張 帥，李少華，師啟鑫，呂 強(qiáng)，白云剛，程九華，馬 進(jìn)

(空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

近年來(lái)，從平原地區(qū)進(jìn)入高原地區(qū)的人員越來(lái)越多，高原特殊環(huán)境所致健康問(wèn)題頻發(fā)，涉及多種疾病類(lèi)別，以呼吸系統(tǒng)疾病和消化系統(tǒng)疾病最為高發(fā)[1]，其中高原肺動(dòng)脈高壓(high-altitude pulmonary hypertension，HAPH)是最嚴(yán)重的疾病之一[2]。HAPH是一種慢性進(jìn)展性疾病，主要特征是持續(xù)和顯著增高的肺動(dòng)脈壓力，并可導(dǎo)致右心肥厚及右心功能不全[3]，最終可能引起左心結(jié)構(gòu)改變[4-5]，然而目前針對(duì)HAPH的預(yù)防和治療效果尚不盡人意。對(duì)抗缺氧最有效的手段是供氧。在航空醫(yī)學(xué)中，根據(jù)生理等效高度的原則進(jìn)行供氧是對(duì)抗高空缺氧的主要方式。例如在5 000 m高度時(shí)，當(dāng)吸入的O2濃度約為420 mL/L時(shí)，人體的生理等效高度為海平面(0 m)，此時(shí)機(jī)體不會(huì)發(fā)生缺氧。然而在高原地區(qū)，每日持續(xù)24 h供氧在現(xiàn)行條件下是不現(xiàn)實(shí)的。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)每日1 h恢復(fù)大鼠正常體位可有效預(yù)防模擬失重所致部分動(dòng)脈功能與結(jié)構(gòu)的區(qū)域特異性改變[6]。受此啟發(fā)，我們提出了每日間斷短時(shí)供氧可以有效緩解HAPH的發(fā)生發(fā)展，且發(fā)現(xiàn)不同供氧頻次對(duì)防護(hù)效果影響較大，在已觀察的方案中發(fā)現(xiàn)，供氧時(shí)長(zhǎng)1 h，供氧生理等效高度為海平面的每日3次供氧防護(hù)效果較佳[7]。但不同供氧時(shí)長(zhǎng)或供氧高度會(huì)影響機(jī)體氧合狀態(tài)，可能影響間斷短時(shí)防護(hù)的效果。為取得更佳的防護(hù)效果與效益，我們比較了不同供氧時(shí)長(zhǎng)與供氧高度下間斷短時(shí)供氧對(duì)慢性缺氧所致大鼠肺動(dòng)脈高壓的防護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性成年SD大鼠(67周齡)由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始正式分組實(shí)驗(yàn)。小動(dòng)物低壓艙群由空軍軍醫(yī)大學(xué)研制，該艙群不僅能滿足動(dòng)物在低壓環(huán)境下生活的基本生命保障，還能根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求對(duì)各獨(dú)立艙設(shè)定氣體成分，且能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)其組分變化。

T-PER、BCA蛋白分析試劑盒為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；臺(tái)式研磨機(jī)為中國(guó)上海凈信公司產(chǎn)品；FLUO Star Omega多功能酶標(biāo)儀為德國(guó)BMG LABTECH公司產(chǎn)品。FisherbrandTM微量紅細(xì)胞比容(hematocrit, HCT)毛細(xì)管為上海懋康生物科技有限公司產(chǎn)品。丙二醛(malondialdehyde, MDA)測(cè)定試劑盒為中國(guó)南京建成生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Powerlab生理記錄系統(tǒng)為澳大利亞ADI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與設(shè)計(jì) 健康雄性SD大鼠48只，按隨機(jī)原則分為6組。①對(duì)照組(CON組)：實(shí)驗(yàn)全程生活在地面正常環(huán)境；②慢性缺氧組(H組)：大鼠通過(guò)動(dòng)物低壓艙全程生活在5 000 m低氣壓環(huán)境中；③間斷短時(shí)供氧組：分為I15、I10、I5、I3K 4個(gè)亞組，4組大鼠亦全程生活在5 000 m低氣壓環(huán)境中，但其中I15、I10、I5組每日間斷短時(shí)供氧3次，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間分別為1.5、1.0、0.5 h，供氧生理等效高度為地面高度；而I3K組大鼠單次供氧時(shí)間為1.0 h，供氧生理等效高度為3 000 m(通過(guò)小動(dòng)物低壓艙群將供氧高度調(diào)至3 000 m)。

