孫先琳，劉冬陽，羅兵兵，尹顯源，王君霞，姚 浩

(西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院1.兒科；2.血液內(nèi)科，四川 成都 610000)

哮喘是臨床上較常見的一類呼吸道疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，與氣道慢性炎癥、呼吸道感染、氣道高反應(yīng)等多因素相關(guān)，發(fā)病率較高[1]。肺炎支原體(mycoplasma pneumonia，MP)為呼吸道感染的主要病原微生物，其感染多發(fā)于小兒。10%～40%的小兒社區(qū)獲得性肺炎因MP引發(fā)[2]。有研究認為，MP能誘導(dǎo)炎性細胞增殖促進炎癥因子釋放，加劇哮喘患兒病情[3]。另有報道顯示，MP感染繼發(fā)支氣管哮喘發(fā)病率呈顯著攀升態(tài)勢[4]。但目前二者具體關(guān)系尚未完全探明，T淋巴細胞亞群被認為在哮喘發(fā)病過程中扮演關(guān)鍵角色。而維生素D屬于脂溶性維生素，主要在免疫應(yīng)答過程發(fā)揮作用，并且已有維生素D治療兒童呼吸道感染的相關(guān)報道[5]。既往研究表明，白細胞介素-5(interleukin-5，IL-5)在MP感染患者血清中較高，可能由于IL-5是參與哮喘合并MP患兒呼吸系統(tǒng)喘息癥狀的主要細胞因子[6]。為此，本研究觀察并分析了哮喘合并MP感染患兒的血清CD4+/CD8+、IL-5、維生素D水平，以期為該類患兒的臨床治療提供可靠的理論依據(jù)。

1研究對象與方法

1.1研究對象

選取2019年7月至2021年7月西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院兒科收治的哮喘患兒120例，根據(jù)MP抗體檢測結(jié)果將其分為MP感染組69例與未感染組51例。參考相關(guān)標準診斷：MP抗體檢測結(jié)果呈陽性，血清MP-免疫球蛋白M(IgM)滴度>1/80[7]。另外納入同期體檢健康兒童40例作為對照組。

納入標準：①年齡<12歲；②符合臨床對小兒支氣管哮喘的診斷標準[8]；③患兒及其家屬對研究內(nèi)容了解知情，并簽署同意書。排除標準：①既往MP感染史；②支氣管畸形；③其他因素引發(fā)哮喘，如異物吸入等；④合并惡性腫瘤；⑤近期有藥物治療史；⑥凝血功能障礙。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)會赫爾辛基宣言》的相關(guān)原則。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核并批準通過。

1.2方法

全部受試小兒于2021年8月2日入組后進行各項指標的檢測。

1.2.1 T淋巴細胞亞群的檢測

分別抽取所有受試小兒的外周血4mL，送至本院檢驗科，加入4mL外周血淋巴細胞分離液(Ficoll)(國藥公司提供)于15mL離心管，經(jīng)肝素抗凝后緩慢加至離心管，使用低速離心機(蜀科TDZ4-WS)于室溫中以1 500r/min離心20min，將單核細胞層吸出，移至新的15mL離心管，得到外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。用2支流式細胞儀試管分別按CD4和CD8標記，然后使用1mL重懸細胞清洗PBMC細胞2次，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，將其分為2份，每份100μL，加入鼠抗人CD4-FITC抗體和CD8-FITC抗體(美國BD公司提供)各5μL混勻，室溫下避光孵育20min，加入200μL紅細胞裂解液(美國BD公司提供)，加入2mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，以1 500r/min離心5min，舍棄上清液，加入0.5mL PBS，通過流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司，EPICS-XL型)檢測CD4+T、CD8+T細胞及CD4+/CD8+比值。

