李華嫻，韓佩君，劉 勇，王文嵐

(空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天衛(wèi)生學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

隨著我國航天事業(yè)的飛速發(fā)展，航天員在空間站工作的時(shí)間越來越長，在航天多種特殊環(huán)境中，失重一直是研究者們最為重視的一種環(huán)境。有研究表明，在航天失重環(huán)境中，人體的免疫力會(huì)有所下降，使航天員的身體對(duì)抗各種致病微生物的能力下降[1]。同時(shí)，長期寄居于人體的正常菌群及條件致病菌在航天特殊環(huán)境中也同樣會(huì)受到失重環(huán)境的影響。在航天飛行期間，這些細(xì)菌可以在失重條件下發(fā)生毒力、耐藥性變化等，導(dǎo)致其致病性增強(qiáng)[2-3]，從而使航天員患感染性疾病的可能性增加，也可對(duì)航天環(huán)境中的空氣、水、食品安全性造成威脅。

大腸埃希菌是寄居于人體腸道內(nèi)最常見的條件致病菌，在一定條件下可以引起胃腸道、泌尿道等多種局部組織器官感染，對(duì)人體健康具有潛在的威脅。既往研究表明，在模擬航天失重環(huán)境下，大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯菌等的基因表達(dá)可發(fā)生相應(yīng)的變化，如在模擬失重條件下培養(yǎng)大腸埃希菌K12后，統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)了16個(gè)上調(diào)基因和19個(gè)下調(diào)基因[4]；與正常重力組相比，在模擬失重環(huán)境下培養(yǎng)肺炎克雷伯菌14 d，共有171個(gè)基因表達(dá)失調(diào)，包括負(fù)責(zé)3型纖維體及其調(diào)節(jié)因子的基因，可導(dǎo)致其生物膜形成能力增強(qiáng)[5]；一項(xiàng)研究證實(shí)，模擬失重誘導(dǎo)了鼠傷寒沙門氏菌163個(gè)基因差異表達(dá)，包括10個(gè)Ⅲ型分泌系統(tǒng)毒力基因(表達(dá)下調(diào))，以及其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑、毒力因子、脂多糖生物合成酶、鐵酶利用和功能未知蛋白質(zhì)的表達(dá)差異[6]。寄生于人體內(nèi)的大腸埃希菌長時(shí)間受到模擬失重環(huán)境的影響，會(huì)引起其基因表達(dá)變化，從而導(dǎo)致生物學(xué)性狀和毒力改變[7-8]，繼而影響航天員健康和航天器環(huán)境生物安全。因此，研究模擬失重環(huán)境下大腸埃希菌基因表達(dá)的變化及其與生物學(xué)性狀變化間的聯(lián)系，可為航天員的身體健康提供保障，為未來的航天生物安全防護(hù)打好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 大腸埃希菌(CICC 10389)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑 胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、RNA保存液、Total RNA Extractor 購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Qubit 2.0 RNA檢測(cè)試劑盒、Qubit RNA檢測(cè)試劑盒、Qubit DNA檢測(cè)試劑盒購自美國Life Technologies公司；Ribo-off rRNA Depletion kit(bacteria)、VAHTSTMStranded mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina?、VAHTSTMDNA Clean Beads購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.1.3 儀器 Gravite重力控制系統(tǒng)(日本Space Bio Laboratories公司)；恒溫培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司)；恒溫振蕩器(蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海銥晶科技有限公司)；生物安全柜(美國Nuaire公司)；生物安全型離心機(jī)(美國Bio-Rad公司)；Qubit 2.0熒光計(jì)、Qubit熒光計(jì)(美國Invitrogen公司)；微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)；電泳儀(北京市六一儀器廠)；生物電泳圖像分析(上海復(fù)日科技有限公司)；微量分光光度計(jì)[美林恒通(北京)儀器有限公司]；PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配置 溶菌肉湯(Luria-Bertani，LB)液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，溶解在1 L雙蒸水中，121 ℃高壓滅菌30 min后，于4 ℃保存。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，溶解在1 L雙蒸水中，121 ℃高壓滅菌30 min后，將液體倒入細(xì)菌培養(yǎng)皿中，凝固后放至4 ℃保存。

