譚 寧， 劉建湘， 亢 倩， 潘家莉， 韓一凡， 陳宏宇， 徐小元

北京大學(xué)第一醫(yī)院 消化內(nèi)科， 北京 100034

目前慢性乙型肝炎(CHB)患者的抗病毒治療藥物主要是干擾素α和核苷(酸)類似物(NUC)[1-2]。一部分CHB患者適合干擾素治療，這些患者中不到10%可以發(fā)生持續(xù)的HBsAg轉(zhuǎn)陰[3]。由于聚乙二醇干擾素α的不良反應(yīng)和禁忌證，還有一部分CHB患者接受長期的NUC抗病毒治療，只有很少的患者可以在長期抗病毒治療過程中達(dá)到HBsAg轉(zhuǎn)陰，HBeAg陽性初治患者在5～8年抗病毒治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰率為10%～12%，而HBeAg陰性初治患者只有<1%～2%的患者發(fā)生HBsAg轉(zhuǎn)陰[4]。CHB患者停止治療后仍保持HBsAg陰性，抗-HBs陽性或陰性、HBV DNA檢測不到、肝臟生化指標(biāo)(如ALT)正常、肝組織病變改善則為臨床治愈[5]。血清HBsAg轉(zhuǎn)陰后HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)仍持續(xù)存在于肝，肝內(nèi)仍存在低水平的HBV復(fù)制[6]，且存在HBV再激活和發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)。有研究[7]統(tǒng)計(jì)，2946例CHB患者HBsAg消失后發(fā)生肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)約為4.0%。

在發(fā)生慢性HBV感染者體內(nèi)，CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答在質(zhì)量和數(shù)量上發(fā)生變化[8]，甚至?xí)霈F(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的嚴(yán)重缺陷，病毒特異性CD8+T淋巴細(xì)胞通常無法分化為記憶性CD8+T淋巴細(xì)胞[9]，HBV特異性T淋巴細(xì)胞的檢出頻率顯著降低[10]。以上研究提示功能性T淋巴細(xì)胞持續(xù)暴露于高水平的病毒抗原引起T淋巴細(xì)胞耗竭[11]，這是病毒持續(xù)存在的主要促成因素[12]。PD-1是耗竭型T淋巴細(xì)胞主要表達(dá)的抑制性受體，研究[12]發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1信號通路可以調(diào)節(jié)慢性HBV感染者體內(nèi)免疫細(xì)胞的功能。對CHB患者的縱向分析[13-14]顯示，PD-1和PD-L1表達(dá)水平在炎性發(fā)作期顯著升高，在炎癥消退時(shí)逐漸降低。因此，PD-1在CHB患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況可能具有重要意義。

近來，有研究[15]證明部分CHB患者病毒抗原水平下降對病毒特異性免疫功能恢復(fù)有利。本研究對CHB臨床治愈者外周血中T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)情況進(jìn)行分析，探究臨床治愈者體內(nèi)病毒特異性免疫的恢復(fù)情況，并分析血清可溶性PD-1(soluble PD-1, sPD-1)和sPD-L1水平[16-17]與T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)情況的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2022年1月—5月在本院感染疾病科門診診斷的CHB臨床治愈者。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～70歲；(2)HBsAg陰性以及HBV DNA低于檢測值下限(20 IU/mL)；(3)抗病毒治療時(shí)間>6個(gè)月。出現(xiàn)以下任何一種情況即排除：(1)非HBV原因?qū)е碌穆愿闻K疾病，例如HCV感染、HDV感染、重度脂肪肝、酒精性肝病、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷、遺傳代謝性肝病等；(2)HIV感染；(3)合并惡性腫瘤患者(不包括已治愈者，包括原發(fā)性肝癌)；(4)合并心、肺、腎、腦、血液等重要臟器嚴(yán)重疾病伴功能不全者。經(jīng)以上入排標(biāo)準(zhǔn)篩選，總共納入26例臨床治愈者。

同時(shí)納入了26例CHB初治患者進(jìn)行比較。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～70歲；(2)HBsAg陽性>6個(gè)月；(3)未進(jìn)行抗病毒治療。排除標(biāo)準(zhǔn)同CHB臨床治愈者。另外納入26例健康對照者。

1.2 研究方法 收集CHB初治患者、CHB臨床治愈者和健康對照者的基本信息和各項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)，包括生化指標(biāo)及病毒學(xué)檢查指標(biāo)。

1.3 標(biāo)本收集及檢測 收集CHB初治患者、CHB臨床治愈者和健康對照者的外周血樣本。使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血T淋巴細(xì)胞及PD-1表達(dá)情況，使用FITC anti-human CD3 Antibody (美國，Biolegend公司)標(biāo)記外周血T淋巴細(xì)胞，使用PE anti-human CD8 Antibody(美國， Biolegend公司) 標(biāo)記外周血T淋巴細(xì)胞中的CD8+T淋巴細(xì)胞，使用APC anti-human CD279 (PD-1) Antibody (美國，Biolegend公司)標(biāo)記PD-1+淋巴細(xì)胞。使用ELISA法檢測血清sPD-1和sPD-L1 (美國，R&D Systems 公司)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。非正態(tài)分布計(jì)量資料采用M(P25～P75)表示，sPD-1和sPD-L1及抗-HBs的水平經(jīng)log10變換后使用M(P25～P75)描述，3組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料3組間比較采用χ2檢驗(yàn)。使用Pearson相關(guān)或Spearman相關(guān)進(jìn)行兩個(gè)連續(xù)變量之間的相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB初治患者、臨床治愈者與健康對照者的特點(diǎn)分析 CHB臨床治愈者平均抗病毒治療時(shí)間約8.33年，抗病毒治療藥物均為恩替卡韋。CHB初治患者HBsAg水平為2.51(1.74～3.31) log10IU/mL，HBV DNA為 1.42(1.30～2.53) log10IU/mL，HBeAg陽性7例。臨床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平顯著高于健康對照者(P值分別為0.029、<0.001)。然而臨床治愈者血清sPD-1和sPD-L1水平與CHB初治患者水平相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

