劉振東，程秀峰，索朗群培，邢書源，李 梁，張金超，羅 章

（西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏特色農(nóng)產(chǎn)品研發(fā)中心，食品科學(xué)與工程重點實驗室，西藏 林芝 860000）

發(fā)酵是古老的食品加工和保存方法之一，可以追溯到幾千年前[1]。在食品發(fā)酵過程中微生物可以提高營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度，增加防腐保質(zhì)性能，豐富食品風(fēng)味，提高食品安全性[2]。干制發(fā)酵乳制品既可以使奶類產(chǎn)品長時間保存和遠距離運輸，又能讓乳糖不耐癥患者更容易接受奶制品[3]。干制發(fā)酵乳制品獨特的風(fēng)味和營養(yǎng)特性由5 個因素共同決定：地理和氣候條件、奶源、原料混合物變化、生產(chǎn)工藝和微生物[4]。在這些因素中，細菌對干制發(fā)酵乳制品的營養(yǎng)特性起著關(guān)鍵作用。

西藏、內(nèi)蒙、新疆和云南4 個地區(qū)均有大量牧民存在，各種各樣的乳制品是牧民的主要生存來源之一[5-8]。干制發(fā)酵乳制品是指由原料乳經(jīng)當(dāng)?shù)卮鄠鞯膫鹘y(tǒng)技藝處理，在自然條件下發(fā)酵并正常干制而成。曲拉是由脫脂后的牦牛奶在自然條件下發(fā)酵凝固并風(fēng)干制成的粗干制發(fā)酵乳制品，屬于西藏自治區(qū)典型的手工干制發(fā)酵乳制品[9-10]。酸奶疙瘩是由牛奶經(jīng)自然發(fā)酵后自然干制而成，屬于酸奶的結(jié)晶體，是新疆牧民自制的典型干制發(fā)酵乳制品[11]。奶渣子是將分離出油脂的奶進行發(fā)酵，再將其中的水分晾干，屬于內(nèi)蒙牧區(qū)常見的手工干制發(fā)酵乳制品之一[12]。乳扇是由牛乳自然發(fā)酵并經(jīng)過凝乳、熱燙、拉伸等工藝而制成，屬于云南典型的干制發(fā)酵乳制品[13]。干制發(fā)酵乳制品具有蛋白質(zhì)含量高、益生菌種類多、保存時間長，攜帶方便等特點，在西藏、內(nèi)蒙、新疆、云南4 個地區(qū)被廣泛制作并食用[14]。

傳統(tǒng)基于細菌分離、純化、培養(yǎng)及鑒定的研究方法不易獲得痕量微生物，難以將環(huán)境中完整的細菌種群結(jié)構(gòu)及生態(tài)關(guān)系展現(xiàn)出來[15]，高通量測序技術(shù)不僅可以檢測到那些難培養(yǎng)和低豐度的細菌[16]，還可以排除挑選菌株時所產(chǎn)生的單一性，更能代表整體的細菌組成[17]，因此已經(jīng)逐漸成為研究細菌組成及結(jié)構(gòu)的一種重要方法，近年該技術(shù)已廣泛用于原料乳和各類發(fā)酵乳等乳制品生態(tài)位的研究[18-20]。朱瀟等[21]通過高通量測序技術(shù)比較了甘肅藏區(qū)傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳制品的細菌菌群多樣性，麻和平等[22]通過高通量測序技術(shù)分析比較了不同保存溫度下牦牛酸奶的細菌多樣性，曾椿淋[12]通過高通量測序技術(shù)分析了內(nèi)蒙古不同地區(qū)的手工干制發(fā)酵乳制品微生物多樣性。然而，通過高通量測序技術(shù)分析我國不同省份地區(qū)干制發(fā)酵乳制品的群落結(jié)構(gòu)和多樣性卻鮮有報道。

本研究分別從西藏、內(nèi)蒙、新疆和云南4 個地區(qū)采集了4 種特色干制乳制品，這4 個地區(qū)分別位于中國的西北、西南、北部和南部，屬于中國的邊界省份，而且都盛產(chǎn)奶制品[23]。通過分析4 個地區(qū)特色干制發(fā)酵乳制品的基本營養(yǎng)成分以及細菌群落多樣性，測定其游離氨基酸和短脂肪鏈酸含量，探討細菌對干制乳制品品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

24 份干制乳制品樣品：新疆的酸奶疙瘩（SNGD）、西藏的曲拉（QL）、內(nèi)蒙的奶渣子（NZZ）、云南的乳扇（RS），不同地區(qū)干制乳制品的采集及分組信息如表1所示，均為2021年3月在農(nóng)牧民家制作，密封運送至實驗室，于-80 ℃低溫冰箱中保存。

表1 干制乳制品的采集及分組信息Table 1 Information on collection and grouping of dry fermented dairy products