1.2.2 大腸埃希菌培養(yǎng) 為明確模擬失重條件對(duì)大腸埃希菌基因的影響，把大腸埃希菌分為兩組(正常重力組和模擬失重組)進(jìn)行比較。先將保存的單克隆甘油菌種接種到LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后，挑取單克隆菌落接種在裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的搖菌管中，37 ℃、200 r/min，過夜活化。將活化的菌液按體積比1∶500接種于裝滿新鮮LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中(體積約73 mL)，排空氣泡。模擬失重組將接種好細(xì)菌的培養(yǎng)瓶放置在Gravite重力控制系統(tǒng)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，2 r/min，37 ℃；正常重力組將接種好細(xì)菌的培養(yǎng)瓶放置在恒溫振蕩器中，水平振蕩培養(yǎng)，2 r/min，37 ℃。每24 h按體積比1∶500接種于裝滿新鮮LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代，連續(xù)培養(yǎng)14 d。

1.2.3 RNA提取及質(zhì)檢 運(yùn)用Total RNA Extractor試劑盒，將裂解后樣品或勻漿液室溫放置5～10 min，使得核蛋白與核酸完全分離。加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。12 000 r/min 4 ℃離心10 min。吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20 min。12 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清。加入1 mL乙醇(750 mL/L)洗滌沉淀。12 000 r/min 4 ℃離心3 min，棄上清。室溫干燥5～10 min。加入30～50 μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。將所得到的RNA溶液置于-70 ℃保存或立刻用于后續(xù)試驗(yàn)。用Qubit 2.0檢測(cè)RNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA完整性以及基因組污染情況。質(zhì)檢結(jié)果顯示樣本質(zhì)量均基本滿足建庫測(cè)序質(zhì)量要求。

1.2.4 原核RNA轉(zhuǎn)錄組建庫 該部分委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。具體步驟參照實(shí)驗(yàn)說明書。

1.2.5 基因表達(dá)差異分析 采用TMM對(duì)read count數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，之后運(yùn)用DEGseq進(jìn)行差異分析，為了得到顯著差異的基因，我們將篩選條件設(shè)為：P≤0.05且|log2(Fold Change)|≥1。

1.2.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO和KEGG富集分析 借助GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫，使用clusterProfiler進(jìn)行功能富集分析，P<0.05表示該功能存在顯著富集情況。

2 結(jié)果

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)正常重力和模擬失重兩組間差異基因及相應(yīng)通路進(jìn)行分析，具體分析步驟參照文獻(xiàn)[9-30]進(jìn)行。

2.1 基因表達(dá)差異分析

研究發(fā)現(xiàn)，在模擬失重環(huán)境下培養(yǎng)大腸埃希菌14 d后，共檢測(cè)到229個(gè)表達(dá)差異顯著的基因，其中158個(gè)基因上調(diào)，71個(gè)基因下調(diào)(圖1)。上調(diào)基因主要包括參與一些嘌呤嘧啶核苷酸的水解及轉(zhuǎn)運(yùn)等代謝相關(guān)基因(如rihA、xanQ、ghxQ)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(如ycaN、allS、feaR、caiF、gadE、dctR、rhaR)、主要構(gòu)成1型菌毛的相關(guān)基因(如fimG、fimH、fimA、fimB)和一些功能未知的蛋白(如yoaL、fxsA、ymcE、ybfB、ytiA、dsrB、yliM)等。下調(diào)基因主要包括參與一些氨基酸合成及水解等代謝相關(guān)基因(如asnA、ansB、tnaA、asnB)、RNA聚合酶sigma因子(fecI)和生物膜形成調(diào)節(jié)因子(bssR)等。

2.2 GO基因富集分析結(jié)果

經(jīng)過GO功能注釋分析(圖2)發(fā)現(xiàn)，差異基因在基因的分子功能方面主要集中在分子轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化、酶調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄因子活性等；在所處的細(xì)胞位置方面主要集中在細(xì)胞膜、細(xì)胞器、含蛋白質(zhì)分子混合物等；在參與的生物過程方面主要集中在對(duì)刺激的反應(yīng)、細(xì)胞殺傷、生化代謝等。