臨床治愈者的T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、PD-1+細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、PD-1+CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞與健康對照者水平相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。而CHB初治患者的PD-1+細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、PD-1+CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞顯著高于臨床治愈者(P值分別為0.040、0.016)(表1)。

表1 CHB患者和健康對照者臨床特點(diǎn)分析

2.2 健康對照者血清sPD-1和sPD-L1與各指標(biāo)的相關(guān)性分析 健康對照者血清sPD-1水平和年齡、性別、ALT、T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、PD-1+細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、PD-1+CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞均無相關(guān)性(P值均>0.05)，sPD-L1也是類似結(jié)果(表2)。

表2 健康對照者血清sPD-1和sPD-L1與各指標(biāo)的相關(guān)性

2.3 CHB初治患者血清sPD-1和sPD-L1與各指標(biāo)的相關(guān)性分析 結(jié)果提示CHB初治患者血清sPD-1、sPD-L1與HBsAg水平均呈中等程度負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.524、-0.583，P值均<0.05)。血清sPD-1、sPD-L1水平和PD-1+CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞具有中等程度的正相關(guān)(r值分別為0.535、0.419，P值均<0.05)。血清sPD-1和sPD-L1水平與其他指標(biāo)均無相關(guān)性(P值均>0.05)(表3)。

表3 CHB初治患者血清sPD-1和sPD-L1與各指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 CHB臨床治愈者血清sPD-1和sPD-L1與各指標(biāo)的相關(guān)性分析 CHB臨床治愈者血清sPD-1水平和年齡、性別、ALT、T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、PD-1+細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、PD-1+CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞均無相關(guān)性(P值均>0.05)，sPD-L1也是類似結(jié)果(表4)。

表4 臨床治愈CHB患者血清sPD-1和sPD-L1與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

CHB初治患者中血清sPD-1、sPD-L1水平與外周血PD-1+CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞之間存在中等程度的正相關(guān)性，提示CHB初治患者血清sPD-1、sPD-L1水平主要與外周血PD-1+CD8+T淋巴細(xì)胞有關(guān)，外周血病毒特異性耗竭型CD8+T淋巴細(xì)胞比例越高，血清sPD-1、sPD-L1水平越高。然而CHB臨床治愈者、健康對照者未見到血清sPD-1、sPD-L1水平與PD-1+CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞顯著的相關(guān)性，提示CHB臨床治愈者、健康對照者體內(nèi)sPD-1、sPD-L1水平可能主要來源于外周血以外。有研究[18-19]發(fā)現(xiàn)超過90%的肝臟浸潤的HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞中可檢測到PD-1陽性。

本研究中臨床治愈者的外周血PD-1+細(xì)胞/淋巴細(xì)胞、PD-1+CD8+T淋巴細(xì)胞/淋巴細(xì)胞顯著低于CHB初治患者，提示臨床治愈者外周血耗竭型CD8+T淋巴細(xì)胞減少。這可能是因?yàn)榕R床治愈者隨著病毒載量和抗原水平降低，體內(nèi)部分病毒特異性T淋巴細(xì)胞功能恢復(fù)。然而與健康對照者相比，臨床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平仍顯著高于健康對照者。這可能與CHB臨床治愈者體內(nèi)耗竭型病毒特異性T淋巴細(xì)胞主要存在于肝內(nèi)[20]有關(guān)。由于HBV cccDNA以及HBV整合DNA的存在，臨床治愈者雖然血清檢測不到病毒和抗原，但肝內(nèi)還在發(fā)生病毒復(fù)制[21]，使得肝內(nèi)病毒特異性T淋巴細(xì)胞只能恢復(fù)部分功能。因此，血清sPD-1和sPD-L1可能可以反映肝內(nèi)病毒特異性T淋巴細(xì)胞恢復(fù)情況，尤其是CHB臨床治愈者這種外周血T淋巴細(xì)胞功能部分恢復(fù)的情況，值得進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

在CHB初治患者體內(nèi)，血清sPD-1、sPD-L1和HBsAg水平呈中等程度負(fù)相關(guān)，sPD-1和sPD-L1水平越高，HBsAg水平越低。這可能是因?yàn)镃HB初治患者病毒抗原水平較高，使得病毒特異性T淋巴細(xì)胞的耗竭主要表現(xiàn)為數(shù)量減少。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)臨床治愈者的血清sPD-1和sPD-L1水平高于健康對照者,這可能與臨床治愈者肝內(nèi)仍持續(xù)發(fā)生病毒復(fù)制有關(guān)，使得肝內(nèi)病毒特異性T淋巴細(xì)胞功能仍受到抑制。通過檢測血清sPD-1和sPD-L1可能可以反映臨床治愈者肝內(nèi)病毒特異性免疫恢復(fù)的情況。

倫理學(xué)聲明：本研究于2021年1月13日由北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審查編號：2020科研363。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：譚寧負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計(jì)分析，撰寫文章；劉建湘負(fù)責(zé)資料分析，擬定寫作思路，撰寫文章；譚寧和劉建湘貢獻(xiàn)等同，為共同第一作者?？嘿弧⑴思依?、韓一凡、陳宏宇參與收集數(shù)據(jù)和分析；徐小元負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。