1.2.2 IL-5、維生素D、超敏C反應(yīng)蛋白和IgG水平的檢測

使用全自動酶標儀(賽默飛公司，multiskan)，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測受試小兒的IL-5、維生素D、超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)水平，采用免疫比濁法檢測免疫球蛋白G(IgG)水平，試劑盒為美國貝克曼庫爾特有限公司配套生產(chǎn)。嚴格按照儀器、試劑盒說明書步驟進行操作。

1.2.3肺功能指標的檢測

使用肺功能測定儀(耶格Master screen Diff+body)對所有受試小兒肺功能指標進行檢測，包括用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、潮氣量(tidal volume，Vt)、潮氣呼氣峰流速(tidal peak expiratory flow rate，PTEF)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1三組小兒的一般資料

三組小兒的性別分布及年齡和體質(zhì)量指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，感染組與未感染組的哮喘程度分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組小兒一般資料的比較Table 1 Comparison of general data of the children among the three

2.2三組小兒的T淋巴細胞亞群情況

三組小兒的CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+及IgG水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；感染組和未感染組的CD4+T、CD4+/CD8+均明顯低于對照組，而CD8+T、IgG水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；感染組的CD4+T、CD4+/CD8+均明顯低于未感染組，而CD8+T、IgG水平均明顯高于未感染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組小兒T淋巴細胞亞群檢測結(jié)果的比較Table 2 Comparison of serum levels of T-lymphocyte subsets of the children among the three

2.3三組小兒的IL-5、維生素D、hs-CRP水平情況

三組小兒的IL-5、維生素D、hs-CRP水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；感染組和未感染組的維生素D水平均明顯低于對照組，而IL-5、hs-CRP水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；感染組的維生素D水平明顯低于未感染組，而IL-5、hs-CRP水平均明顯高于未感染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 三組小兒IL-5、維生素D、hs-CRP水平的比較Tabel 3 Comparison of serum levels of IL-5,vitamin D and hs-CRP of the children among the three

2.4三組小兒的肺功能指標

三組小兒的FVC、Vt和PTEF水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；感染組和未感染組的FVC、Vt、PTEF水平均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；感染組的FVC、Vt和PTEF水平均明顯低于未感染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 三組小兒肺功能指標的比較Table 4 Comparison of pulmonary function parameters of the children among the three

2.5哮喘合并MP患兒CD4+/CD8+、IL-5、維生素D與肺功能指標的相關(guān)性

經(jīng)Pearson法分析顯示，哮喘合并MP患兒的CD4+/CD8+和維生素D分別與FVC、Vt和PTEF呈正相關(guān)(P<0.05)，而IL-5和IgG及hs-CRP分別與FVC、Vt、PTEF呈負相關(guān)(P<0.05)，見表5。

表5 哮喘合并MP患兒CD4+/CD8+、IL-5、維生素D與肺功能指標的相關(guān)性分析Table 5 Correlations of CD4+/CD8+,IL-5 and vitamin D with pulmonary function parameters in asthmatic children with MP infection

3討論

MP已被眾多研究認為是引起青少年兒童呼吸道疾病和肺病變的病原體，MP感染發(fā)病率逐年上升[9]。國外研究表明，MP感染是導(dǎo)致兒童喘息發(fā)作的原因之一[10]。越來越多的學(xué)者開始研究MP感染與兒童哮喘之間的關(guān)系。有研究表明，MP感染肺炎患兒體內(nèi)T淋巴細胞亞群失衡[11]；也有研究認為IL-5高水平可表現(xiàn)為慢性炎癥及氣道高反應(yīng)[12]。

