孫金芝 賈新超 高 偉 宋偉光 趙鵬宇 趙 劍*

(1.河北植物提取創(chuàng)新中心有限公司，邯鄲 057250；2.河北省植物源動物保健品技術創(chuàng)新中心，邯鄲 057250；3.河北省植物資源綜合利用重點實驗室，邯鄲 057250)

葉黃素是一種含氧類胡蘿卜素，多項研究表明葉黃素沉積在視網膜黃斑，可以吸收藍光并通過淬滅氧自由基來保護視網膜免受光誘導的氧化損傷[1-2]。而作為飼料添加劑，葉黃素能沉積在雞蛋、肉雞和水產動物的皮膚中，滿足消費者對畜禽產品色澤的偏好[3-4]。同時，與果蔬和補充劑等食物來源相比，通過生物體蓄積的葉黃素也有更好的生物利用度[5-6]。

天然葉黃素的主要工業(yè)來源是提取和皂化萬壽菊中的葉黃素酯獲得葉黃素單體?；莶Φ萚7]在大鼠上的研究認為動物可以直接利用葉黃素酯，但其生物利用度僅相當于葉黃素單體的18.55%。相反，黃小春等[8]研究表明，蛋雞對葉黃素酯和葉黃素的利用效率沒有顯著差異。本研究擬通過比較葉黃素酯和葉黃素在蛋雞體內的消化和沉積情況，以及對蛋黃顏色的影響，探討葉黃素酯作為蛋雞飼料添加劑的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

葉黃素和葉黃素酯為萬壽菊提取，類胡蘿卜素含量均為2%；葉黃素標準品(X6250)、玉米黃質標準品(14681)均為Sigma-Aldrich公司產品。

1.2 試驗設計

選取350日齡、健康的海蘭灰蛋雞72只，隨機分成2個組，每組6個重復，每個重復6只雞。試驗期共56 d，劃分為2個階段。階段1為28 d的耗竭期，期間飼喂粉狀小麥型基礎飼糧(表1)，其營養(yǎng)水平配制標準參照《海蘭灰商品蛋雞飼養(yǎng)管理手冊》。階段2為28 d的正試期，期間2個組分別飼喂在小麥型基礎飼糧中添加40 mg/kg葉黃素和葉黃素酯的試驗飼糧。飼糧取樣后凍存于-80 ℃待測。試驗期間的環(huán)境參數和日常管理參照《海蘭灰商品蛋雞飼養(yǎng)管理手冊》執(zhí)行。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

在階段1結束時，每個組隨機挑選6只蛋雞進行翅靜脈采血并分離血清，之后屠宰取肝臟和卵巢樣品，另以重復為單位收集當日的雞蛋，使用雞蛋品質測定儀(以色列奧卡EA-01)對蛋黃顏色評分后將蛋黃勻漿均勻。在階段2的最后4 d，每日記錄產蛋數，對蛋黃顏色評分，并以重復為單位連續(xù)收集蛋黃和部分糞便及時凍存于-80 ℃。階段2結束時，每個重復隨機挑選1只蛋雞采集血清、肝臟和卵巢樣品。

1.3 檢測指標

飼糧、糞便、血清、肝臟、卵巢和蛋黃中的類胡蘿卜素含量使用高效液相色譜(HPLC)儀測定，儀器型號為沃特世E2695，使用Ultimate硅膠柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動相為正己烷∶乙酸乙酯∶異丙醇(730∶270∶15)，流速設置為1.4 mL/min，運行時間20 min，柱溫40 ℃，紫外檢測器波長設置為474 nm。樣品中的類胡蘿卜素含量以葉黃素標準品做單點定量法計算。

飼糧和糞便樣品的前處理參考GB/T 23187—2008《飼料中葉黃素的測定 高效液相色譜法》，但樣品不進行皂化，即：稱取2 g左右的飼糧或10 g左右的糞便置于具塞三角瓶中，加入30 mL的萃取劑(正己烷:丙酮∶無水乙醇∶甲苯=34∶23∶20∶23)超聲萃取10 min后，再加入30 mL正己烷和50 mL的10%無水硫酸鈉溶液，劇烈振蕩1 min后離心(4 000 r/min，5 min)，然后抽取上清液經0.22 μm濾膜過濾后上樣檢測。