2周后，比較大鼠體質(zhì)量，檢測(cè)大鼠HCT、心臟質(zhì)量、左心質(zhì)量、右心室收縮壓、右心室肥厚指數(shù)、肺含水量等指標(biāo)，同時(shí)檢測(cè)血清與肺組織中MDA含量。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立 CON組全程生活在地面正常環(huán)境，H組和I15、I10、I5、I3K組大鼠通過(guò)動(dòng)物低壓艙生活在5 000 m低氣壓環(huán)境中。每3 d稱(chēng)大鼠體質(zhì)量、補(bǔ)充食水及更換墊料。低壓艙一直保持適當(dāng)通氣量以保證艙內(nèi)良好的氣體環(huán)境，同時(shí)低壓艙內(nèi)放有鈉石灰、變色硅膠以吸收水分、CO2以及氨氣等，提升艙內(nèi)空氣質(zhì)量。每次開(kāi)艙時(shí)均以10 m/s速度上升或下降。

1.2.3 右心室收縮壓測(cè)量 通過(guò)Powerlab生理信號(hào)記錄系統(tǒng)測(cè)量，采用右心導(dǎo)管連接壓力傳感器，將整個(gè)液路充滿肝素后，通過(guò)右側(cè)頸靜脈插入大鼠右心室測(cè)得右心室收縮壓，間接反映肺動(dòng)脈壓力(單位mmHg)。

1.2.4 心臟質(zhì)量及右心肥厚指數(shù)測(cè)量 處死大鼠后收集心臟標(biāo)本，將心房及大動(dòng)脈根部去除后，吸干表面的液體后稱(chēng)得濕質(zhì)量，與體質(zhì)量相比記為心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值；剪下右心室，剪開(kāi)左心室，吸干表面的液體后稱(chēng)得濕質(zhì)量，左心室加室間隔的質(zhì)量與體質(zhì)量的比值記為左心質(zhì)量與體質(zhì)量比值，右心質(zhì)量與左心室加室間隔質(zhì)量的比值即為右心肥厚指數(shù)。

1.2.5 HCT測(cè)定 取抗凝全血，充入一次性毛細(xì)玻管(管長(zhǎng)75 mm，內(nèi)徑0.8～1.0 mm，壁厚0.20～0.25 mm，每支含肝素2 U)的2/3(50 mm)處，封口后，用離心機(jī)以12 000 r/min離心5 min，用專(zhuān)用讀數(shù)板，讀取紅細(xì)胞層和全層長(zhǎng)度，相除得HCT值。

1.2.6 血清及肺組織MDA含量測(cè)定 從大鼠腹主動(dòng)脈抽血并加到有抗凝劑的玻璃管中混勻，靜置5 min后離心，離心速度為4 000 r/min，時(shí)間為10 min，取上層血清。稱(chēng)取大鼠肺組織后，每1 mg組織加入20 μL T-PER裂解液，于研磨儀中65 Hz研磨 90 s；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清即為樣品液。BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度。使用南京建成MDA檢測(cè)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀讀取A532 nm值，根據(jù)公式計(jì)算血清及肺中MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量變化

CON組大鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均勻持續(xù)增長(zhǎng)，其余各組在缺氧初期均出現(xiàn)體質(zhì)量下降，隨后恢復(fù)增長(zhǎng)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(14 d)，體質(zhì)量仍然均明顯低于CON組(P<0.01)。其中I15組大鼠體質(zhì)量雖然低于CON組大鼠，但明顯高于其他間斷短時(shí)供氧組(P<0.05，圖1)。

CON組：對(duì)照組；H組：慢性缺氧組；I15、I10、I5組：每日間斷短時(shí)供氧3次，供氧高度為地面高度，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間分別為1.5、1.0、0.5 h；I3K組：每日間斷短時(shí)供氧3次，供氧高度為3 000 m生理等效高度，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間為1.0 h。n=8。 aP<0.05 vs I15組14 d， bP<0.01 vs CON組14 d。

2.2 各組大鼠HCT、肺含水量的比較

CON組大鼠HCT水平明顯低于H組(P<0.01)，各供氧組大鼠HCT明顯高于CON組(P<0.01)，但明顯低于H組(P<0.05)，各供氧組間無(wú)明顯差異(圖2A)。各組間大鼠肺含水量無(wú)明顯差異(圖2B)。

A：HCT；B：肺含水量。HCT:血細(xì)胞比容；CON組：對(duì)照組；H組：慢性缺氧組；I15、I10、I5組：每日間斷短時(shí)供氧3次，供氧高度為地面高度，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間分別為1.5、1.0、0.5 h；I3K組：每日間斷短時(shí)供氧3次，供氧高度為3 000 m生理等效高度，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間為1.0 h。n=8。 aP<0.05 vs H組， bP<0.01 vs CON組。

2.3 各組大鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值及左心質(zhì)量與體質(zhì)量比值的比較

