晏家友 羅宗剛 李書偉 湯文杰 鄺聲耀

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066；3.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，榮昌 402460；4.四川省畜科飼料有限公司，成都 610066；5.畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雙流 616200)

銅是動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一，它在動(dòng)物的生長發(fā)育及免疫調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮著重要的營養(yǎng)生理作用，可以作為酶的組成成分或激活劑，參與體內(nèi)物質(zhì)代謝；可以維持鐵的代謝，促進(jìn)血紅蛋白合成和紅細(xì)胞成熟；可以參與骨細(xì)胞、膠原和彈性蛋白的形成，促進(jìn)骨骼發(fā)育[1-2]。目前，無機(jī)銅(如硫酸銅和堿式氯化銅)是飼糧中銅源的主要添加形式，但是其存在吸收率低、排放量高，吸濕性、易結(jié)塊等負(fù)面問題，還會(huì)對(duì)飼糧中的維生素和油脂產(chǎn)生破壞作用[3-4]。因而，研發(fā)和應(yīng)用更加安全、有效和環(huán)保的新銅源來滿足動(dòng)物對(duì)銅的營養(yǎng)需要，已成為當(dāng)今飼料行業(yè)的必然趨勢。2019年4月，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第162號(hào)公告，批準(zhǔn)檸檬酸銅作為新型有機(jī)銅源在斷奶仔豬飼糧中使用。研究表明，斷奶仔豬飼糧中添加低劑量(20或30 mg/kg)檸檬酸銅形式的銅，不但可以促進(jìn)仔豬生長，而且可以提高免疫力，進(jìn)而降低腹瀉率和死亡率[5-6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中，與硫酸銅或堿式氯化銅相比，檸檬酸銅更能發(fā)揮營養(yǎng)性和功能性的作用，這可能與其生物學(xué)利用率有關(guān)[7]。然而，關(guān)于斷奶仔豬對(duì)檸檬酸銅的生物學(xué)利用率研究尚未見相關(guān)報(bào)道。生物學(xué)利用率又稱之為生物學(xué)效價(jià)，評(píng)定微量元素生物學(xué)利用率的方法主要有平衡試驗(yàn)法、放射性同位素法和斜率比法，其中前2種方法因成本高、設(shè)備貴等原因沒有得到廣泛應(yīng)用，而斜率比法操作比較簡單，對(duì)試驗(yàn)器材要求不高，是目前評(píng)定微量元素生物學(xué)利用率的常用方法[8-9]。因此，本試驗(yàn)通過研究不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬生長性能、血清銅含量與含銅酶活性以及組織銅含量的影響，探討堿式氯化銅和檸檬酸銅的相對(duì)生物學(xué)利用率，為新型銅源在仔豬生產(chǎn)中的科學(xué)選擇和合理應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)銅源

試驗(yàn)采用的3種銅源——硫酸銅(五水硫酸銅，飼料級(jí)，Cu2+含量實(shí)測值為25.0%)、堿式氯化銅(飼料級(jí)，Cu2+含量實(shí)測值為58.0%)和檸檬酸銅(飼料級(jí)，Cu2+含量實(shí)測值為35.0%)，均由四川省某飼料有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用3×2雙因子隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)(銅源分別為硫酸銅、堿式氯化銅和檸檬酸銅；銅添加水平分別為20和30 mg/kg)，另設(shè)1個(gè)不額外添加銅源的對(duì)照組。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與管理

試驗(yàn)在西南大學(xué)科教實(shí)訓(xùn)基地進(jìn)行。選取平均體重(8.98±0.48) kg的杜×長×大三元雜交斷奶仔豬112頭，隨機(jī)分為7組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬，以重復(fù)為單位分欄。試驗(yàn)前，對(duì)豬舍進(jìn)行徹底清掃和消毒。試驗(yàn)期間，人工喂料和清糞，每天06:00、11:00和17:00各飼喂1次，仔豬自由采食、飲水。試驗(yàn)豬舍執(zhí)行常規(guī)免疫程序，嚴(yán)格控制溫濕度，保持舍內(nèi)通風(fēng)換氣。試驗(yàn)預(yù)試期3 d，正試期28 d。

1.4 試驗(yàn)飼糧

參照NRC(2012)和《中國飼料成分及營養(yǎng)價(jià)值表(2021年第32版)》配制玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.5 樣品采集與處理

1.5.1 血樣采集與處理

試驗(yàn)第28天，從每個(gè)組隨機(jī)選取8頭豬，前腔靜脈采血10 mL，在室溫下靜置0.5 h，2 000 r/min離心10 min，制備血清，于-20 ℃冷凍保存，待測。