血清樣品的前處理參考黃旸木等[9]的方法略作修改，即：移取0.5 mL血清至2 mL離心管中，加入0.5 mL的無水乙醇(含0.01%抗壞血酸)，渦旋1 min后再加入0.7 mL的正己烷，繼續(xù)渦旋2 min后3 000 r/min離心7 min，吸取上清液過0.22 μm濾膜后上樣檢測。

肝臟、卵巢和蛋黃樣品前處理參考GB 5009.248—2016《食品安全國家標準 食品中葉黃素的測定》略作修改，即：肝臟、卵巢或蛋黃樣品勻漿后，稱取5 g左右至50 mL離心管中，加入20 mL混合溶劑(正己烷∶甲醇∶乙酸乙酯=1∶1∶1)，2 500 r/min下渦旋20 min，再加入10 mL正己烷和10 mL的10%無水硫酸鈉溶液，劇烈振蕩后4 000 r/min離心5 min，抽取上清液過濾上樣。

葉黃素和葉黃素酯的表觀消化率測定采用內源指示劑法，以飼糧和糞便中的鹽酸不溶灰分作為內源指示劑，其測定方法按GB/T 23742—2009《飼料中鹽酸不溶灰分的測定》執(zhí)行。

一是實施意識領先方略，強化水安全意識。充分重視水在社會經濟中的重要基礎地位，提高水作為資源要素、環(huán)境要素、生態(tài)要素、安全要素的基本認識，統(tǒng)籌謀劃水資源開發(fā)利用與社會經濟發(fā)展。進一步落實領導責任，尤其是地方政府責任，把水安全責任落實作為干部政績考核、選拔任用的重要依據。建立健全節(jié)水社會動員參與機制，充分利用各類媒體，全面客觀介紹水資源危機、節(jié)水常識，保護水文化遺產，提高公眾節(jié)水意識。高度重視和發(fā)揮非政府組織在水安全中的積極作用，營造企業(yè)履行社會責任的社會環(huán)境。

飼糧中葉黃素或葉黃素酯沉積到蛋黃中的效率參考Karadas等[10]的方法計算，計算公式為：

葉黃素或葉黃素酯沉積效率(%)=雞蛋中的類胡蘿卜素(A)總量/飼糧中的類胡蘿卜素(B)總量。

式中：A=蛋黃重(g)×[試驗組蛋黃中類胡蘿卜素含量(mg/kg)-耗竭期蛋黃中類胡蘿卜素含量(mg/kg)]；B=采食量(g)×飼糧中類胡蘿卜素含量×產蛋率(%)。

1.4 數據統(tǒng)計分析

試驗數據用平均值±標準差表示，采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，使用回歸-線性進行相關性分析和方程擬合，以P<0.05為差異顯著標準。

2 結果與分析

2.1 飼糧和糞便中類胡蘿卜素含量及表觀消化率

葉黃素和玉米黃質標準品在本試驗色譜條件下的保留時間分別為10.26和11.39 min；萬壽菊來源葉黃素酯的酯基為多種脂肪酸，無標準品，其保留時間需根據葉黃素酯樣品皂化前后色譜峰的變化情況確定，在本試驗的色譜條件下其保留時間為2.33 min。

圖1和圖2分別展示了飼糧和糞便中類胡蘿卜素的出峰情況。從圖中可見，飼糧中保留時間2.33 min的為葉黃素酯，10.26 min的為葉黃素，11.39 min的為玉米黃質；糞便中還有保留時間3.39 min的物質；與葉黃素酯組飼糧不同，該組糞便中葉黃素酯和葉黃素都可檢出。表2列出了飼糧和糞便中類胡蘿卜素含量。由表中數據可知，小麥型基礎飼糧和耗竭期蛋雞糞便中類胡蘿卜素含量很低。添加葉黃素或葉黃素酯飼糧的類胡蘿卜素含量檢測結果與理論添加量(40 mg/kg)較一致。

圖1 飼糧中類胡蘿卜素色譜圖Fig.1 Chromatogram of carotenoids in diet

圖2 糞便中類胡蘿卜素色譜圖Fig.2 Chromatogram of carotenoids in excrement

表2顯示，葉黃素和葉黃素酯的表觀消化率分別為81.76%和84.80%，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2 肝臟中類胡蘿卜素含量