各組大鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值無(wú)明顯差異(圖3A)；各組大鼠左心質(zhì)量與體質(zhì)量比值亦無(wú)明顯差異(圖3B)。

A：心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值；B：左心質(zhì)量與體質(zhì)量比值。CON組：對(duì)照組；H組：慢性缺氧組；I15、I10、I5：每日間斷短時(shí)供氧3次，供氧高度為地面高度，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間分別為1.5、1.0、0.5 h；I3K組：每日間斷短時(shí)供氧3次，供氧高度為3 000 m生理等效高度，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間為1.0 h。n=8。

2.4 各組大鼠右心肥厚指數(shù)及右心室收縮壓的比較

CON組大鼠右心肥厚指數(shù)明顯低于其余各組(P<0.01)；H組大鼠右心肥厚指數(shù)明顯高于I10、I5組(P<0.05)，但與I15、I3K組間無(wú)明顯差異；I10、I5組間無(wú)明顯差異(圖4A)。

CON組大鼠右心室收縮壓明顯低于其余各組(P<0.01)；H組大鼠右心室收縮壓明顯高于I10、I5組(P<0.05)，而與I15、I3K組間無(wú)明顯差異；I10、I5組之間無(wú)明顯差異(圖4B)。

A：右心肥厚指數(shù)；B：右心室收縮壓。CON組：對(duì)照組；H：慢性缺氧組；I15、I10、I5組：每日間斷短時(shí)供氧3次，供氧高度為地面高度，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間分別為1.5、1、0.5 h；I3K組：每日間斷短時(shí)供氧3次，供氧高度為3 000 m生理等效高度，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間為1 h。n=8。 aP<0.05 vs H組，bP<0.01 vs CON組。

2.5 各組血清及肺組織MDA含量的比較

CON組大鼠血清MDA含量明顯低于其余各組(P<0.05)，H組大鼠血清MDA明顯低于各間斷短時(shí)供氧組(P<0.05)，在間斷短時(shí)供氧組中，I10、I5、I3K組血清MDA含量均明顯低于I15組(P<0.05，圖5A)。

CON組大鼠肺組織MDA含量明顯低于其余各組(P<0.05)，H組大鼠肺組織MDA明顯低于各間斷短時(shí)供氧組(P<0.05)；在各間斷短時(shí)供氧組中，I10、I5、I3K組肺組織MDA含量均明顯低于I15組(P<0.05，圖5B)。

A：血清MDA含量；B：肺組織MDA含量。MDA：丙二醛；CON組：對(duì)照組；H組：慢性缺氧組；I15、I10、I5組：每日間斷短時(shí)供氧3次，供氧高度為地面高度，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間分別為1.5、1.0、0.5 h；I3K組：每日間斷短時(shí)供氧3次，供氧高度為3 000 m生理等效高度，每次間隔均等時(shí)間，單次供氧時(shí)間為1.0 h。n=8。 aP<0.05 vs CON組， cP<0.05 vs H組， eP<0.05 vs I15組。

3 討論

本研究結(jié)果提示，間斷短時(shí)供氧可以有效防護(hù)低壓低氧大鼠肺動(dòng)脈高壓，這與我們前期工作結(jié)果及LIU等[8]報(bào)道的結(jié)果一致。在每日間斷短時(shí)供氧3次，在供氧高度為海平面的條件下，單次供氧1.0 h與0.5 h效果相同，而單次供氧時(shí)間提升至1.5 h反而降低了防護(hù)效果。當(dāng)我們想進(jìn)一步提升供氧效率，減少氧氣用量，在保持每日間斷短時(shí)供氧3次、單次1.0 h條件下，將供氧高度提升為生理等效高度3 000 m時(shí)，基本失去了防護(hù)效果。

有研究表明，氧化應(yīng)激在肺動(dòng)脈高壓的形成發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9-10]。MDA一般作為氧化應(yīng)激標(biāo)志物，含量越高表明氧化應(yīng)激水平越高[11]。從本研究中各組血清和肺組織MDA含量對(duì)比發(fā)現(xiàn)，提高單次供氧時(shí)間至1.5 h會(huì)提高血液和肺組織中MDA含量，即提升了氧化應(yīng)激水平，提示增加單次供氧時(shí)間導(dǎo)致防護(hù)水平下降可能與氧化應(yīng)激損傷升高有關(guān)。單次供氧時(shí)長(zhǎng)不變，增加供氧頻次同樣會(huì)增高氧化應(yīng)激水平，且導(dǎo)致防護(hù)水平下降[6]。間斷短時(shí)供氧在防護(hù)肺動(dòng)脈高壓的同時(shí)，可能會(huì)提高氧化應(yīng)激損傷，當(dāng)損傷程度高于防護(hù)效益時(shí)，間斷短時(shí)供氧可能就會(huì)失去防護(hù)效果，如何在間斷短時(shí)供氧過(guò)程中降低氧化應(yīng)激損傷，尚需進(jìn)一步工作闡明。