GO基因富集分析結(jié)果顯示，差異基因富集到3個(gè)大類中的14個(gè)小類：包括生物過程類6條通路(天冬酰胺、2-氨基-3-氨基甲?；岬纳锖铣桑话被岬腘-三甲基衍生物的生物合成；精氨酸的生物合成；陽離子通過膜運(yùn)輸?shù)倪^程；甘油跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程；L-氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程)、分子功能類5條通路(外膜界周質(zhì)間隙的合成代謝；烷基過氧化氫還原酶復(fù)合物的合成代謝；質(zhì)膜的合成代謝；菌毛的合成代謝；鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶復(fù)合物)、細(xì)胞組分類3條通路(陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的代謝；羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的代謝；同轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的代謝)。

2.3 KEGG基因富集分析結(jié)果

KEGG分析差異基因表達(dá)顯示，229個(gè)差異基因中有69個(gè)基因(47個(gè)基因上調(diào)，22個(gè)基因下調(diào))富集于68條通路，且大部分為代謝相關(guān)通路，主要以上調(diào)基因的富集通路為主，包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等氨基酸代謝(圖3)，果糖和甘露糖等糖類代謝，甲烷、硫、核黃素等代謝，嘌呤、嘧啶代謝，卟啉與葉綠素、抗壞血酸和醛酸代謝，丙酸、丁酸代謝，以及一些化合物的生物合成與降解。

圖1 兩組間表達(dá)差異火山圖

圖2 差異基因GO注釋分類柱狀圖

圖3 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等氨基酸代謝通路圖

3 討論

本研究在模擬失重條件下對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)14 d后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果顯示，模擬失重導(dǎo)致大腸埃希菌基因表達(dá)差異，共有229個(gè)表達(dá)差異顯著基因(158個(gè)基因上調(diào)，71個(gè)基因下調(diào))。KEGG富集通路結(jié)果顯示，229個(gè)差異基因中共有69個(gè)基因(47個(gè)基因上調(diào)，22個(gè)基因下調(diào))能匹配到已知的通路中，這些基因共富集于68條通路，其中52條通路為代謝相關(guān)通路，且主要以上調(diào)基因的富集通路為主。

過往研究表明，在模擬失重條件下用含有甘油的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，大腸埃希菌K12共發(fā)現(xiàn)100個(gè)差異基因(53個(gè)基因上調(diào)，47個(gè)基因下調(diào))；KEGG分析結(jié)果顯示，共有15個(gè)差異基因富集到16條不同通路[31]。同時(shí)有研究表明，大腸埃希菌K12在模擬失重條件連續(xù)傳代培養(yǎng)兩周后出現(xiàn)基因差異，共有142個(gè)基因差異表達(dá)，其中58個(gè)基因上調(diào)(包括一些耐藥基因和核苷酸代謝基因)，84個(gè)基因下調(diào)；KEGG分析結(jié)果顯示共有43個(gè)差異基因富集在49條通路中[7]。

這些研究結(jié)果均表明，大腸埃希菌在受到模擬失重條件的影響后，會(huì)發(fā)生基因改變，同時(shí)在基因分析中發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因包括一些參與核苷酸代謝的基因，這與我們的研究結(jié)果一致。但所有差異基因及其所富集的通路仍有不同，考慮應(yīng)為菌株及培養(yǎng)條件不同所致。

在之前的研究中對(duì)培養(yǎng)14 d后的大腸埃希菌進(jìn)行生化代謝檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)模擬失重條件培養(yǎng)后的大腸埃希菌對(duì)絲氨酸、丙氨酸和天冬氨酸的利用增加，與該研究中KEGG分析結(jié)果所發(fā)現(xiàn)的差異基因富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路中相符合。

本研究明確了大腸埃希菌在模擬失重條件下培養(yǎng)后出現(xiàn)的差異基因及其所富集的相關(guān)通路，下一步我們將在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證在模擬失重條件下大腸埃希菌在動(dòng)物體內(nèi)的毒力變化，同時(shí)篩選出與代謝、生物學(xué)性狀、耐藥和細(xì)菌毒力密切相關(guān)的差異基因，并根據(jù)其所富集的相關(guān)通路，研究其發(fā)生相關(guān)表型變化的具體機(jī)制，為空間站內(nèi)的環(huán)境消殺提供基礎(chǔ)，并為航天員的身體健康提供有力的保障。