1.5.2 組織采集與處理

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2頭健康仔豬，放血屠宰后立即分離出心臟、肝臟、胰臟、腎臟和跖骨。取心臟、肝臟、胰臟和腎臟樣品各2～3 g，在65 ℃烘至恒重，經(jīng)室溫回潮24 h后用研缽碾碎，備測。先用去離子水加熱煮沸跖骨，然后剔除跖骨外層附著的肌肉和結(jié)締組織，再用去離子水沖洗干凈，于550 ℃灰化至恒重，最后取樣約1 g，備測。

1.6 測定指標(biāo)與方法

1.6.1 生長性能

試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)，分別對(duì)每頭仔豬進(jìn)行空腹稱重，計(jì)算每頭仔豬的平均日增重(ADG)。試驗(yàn)期內(nèi)，以重復(fù)為單位，記錄總投料量和總余料量，計(jì)算每頭仔豬的平均日采食量(ADFI)。根據(jù)每頭仔豬的ADG和ADFI計(jì)算料重比(F/G)。

1.6.2 血清含銅酶活性

利用紫外-可見光分光光度計(jì)(Uvikon XS，Secomen，法國)，采用比色法測定血清中銅藍(lán)蛋白(CP)和銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)活性。測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6.3 血清和組織銅含量

利用原子吸收光譜儀(240FS，安捷倫，美國)，按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中銅的測定》(GB 5009.13—2017)中第二法火焰原子吸收光譜法，測定血清、心臟、肝臟、胰臟、腎臟和跖骨中銅含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010處理后，利用SAS 9.4軟件中的GLM程序進(jìn)行雙因素方差分析，差異顯著時(shí)采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，且以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。建立多元線性回歸方程：Y=a0+a1X1+a2X2+a3X3(Y為所測指標(biāo)，a0為截距，X1、X2和X3分別為硫酸銅、堿式氯化銅和檸檬酸銅形式的銅添加水平)，以硫酸銅的生物學(xué)利用率為100%，根據(jù)斜率比法計(jì)算堿式氯化銅和檸檬酸銅相對(duì)于硫酸銅的生物學(xué)利用率，計(jì)算方法分別為(a2/a1)×100和(a3/a1)×100[10]。

2 結(jié) 果

2.1 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，飼糧銅源、銅添加水平及其交互作用對(duì)斷奶仔豬ADG、ADFI和F/G均無顯著影響(P>0.05)。檸檬酸銅組斷奶仔豬末重、ADG和ADFI最高，料重比最低；30 mg/kg銅添加水平組斷奶仔豬末重、ADG和ADFI最高，料重比最低，但與其他組差異均不顯著(P>0.05)。

表2 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響Table 2 Effects of different Cu sources and Cu supplemental levels on growth performance of weanling piglets

續(xù)表2銅源或銅添加水平CusourceorCusupplementallevel始重Initialweight/kg末重Finalweight/kg平均日增重ADG/kg平均日采食量ADFI/kg料重比F/G銅添加水平Cusupplementallevel/(mg/kg)08.972±0.01020.284±4.0150.404±0.0810.752±0.0241.861±0.114208.969±0.01320.645±3.0100.417±0.0790.761±0.0531.825±0.066308.982±0.01221.572±2.9170.450±0.0690.778±0.0601.729±0.059P值P-value銅源Cusource0.9960.4230.3710.5430.552銅添加水平Cusupplementallevel0.9900.3650.3660.5420.833銅源×銅添加水平Cusource×Cusupplementallevel0.9720.9460.5930.8630.954

2.2 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬血清銅含量與含銅酶活性的影響

由表3可知，飼糧銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬血清銅含量具有顯著影響(P<0.05)，而對(duì)血清CP和Cu/Zn-SOD活性均無顯著影響(P>0.05)；飼糧銅源和銅添加水平的交互作用對(duì)斷奶仔豬血清銅含量與含銅酶活性均無顯著影響(P>0.05)。根據(jù)血清銅含量與飼糧銅添加水平建立的多元線性回歸方程為：Y=0.215+0.077X1+0.085X2+0.093X3(R2=0.326，P=0.016)。式中，Y為血清銅含量；X1、X2和X3分別為飼糧中硫酸銅、堿式氯化銅和檸檬酸銅形式的銅添加水平。以斷奶仔豬對(duì)硫酸銅的生物學(xué)利用率為100%，則斷奶仔豬對(duì)堿式氯化銅和檸檬酸銅的相對(duì)生物學(xué)利用率分別為110.39%和120.78%。