圖3展示了肝臟中類胡蘿卜素的種類。從圖中可見，3個肝臟樣品中類胡蘿卜素種類一致。肝臟中類胡蘿卜素主要以葉黃素酯的形式存在，除葉黃素酯、葉黃素和玉米黃質外，在3～5 min還有物質出峰，可能是類胡蘿卜素經肝臟代謝后的產物。由表2中數據可知，正試期內葉黃素組和葉黃素酯組蛋雞肝臟中類胡蘿卜素含量遠高于耗竭期，但2組間沒有顯著差異(P>0.05)。

圖3 肝臟中類胡蘿卜素色譜圖Fig.3 Chromatogram of carotenoids in liver

表2 不同樣品中類胡蘿卜素含量以及蛋黃色澤評分、類胡蘿卜素表觀消化率和沉積效率測定結果Table 2 Determination results of different samples for carotenoids content,yolk color score,apparent digestibility and deposition efficiency of carotenoids

2.3 血清、卵巢和蛋黃中類胡蘿卜素含量

圖4 血清中類胡蘿卜素色譜圖Fig.4 Chromatogram of carotenoids in serum

圖5 卵巢中類胡蘿卜素色譜圖Fig.5 Chromatogram of carotenoids in ovarium

圖6 蛋黃中類胡蘿卜素色譜圖Fig.6 Chromatogram of carotenoids in yolk

由表2中數據可知，飼喂添加葉黃素或葉黃素酯飼糧28 d后，其血清、卵巢和蛋黃中類胡蘿卜素含量比耗竭期明顯提高；正試期內，葉黃素組和葉黃素酯組之間血清中類胡蘿卜素含量沒有顯著差異(P>0.05)，但卵巢和蛋黃中類胡蘿卜素含量則表現(xiàn)為葉黃素酯組顯著高于葉黃素組(P<0.05)。葉黃素組和葉黃素酯組類胡蘿卜素沉積到蛋黃中的效率分別是11.27%和16.70%，2組間差異顯著(P<0.05)。蛋黃中類胡蘿卜素含量(X)和蛋黃色澤評分(Y)的相關系數(R2)為0.912，擬合線性方程為Y=0.182X+1.343(P<0.05)。

3 討 論

3.1 葉黃素酯在蛋雞體內的消化

一般認為，葉黃素酯會在消化道脂肪酶的作用下水解成葉黃素單體和脂肪酸而被吸收，但葉黃素酯與葉黃素單體的吸收效率孰高還存在爭議?；莶Φ萚7]的研究認為，大鼠對葉黃素酯的生物利用度是葉黃素單體的18.55%。Hencken[11]評估葉黃素酯在肉仔雞的吸收效率為葉黃素單體的40%～60%。但是在蛋雞上的一些研究顯示，不論是從利用率還是蛋黃色澤，都表明蛋雞對葉黃素酯的吸收效率更高，至少是與葉黃素單體沒有明顯差異[8,12]。在本研究中，葉黃素酯組蛋雞的類胡蘿卜素表觀消化率及血清中類胡蘿卜素含量與葉黃素組相比均沒有顯著差異。由此可見，動物對葉黃素酯的利用率與動物種類和動物生長階段有關，成年家禽可以充分消化吸收葉黃素酯。

