高。代謝過(guò)程中反應(yīng)步驟相近的代謝物聚類(lèi)在同一簇內(nèi)，表現(xiàn)出類(lèi)似的表達(dá)模式，見(jiàn)圖5。

圖5 正離子模式下差異代謝物層次聚類(lèi)結(jié)果Fig.5 Hierarchical clustering results of differential metabolites in positive ion pattern

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝通路注釋?zhuān)话阋訮<0.05作為判別富集顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過(guò)Fisher檢驗(yàn)對(duì)50種差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析，找到的差異代謝物相關(guān)的代謝通路分別是抗壞血酸和藻酸鹽代謝、泛醌和其他萜類(lèi)醌的生物合成、磷酸戊糖途徑、膽汁分泌、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、碳代謝、苯丙氨酸代謝、氨基酸的生物合成、谷胱甘肽代謝、嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝通路，詳見(jiàn)圖6。11條代謝通路對(duì)應(yīng)的差異代謝物如表5所示，11條差異代謝通路中，富集差異顯著的代謝通路為抗壞血酸和藻酸鹽代謝(P<0.05)。

表5 11條主要代謝通路對(duì)應(yīng)的差異代謝物Table 5 Differential metabolites corresponding to 11 main metabolic pathways

3 討 論

3.1 解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃干物質(zhì)消化率的影響

Hassan等[14]補(bǔ)飼5.6×1014CFU/d益生菌后提高了羔羊的干物質(zhì)消化率和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率。Zhang等[15]研究表明，在荷斯坦?fàn)倥ｏ暭Z中添加植物乳桿菌可提高犢牛的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率。劉程[16]也表明，在奶牛飼糧中添加20 g/頭復(fù)合益生菌(枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和米曲霉)能通過(guò)改善泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率。研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生α-淀粉酶、蛋白酶、水解酶和脂肪酶等，這些酶能夠降解植物性碳水化合物以及木質(zhì)纖維素物質(zhì)，使飼料中的限制因子轉(zhuǎn)化成能被動(dòng)物利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，利于動(dòng)物消化吸收，從而提高飼料消化率[6]。在本試驗(yàn)中，補(bǔ)飼解淀粉芽孢桿菌在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)均可以顯著提高奶牛瘤胃干物質(zhì)消化率，可能是因?yàn)榻獾矸垩挎邨U菌促進(jìn)了奶牛對(duì)飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而提高瘤胃干物質(zhì)消化率。研究表明，瘤胃pH低于6.0使瘤胃微生物的生長(zhǎng)繁殖受到抑制，造成瘤胃干物質(zhì)消化率的下降[17]。在本研究中，對(duì)照組和補(bǔ)飼解淀粉芽孢桿菌組奶牛瘤胃pH均在6.0以上，表明解淀粉芽孢桿菌對(duì)瘤胃微生物的生長(zhǎng)繁殖無(wú)抑制作用，對(duì)瘤胃干物質(zhì)消化率無(wú)負(fù)面影響。在本試驗(yàn)中，補(bǔ)飼解淀粉芽孢桿菌的2個(gè)試驗(yàn)組奶牛的瘤胃干物質(zhì)消化率在36 h達(dá)到最高，但48和72 h時(shí)有下降趨勢(shì)，可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)解淀粉芽孢桿菌的活性會(huì)降低。

左圖為正離子模式KEGG富集通路，右圖為負(fù)離子模式KEGG富集通路。圖中圓點(diǎn)顏色深淺表示P值的大小，圓點(diǎn)面積大小表示參與該通路差異代謝物的多少。Left figure showed the positive ion mode KEGG enrichment pathways,and right figure showed the negative ion mode KEGG enrichment pathways.The color of the dots in the figure indicated the size of the P-value,and the aera of the dots indicated the number of differential metabolites involved in this pathway.圖6 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis results

3.2 解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃pH是衡量瘤胃酸堿平衡狀況和瘤胃微生物發(fā)酵的重要指標(biāo)，對(duì)維持瘤胃消化代謝發(fā)揮著重要作用[18]。適宜的瘤胃pH是瘤胃微生物代謝活動(dòng)的前提，Wanapat等[19]認(rèn)為，反芻動(dòng)物瘤胃液的正常pH一般在6.0～7.2。在本試驗(yàn)中，補(bǔ)飼解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃pH無(wú)顯著影響，且3組奶牛瘤胃pH均在正常范圍之內(nèi)。NH3-N是微生物合成MCP的前體物質(zhì)，其含量是瘤胃內(nèi)飼糧中含氮物質(zhì)降解及微生物對(duì)NH3-N利用的綜合反映。反芻動(dòng)物瘤胃NH3-N含量的最佳范圍為5～30 mg/dL[20]。在本研究中，3組試驗(yàn)?zāi)膛Ａ鑫窷H3-N含量都在此范圍內(nèi)，且飼喂添加解淀粉芽孢桿菌飼糧的奶牛瘤胃NH3-N含量有上升趨勢(shì)，且補(bǔ)飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌時(shí)奶牛瘤胃MCP含量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌調(diào)控瘤胃NH3-N含量提高了微生物對(duì)飼糧中含氮物質(zhì)的降解效率，進(jìn)而促進(jìn)了瘤胃發(fā)酵。