表3 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬血清銅含量與含銅酶活性的影響Table 3 Effects of different Cu sources and Cu supplemental levels on serum Cu content and Cu-containing enzyme activities of weanling piglets

續(xù)表3銅源或銅添加水平CusourceorCusupplementallevel銅Cu/(mg/L)銅藍(lán)蛋白CP/(U/L)銅鋅超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD/(U/mL)P值P-value銅源Cusource0.0350.8870.142銅添加水平Cusupplementallevel0.0160.3650.500銅源×銅添加水平Cusource×Cusupplementallevel0.7600.8100.566

2.3 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬組織銅含量的影響

由表4可知，飼糧銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬肝臟銅含量具有顯著影響(P<0.05)，而對(duì)心臟、腎臟、胰臟和跖骨銅含量均無顯著影響(P>0.05)；飼糧銅源和銅添加水平的交互作用對(duì)斷奶仔豬組織銅含量無顯著影響(P>0.05)。根據(jù)肝臟銅含量與飼糧銅添加水平建立的多元線性回歸方程為：Y=5.415+0.593X1+0.708X2+0.807X3(R2=0.465，P=0.013)。式中，Y為肝臟銅含量；X1、X2和X3分別為飼糧中硫酸銅、堿式氯化銅和檸檬酸銅形式的銅添加水平。以斷奶仔豬對(duì)硫酸銅的生物學(xué)利用率為100%，則斷奶仔豬對(duì)堿式氯化銅和檸檬酸銅的相對(duì)生物學(xué)利用率分別為119.39%和136.09%。

表4 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬組織銅含量的影響Table 4 Effects of different Cu sources and Cu supplemental levels on tissue Cu content of weanling piglets mg/kg

3 討 論

3.1 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬生長性能的影響

銅作為動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一，對(duì)保證斷奶仔豬健康生長具有極其重要的作用。實(shí)際生產(chǎn)中，缺銅容易導(dǎo)致仔豬產(chǎn)生共濟(jì)失調(diào)、關(guān)節(jié)腫脹、骨質(zhì)脆弱以及營養(yǎng)性貧血等癥狀，進(jìn)而影響其生長速度[11-12]。研究證明，飼糧中額外添加125～250 mg/kg硫酸銅(以銅計(jì)，后同)能顯著提高仔豬的生長性能[13-14]。然而，高銅的使用雖然對(duì)促進(jìn)仔豬生長和提高飼料利用率有效，但長期添加會(huì)危害機(jī)體健康、降低動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)，還會(huì)造成銅源浪費(fèi)，以及帶來養(yǎng)殖環(huán)境污染等安全隱患[15-17]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的第2625號(hào)公告《飼料添加劑安全使用規(guī)范》規(guī)定，仔豬(體重≤25 kg)配合飼料中銅的最高限量(包含飼料原料本底值)為125 mg/kg。因而，在實(shí)現(xiàn)滿足仔豬營養(yǎng)需要、改善飼料品質(zhì)等預(yù)期目標(biāo)的前提下，要減少飼糧中銅的用量。研究證實(shí)，低水平的有機(jī)銅完全可以滿足仔豬對(duì)銅的營養(yǎng)需要，并且不會(huì)影響其生長性能[18-19]。Armstrong等[20]研究結(jié)果表明，仔豬飼糧中添加33、66或100 mg/kg檸檬酸銅與添加225 mg/kg硫酸銅具有同等促生長效果。Peng等[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中只需添加30 mg/kg檸檬酸銅就可以促進(jìn)斷奶仔豬生長。Yan等[6]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加20 mg/kg檸檬酸銅與添加180 mg/kg硫酸銅相比，斷奶仔豬的生長性能無顯著差異。上述研究結(jié)果提示，以檸檬酸銅為銅源，飼糧中補(bǔ)充較低水平的銅即可滿足仔豬的生長需要。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加20或30 mg/kg硫酸銅、堿式氯化銅或檸檬酸銅，仔豬的ADG、ADFI和F/G均無顯著差異，分析其原因可能是受銅的化學(xué)結(jié)構(gòu)、飼糧中銅含量和豬的生長階段等因素影響所致。因此，本試驗(yàn)中生長性能指標(biāo)不適用于評(píng)價(jià)斷奶仔豬對(duì)不同銅源的生物學(xué)利用率。