3.2 葉黃素在蛋雞組織里的沉積

飼料中的葉黃素或葉黃素酯在體內的吸收可分為4個階段，即從食物中被消化釋放、與脂類形成水溶性膠束、被小腸上皮細胞吸收、通過淋巴系統(tǒng)運輸至血液。但因家禽的淋巴系統(tǒng)不發(fā)達，包含類胡蘿卜素的乳糜微?？赡苤苯舆M入腸系膜靜脈匯至門靜脈運送至肝臟，微粒粒徑太大不會通過肝區(qū)毛細血管直接沉積，而由血液循環(huán)至其他組織[13-16]，在人上的研究顯示運輸載體是高密度脂蛋白和低密度脂蛋白[17]，而在禽上則可能是極低密度脂蛋白[18]。Breithaupt等[12]總結認為，葉黃素在血液中以單體形式運輸，但在沉積部位會被該組織的酶重新酯化。對產蛋家禽而言，卵巢不合成脂類物質[16]，故蛋雞血清、卵巢和蛋黃中的類胡蘿卜素種類一致，以葉黃素單體形式為主。相反，肝臟是體內主要的葉黃素及其代謝物的儲存器官[17,19]。對產蛋家禽而言，肝臟的脂肪合成最為活躍[20]。本研究也證實，蛋雞肝臟中葉黃素酯為優(yōu)勢形式。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，蛋雞肝臟的類胡蘿卜素HPLC圖譜比飼糧類胡蘿卜素HPLC圖譜在3～5 min多3個出峰物質，推測應是葉黃素的代謝產物。葉黃素在體內可發(fā)生C-3和C-3’氧化形成酮式類胡蘿卜素，按氧化程度和異構劃分主要有3種，即：3-羥基-β,ε-3’酮基類胡蘿卜素、3-羥基-ε,ε-3’酮基類胡蘿卜素、ε,ε-3,3’二酮基類胡蘿卜素[19]。

3.3 葉黃素或葉黃素酯對蛋黃色澤的影響

蛋雞飼喂不添加色素的麥類飼糧的情況中，其蛋黃顏色羅氏色度為3～4。添加12 mg/kg的葉黃素后，蛋黃顏色評分在第5天即達到穩(wěn)定狀態(tài)[21]。同樣的添加劑量在鵪鶉中，蛋黃顏色評分達到穩(wěn)定需要7 d，而蛋黃中的類胡蘿卜素含量達到穩(wěn)定狀態(tài)則需要11 d[22]。在本研究中，蛋黃的采樣時間為正試期的第28天，其顏色評分和類胡蘿卜素含量都處于穩(wěn)定狀態(tài)。此時，蛋黃顏色評分與蛋黃中類胡蘿卜素含量呈線性相關，意味著飼糧中添加的葉黃素或葉黃素酯在蛋黃中的沉積效率將決定著蛋黃色澤。

同時比較葉黃素和葉黃素酯在蛋雞中沉積效率的定量研究尚缺乏。有研究表明，添加12 mg/kg的葉黃素可使蛋黃中類胡蘿卜素含量分別達到37.87和39.01 mg/kg，其沉積效率分別為38%和36%[10,21]。在本研究中，添加40 mg/kg的葉黃素其蛋黃中類胡蘿卜素含量為26.35 mg/kg，沉積效率只有11.27%。Islam等[22]研究表明，飼喂添加40 mg/kg葉黃素酯的小麥型飼糧的蛋雞，蛋黃中總類胡蘿卜素含量為18.01 mg/kg。而本研究中相同添加劑量的葉黃素酯則使蛋黃中類胡蘿卜素含量達到了38.72 mg/kg。葉黃素或葉黃素酯的沉積效率受色素原料、使用劑量、試驗動物品種、日齡、飼糧配方等的影響[10,22]，使不同研究的結果可比性較差。

本研究發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，葉黃素酯在蛋雞上的表觀消化率和在蛋黃中的沉積效率都高于葉黃素，從而使蛋黃色澤評分更高，提示這2種不同加工工藝的葉黃素產品存在吸收利用上的差異。相較于葉黃素單體，葉黃素酯沒有經過皂化工藝，保留了脂肪酸、磷脂等成分。而這些成分使葉黃素形成的膠束更容易被吸收[23]。此外，皂化還會造成葉黃素產品中天然維生素E含量的損失。維生素E有促進腸道吸收葉黃素的作用[22]，其原因可能是葉黃素易被氧化，而這種氧化可以被其他抗氧化物質緩解，如添加100 IU/kg的維生素E可提高蛋黃色澤和葉黃素轉化率[24]。

4 結 論

① 葉黃素在蛋雞血液、卵巢和蛋黃中主要以單體的形式存在，而在肝臟中則主要以酯的形式存在。

② 葉黃素酯可以被蛋雞充分利用，且應用效果不差于葉黃素單體。

③ 蛋黃中類胡蘿卜素含量與蛋黃顏色評分有顯著的線性關系。