3.1 T淋巴細胞亞群對哮喘合并MP感染的影響

本研究顯示，感染組患兒的CD4+T、CD4+/CD8+比值均明顯低于未感染組和對照組，而CD8+T、IgG水平均明顯高于未感染組和對照組，提示哮喘合并MP感染患兒體內(nèi)T淋巴細胞亞群失衡。T淋巴細胞亞群的CD4+T、CD8+T作為細胞免疫的效應(yīng)細胞，其計數(shù)值及CD4+/CD8+比值反映了小兒細胞免疫的狀態(tài)，而CD4+/CD8+比值下降可能是MP感染后哮喘患兒免疫功能下降的主要原因；另外，IgG由B細胞誘導(dǎo)分化形成，其水平上調(diào)則可能進一步說明MP感染患兒體內(nèi)存在Th1/Th2失衡現(xiàn)象。江靜等(2021年)研究指出，MP侵襲人體激活免疫系統(tǒng)，免疫功能指標異常導(dǎo)致功能被抑制，使得機體抵抗力下降。這與本研究結(jié)果較為吻合，說明MP感染哮喘患兒的免疫功能受到抑制。

3.2 IL-5、維生素D、hs-CRP水平對哮喘合并MP感染的影響

本研究顯示，感染組患兒的IL-5、hs-CRP水平均明顯高于未感染組和對照組，但維生素D水平明顯低于未感染組和對照組，提示哮喘合并MP感染患兒炎癥反應(yīng)較明顯，IL-5和維生素D水平異常。IL-5通過刺激B細胞分化來抑制輔助性T細胞活性，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，而維生素D的活性代謝物1,25-(OH)2D3與機體免疫調(diào)節(jié)有緊密聯(lián)系[13]。維生素D水平降低可能導(dǎo)致呼吸道黏膜變性、增生，引發(fā)炎癥反應(yīng)，最終造成肺組織損傷。有研究顯示，哮喘合并MP感染患者的IL-5水平明顯高于常人，且維生素D水平亦有所下降[14]。這與本研究結(jié)果一致。

3.3肺功能指標對哮喘合并MP感染的影響

本研究顯示，感染組、未感染組和對照組小兒的肺功能存在明顯差異，感染組患兒的FVC、Vt、PTEF水平均明顯低于未感染組和對照組，未感染組患兒的FVC、Vt、PTEF水平均明顯低于對照組，提示哮喘患兒肺功能相比正常兒童有所下降，其中哮喘合并MP感染患兒肺功能明顯受損。分析其原因，可能是MP感染破壞了呼吸道纖毛結(jié)構(gòu)，形成空泡，消耗大量葡萄糖，感染細胞表面脫落，大量炎性因子聚集發(fā)生炎癥反應(yīng)，造成氣道壁增厚、管腔狹窄，損傷患兒肺功能。但吾曼莉等[15]研究顯示，MP感染合并支氣管哮喘的患者與健康者的肺功能比較無差異，與本研究結(jié)論不同，推測可能是患者均屬于成年人，與本研究中小兒呼吸道發(fā)育狀況尚存差異，并且該研究樣本量僅有120例，具體關(guān)系仍有待之后大樣本量研究予以證實。

3.4哮喘合并MP患兒的CD4+/CD8+、IL-5、維生素D與肺功能指標的相關(guān)性

本研究顯示，哮喘合并MP患兒的CD4+/CD8+和維生素D與肺功能指標均呈正相關(guān)，而IL-5、IgG、hs-CRP與肺功能指標均呈負相關(guān)，提示CD4+/CD8+、IL-5、IgG、hs-CRP和維生素D與肺功能均具有相關(guān)性。有研究顯示，CD4+/CD8+與MP感染、疾病嚴重程度相關(guān)[16]。分析其原因，MP感染可能導(dǎo)致哮喘患兒CD4+/CD8+比值下降，同時炎癥反應(yīng)加劇，IL-5和維生素D水平異常，損傷患兒肺功能。

綜上所述，哮喘合并MP患兒存在明顯的T淋巴細胞亞群紊亂、維生素D缺乏，以及較明顯的炎癥反應(yīng)，因此應(yīng)及時給予患兒免疫調(diào)節(jié)，并進行相關(guān)因子的檢查，以保護患兒肺功能，防止病情發(fā)展。