3.2 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬血清銅含量與含銅酶活性的影響

3.2.1 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬血清銅含量的影響

銅經(jīng)過小腸吸收后進(jìn)入血液，而血清中的銅含量可以反映其吸收率和利用率[21-22]。Pastorelli等[23]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加150 mg/kg硫酸銅可以提高斷奶仔豬血清中的銅含量。Armstrong等[24]研究指出，斷奶仔豬飼糧中添加15～125 mg/kg檸檬酸銅與添加250 mg/kg硫酸銅相比，血清銅含量差異并不顯著。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬血清銅含量具有顯著影響；通過多元線性回歸方程計(jì)算得出：以血清銅含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，堿式氯化銅和檸檬酸銅相對(duì)于硫酸銅(100%)的生物學(xué)利用率分別為119.39%和136.09%，說明斷奶仔豬對(duì)檸檬酸銅的生物學(xué)利用率高于硫酸銅和堿式氯化銅。

3.2.2 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬血清含銅酶活性的影響

CP和Cu/Zn-SOD是動(dòng)物體內(nèi)主要的含銅酶，對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[25]。血液中的銅主要分布于血漿和紅細(xì)胞中，結(jié)合成CP的形式存在[26]。CP具有氧化酶的活性，能催化氧化多酚及多胺；同時(shí)CP還具有抗氧化的作用，可以防止組織中脂質(zhì)過氧化物和自由基的生成[27-28]。Cu/Zn-SOD是一種抗氧化金屬酶，能清除超氧陰離子自由基，防止自由基破壞細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加20或30 mg/kg硫酸銅、堿式氯化銅或檸檬酸銅對(duì)斷奶仔豬血清CP和Cu/Zn-SOD活性均沒有顯著影響。本試驗(yàn)結(jié)果與Peng等[5]的研究結(jié)果一致，這可能是由于血清中作為CP和Cu/Zn-SOD活性中心的銅離子已經(jīng)接近飽和，因而在不同銅源和銅添加水平組沒有表現(xiàn)出明顯差異。

3.3 不同銅源和銅添加水平對(duì)斷奶仔豬組織銅含量的影響

銅在動(dòng)物體內(nèi)的分布十分廣泛，血液中的銅經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)輸后到達(dá)機(jī)體各組織器官。本研究表明，仔豬體內(nèi)肝臟中銅的含量最高，其次為腎臟和心臟，而胰臟和跖骨中銅的含量較低。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物吸收的銅大部分貯存于肝臟，并且肝臟中的銅含量與飼糧中銅的添加形式和添加水平密切相關(guān)[31-32]。因此，肝臟銅含量常作為評(píng)價(jià)動(dòng)物對(duì)不同銅源生物學(xué)利用率的敏感指標(biāo)。目前，關(guān)于仔豬對(duì)不同銅源生物學(xué)利用率方面的研究較少。VanValin等[33]在牛上的研究結(jié)果表明，以肝臟銅含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，堿式氯化銅和賴氨酸銅相對(duì)于硫酸銅(100%)的生物學(xué)利用率分別為112%和103%。吳學(xué)壯等[34]以肝臟銅含量為敏感指標(biāo)評(píng)價(jià)肉雞對(duì)不同銅源的相對(duì)生物學(xué)利用率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿式氯化銅和蛋氨酸銅相對(duì)于硫酸銅(100%)的生物學(xué)利用率分別為127.61%和137.64%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，斷奶仔豬肝臟銅含量與飼糧銅添加水平之間存在顯著的線性回歸關(guān)系，采用肝臟銅含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，堿式氯化銅和檸檬酸銅相對(duì)于硫酸銅(100%)的生物學(xué)利用率分別為119.39%和136.09%。本試驗(yàn)結(jié)果與VanValin等[33]和吳學(xué)壯等[34]的研究結(jié)果相似，提示斷奶仔豬對(duì)檸檬酸銅和堿式氯化銅的生物學(xué)利用率高于硫酸銅。但是，Liu等[35]以肝臟銅含量和膽汁銅含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)肉雞對(duì)有機(jī)銅和無機(jī)銅的生物學(xué)利用率沒有顯著差異，究其原因可能是因?yàn)闄C(jī)體對(duì)有機(jī)銅和無機(jī)銅的吸收方式存在差異。動(dòng)物消化道對(duì)銅的吸收是機(jī)體利用銅的前提，因此，有必要進(jìn)一步研究不同銅源在動(dòng)物消化道中的吸收規(guī)律及其作用機(jī)制。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，斷奶仔豬對(duì)低銅飼糧(銅添加水平為20或30 mg/kg)中3種銅源的相對(duì)生物學(xué)利用率表現(xiàn)為檸檬酸銅>堿式氯化銅>硫酸銅。