提升供氧高度并沒(méi)有提高氧化應(yīng)激水平，但沒(méi)有明顯防護(hù)效果的原因可能與復(fù)氧濃度不足、肺泡氧分壓升高不足有關(guān)，提示間斷短時(shí)供氧對(duì)大鼠低壓低氧肺動(dòng)脈高壓的防護(hù)濃度或肺泡氧分壓可能存在一定閾值，3 000 m生理等效高度尚不能達(dá)到該閾值。

體質(zhì)量生長(zhǎng)曲線表明，持續(xù)缺氧及間斷短時(shí)供氧均會(huì)導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量下降，表明低壓低氧可能是影響機(jī)體代謝的重要因素，這與LUO等[12]的研究結(jié)果一致。雖然延長(zhǎng)單次供氧時(shí)間會(huì)降低肺動(dòng)脈高壓防護(hù)效果，但較其他缺氧組而言，大鼠體質(zhì)量更高，反映出大鼠整體生長(zhǎng)情況較好。提示雖然提升單次供氧時(shí)間會(huì)使肺動(dòng)脈高壓的防護(hù)效果下降，但對(duì)其他系統(tǒng)的防護(hù)效果可能有益，可能存在機(jī)體不同組織或不同系統(tǒng)在應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境或復(fù)氧時(shí)的反應(yīng)不同，間斷短時(shí)供氧的防護(hù)作用可能存在系統(tǒng)差異性，這需要進(jìn)一步研究闡明。

大部分哺乳動(dòng)物通過(guò)增加HCT來(lái)應(yīng)對(duì)慢性低氧血癥[13]，HCT可反映缺氧環(huán)境下代償反應(yīng)程度。與以往工作結(jié)果相同，間斷短時(shí)供氧組與持續(xù)缺氧組相比，HCT降低[7]，即間斷短時(shí)供氧代償反應(yīng)較低。本研究中4種間斷供氧方案與持續(xù)缺氧相比HCT均降低，而4組間不存在明顯差異，從血液系統(tǒng)側(cè)面驗(yàn)證了間斷供氧的有效性，但供氧時(shí)間和高度對(duì)HCT的影響不大。

目前研究認(rèn)為，缺氧暴露會(huì)引發(fā)肺組織的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)、血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生異常，從而導(dǎo)致微血管床的過(guò)度灌注，使毛細(xì)血管靜水壓增高，發(fā)生毛細(xì)血管滲漏，水腫隨之發(fā)生[14]。而肺水腫在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[15]。在本研究中各組并不存在顯著的肺含水量差異，提示本次實(shí)驗(yàn)中肺動(dòng)脈壓升高的原因可能與毛細(xì)血管靜水壓增高無(wú)關(guān)。

心臟肥大是壓力過(guò)大或容量負(fù)荷過(guò)多的反應(yīng)，左心室質(zhì)量增加是左心室肥大的表現(xiàn)。慢性缺氧最終可能會(huì)導(dǎo)致左心質(zhì)量與體質(zhì)量比值和心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值高于海平面水平[16]。SHATI等[5]研究提到，缺氧對(duì)心肌結(jié)構(gòu)有很大影響，間斷短時(shí)供氧明顯降低了缺氧引起的心臟結(jié)構(gòu)的變化。本次實(shí)驗(yàn)中缺氧大鼠心臟質(zhì)量沒(méi)有差異可能是因?yàn)槿毖鯐r(shí)間及高度尚不能引起心臟質(zhì)量發(fā)生變化，提示低壓低氧環(huán)境下引起左心結(jié)構(gòu)的改變不同于右心，需要更長(zhǎng)的時(shí)間或更強(qiáng)的刺激。

綜上所述，本研究在保證對(duì)低壓低氧大鼠肺動(dòng)脈高壓防護(hù)效果不變的情況下，縮短了單次供氧的時(shí)間，提高了效率和實(shí)際操作的便捷性。證實(shí)了延長(zhǎng)單次供氧時(shí)間并不能提升低壓低氧大鼠肺動(dòng)脈高壓防護(hù)效果，但有可能有益于其他生理系統(tǒng)的防護(hù)與整體防護(hù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示過(guò)高的氧化應(yīng)激水平在間斷短時(shí)供氧防護(hù)肺動(dòng)脈高壓中可能發(fā)揮負(fù)面作用，欲進(jìn)一步提高間斷短時(shí)供氧對(duì)低壓低氧大鼠肺動(dòng)脈高壓防護(hù)效果，降低氧化應(yīng)激損傷可能是較為有效的方法之一。