VFA是反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵飼糧的重要產(chǎn)物，為反芻動(dòng)物提供能量和維持瘤胃環(huán)境穩(wěn)定。VFA主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸，其中乙酸、丙酸和丁酸約占瘤胃TVFA的95%，是反芻動(dòng)物的主要能量來(lái)源[21-22]。乙酸是反芻動(dòng)物重要的VFA，是脂肪酸合成和乳脂合成的主要成分[23]。丙酸通過(guò)糖異生作用合成葡萄糖為機(jī)體提供能量。丁酸經(jīng)瘤胃壁吸收，促進(jìn)瘤胃上皮發(fā)育，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[24]。異丁酸促進(jìn)瘤胃纖維分解菌的生長(zhǎng)與繁殖，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵[25]。異戊酸和戊酸促進(jìn)瘤胃氨基酸的生物合成，進(jìn)而提高M(jìn)CP的合成[26]。研究表明，飼喂奶牛1×1011CFU/d益生菌顯著提高了瘤胃中丙酸、戊酸和TVFA的含量[27]。反芻動(dòng)物飼糧補(bǔ)充瘤胃調(diào)控性飼料添加劑異位酸(異戊酸、異丁酸和戊酸)能夠提高瘤胃TVFA、乙酸和丁酸含量，正向調(diào)控瘤胃功能，促進(jìn)瘤胃內(nèi)消化代謝，促進(jìn)瘤胃細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖和MCP的合成[25-26]。在本研究中，補(bǔ)飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌顯著提高了奶牛瘤胃TVFA、異丁酸、丁酸和戊酸含量，補(bǔ)飼5×1010CFU/d解淀粉芽孢桿菌雖也有一定程度的提高，但差異并不顯著。這說(shuō)明適量的解淀粉芽孢桿菌可以在一定程度上促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，改變瘤胃中VFA的比例。

瘤胃MCP在提供反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)方面發(fā)揮重要作用，可為畜體提供40%～60%的蛋白質(zhì)，還能夠提供動(dòng)物生長(zhǎng)、維持和生產(chǎn)所需的大部分氨基酸[28]。研究表明，NH3-N是MCP合成的主要前體物質(zhì)[29]，異丁酸、異戊酸和戊酸能夠促進(jìn)瘤胃微生物對(duì)NH3-N的攝取利用，進(jìn)而提高瘤胃MCP的合成[30]。在本研究中，補(bǔ)飼解淀粉芽孢桿菌提高了奶牛MCP含量，可能是解淀粉芽孢桿菌提高了瘤胃中異丁酸、異戊酸和戊酸含量，促進(jìn)了NH3-N和MCP的生成。

3.3 解淀粉芽孢桿菌對(duì)奶牛瘤胃代謝組的影響

11條差異代謝通路中，抗壞血酸和藻酸鹽代謝通路為差異顯著的代謝通路?？箟难岷驮逅猁}代謝通路中檢測(cè)到3種上調(diào)差異代謝物，分別是L-抗壞血酸、丙酮酸和D-葡萄糖酸鹽。D-葡萄糖酸鹽可以作為飼料添加劑，改善動(dòng)物胃腸道菌落環(huán)境[31]。在微生物的代謝過(guò)程中，D-葡萄糖酸鹽被D-葡萄糖酸鹽脫水酶脫水為D-5-酮基-4-脫氧葡萄糖酸(KDG)，然后通過(guò)KDG醛縮酶將KDG轉(zhuǎn)化為酒石酸半醛，酒石酸酯半醛還原酶將酒石酸酯半醛還原為D-甘油酸酯，D-甘油酸酯被甘油酸酯激酶磷酸化，產(chǎn)生3-磷酸甘油酸酯被微生物利用，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和繁殖[32-33]。在本試驗(yàn)中，補(bǔ)飼解淀粉芽孢桿菌使得瘤胃代謝物D-葡萄糖酸鹽顯著上調(diào)，可能促進(jìn)瘤胃微生物的生長(zhǎng)和繁殖。在本試驗(yàn)中，補(bǔ)飼解淀粉芽孢桿菌提高了奶牛瘤胃中TVFA含量，可以推測(cè)D-葡萄糖酸鹽的上調(diào)促進(jìn)了奶牛瘤胃微生物的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而使瘤胃中TVFA含量升高。L-抗壞血酸是機(jī)體必需的營(yíng)養(yǎng)素，具有多種生理功能，能維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)，增強(qiáng)機(jī)體抗病和解毒能力，能通過(guò)自身氧化還原反應(yīng)保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激[34]。丙酮酸能夠下調(diào)炎癥信號(hào)通路核因子-κB(NF-κB)的表達(dá)，抑制促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的釋放，降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)[35]。這表明補(bǔ)飼解淀粉芽孢桿菌后奶牛瘤胃代謝物L(fēng)-抗壞血酸和丙酮酸的上調(diào)與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化和免疫力有關(guān)，這也印證了前期試驗(yàn)研究結(jié)果飼喂解淀粉芽孢桿菌可以提高奶牛免疫能力和抗氧化能力[7]?？偠灾?，解淀粉芽孢桿菌通過(guò)影響瘤胃代謝物L(fēng)-抗壞血酸、丙酮酸和D-葡萄糖酸鹽的含量，改善瘤胃發(fā)酵功能，并且提高奶牛免疫能力和抗氧化能力。

4 結(jié) 論

解淀粉芽孢桿菌通過(guò)影響瘤胃代謝物含量，改善瘤胃發(fā)酵功能，來(lái)提高奶牛瘤胃干物質(zhì)消化率。綜合分析認(rèn)為，奶牛補(bǔ)飼5×109CFU/d解淀粉芽孢桿菌效果較佳。