E.Z.N.A.?Soil DNA提取試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；FastPfuDNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒 美國Axygen Biosciences公司；MiSeq Reagent Kit v3 美國Illumina公司；鄰苯二甲醛、氯甲酸-9-芴基甲酯、3-巰基丙酸、17 種氨基酸混合標準品（2.5 μmol/mL）、天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、正纈氨酸、色氨酸、21-羥脯氨酸、肌氨酸標準品（均為分析純） 德國Sigma公司；濃鹽酸、硼酸、氫氧化鈉、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；甲醇、乙腈（均為色譜純）上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JD-3型電子天平 遼寧省沈陽龍騰電子有限公司；101-2型恒溫干燥箱 上海普瑞賽斯儀器有限公司；KND-04型自動凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器公司；SX2-2.5-12型馬弗爐 北京獨創(chuàng)科技有限公司；N13462C型移液器、5430 R型小型離心機 德國Eppendorf公司；MiFly-6微型離心機 安徽省合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；QuantiFluorTM-ST微型熒光計美國Promega公司；Illumina MiSeq測序儀、Illumina MiSeq PE300型高通量測序儀 美國Illumina公司；QL-901型旋渦混合器 江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TL-48R型粉碎研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、DB-WAX色譜柱（0.25 mm×50 m，0.25 μm）、1100液相色譜（liquid chromatography，LC）儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基本營養(yǎng)成分的測定

根據(jù)GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[24]、GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[25]、GB 5413.5—2010《嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》[26]、GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》[27]、GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[28]的方法測定干制乳制品樣品中脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、灰分及水分含量。

1.3.2 DNA抽提和PCR擴增

根據(jù)E.Z.N.A.?Soil DNA提取試劑盒的說明書進行總DNA抽提，利用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定DNA濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量。使用PCR 以引物對338 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）擴增16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增體系（20 μL）為：4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 5 μmol/L引物，0.4 μL FastPfuDNA聚合酶，10 ng DNA模板。

1.3.3 Illumina MiSeq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST微型熒光計進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2×300文庫。構(gòu)建文庫步驟：連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用MiSeq PE300型高通量測序儀進行測序。

1.3.4 脂肪酸的提取及GC-MS分析

參考賈益群等[29]的方法，向離心管中加入1 mL 0.5 mol/L硫酸溶液，加蓋密封，40 ℃、35 kHz超聲振蕩20 min。冷卻后，準確加入4 ℃、1 mL乙醚，用記號筆記下液面位置，劇烈振蕩5 min后，置于冰箱（4 ℃）中靜置放置30 min，補加乙醚至標記刻度，10000 r/min離心5 min，取上層乙醚溶液進行GC-MS分析[30]?；旌蠘藴势放渲疲悍謩e稱量一定質(zhì)量標準品混合，用丙酮溶解，定容至50 mL，按分析要求稀釋一定倍數(shù)后上機測定。

GC條件：進樣口溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；載氣流速1.5 mL/min；分流比3∶1；進樣量1 μL；升溫程序：初始70 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升溫到100 ℃，保持2 min；8 ℃/min升溫到180 ℃，保持0 min；10 ℃/min升溫到250 ℃，保持15 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離能量70 eV；全掃描模式；質(zhì)量范圍m/z35～550。

實驗結(jié)果與美國國家標準與技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）標準譜庫對比分析，確認物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱，使用特征離子外標法進行定量分析[31]。

1.3.5 游離氨基酸提取及LC分析[32]

將樣品研碎，稱取0.5 g樣品于10 mL離心管中，加5 mL 0.01 mol/L HCl溶液（或純水），混勻，沸水浴30 min，10000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀再加2 mL 0.01 mol/L HCl溶液懸浮超聲5 min，13000 r/min離心15 min，合并上清液，定容至10 mL，過膜測定。

采用安捷倫公司自動在線衍生化方法，一級氨基酸與鄰苯二甲醛、二級氨基酸與芴甲氧羰酰氯衍生后過柱檢測。LC條件：ZORBAX Eclipse AAA色譜柱（4.6 mm×75 mm，3.5 μm）；流動相：A為pH 7.840 mmol/L磷酸二氫鈉；B為乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）；流速1.0 mL/min；梯度洗脫程序如表2所示；在338 nm（0～19 min）、266 nm（19.01～25 min）波長處檢測信號。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)干制發(fā)酵乳制品基本營養(yǎng)成分分析

脂肪可以影響干制發(fā)酵乳制品的硬度、黏性、口感和風(fēng)味。干制發(fā)酵乳制品與其他種類乳制品相比具有高質(zhì)量蛋白質(zhì)，含有滿足人體正常生理代謝所需的氨基酸。如表3所示，與其他地區(qū)相比，云南乳扇的脂肪含量最高，這可能是因為傳統(tǒng)制作方式中，為延長乳扇貯藏期在制作時添加了植物油[33]。與其他地區(qū)相比，新疆酸奶疙瘩的蛋白質(zhì)含量最高，脂肪含量最低，具有高蛋白低脂肪的特性，這與王絨雪等[34]在新疆地區(qū)采集的兩種酸奶疙瘩樣品的研究結(jié)果較為相似。此外，西藏曲拉和內(nèi)蒙奶渣子基本營養(yǎng)成分的各項指標較為接近，這可能與他們極其相似的制作方式有關(guān)。乳制品中的營養(yǎng)成分含量隨制作方式、乳品種、所在區(qū)域省份及氣候等條件的變化而變化，所以不同地區(qū)干制發(fā)酵乳制品其脂肪、蛋白質(zhì)以及乳糖等含量存在一定差異。

表3 不同地區(qū)干制發(fā)酵乳制品的基本營養(yǎng)成分Table 3 Basic nutrient compositions of dry fermented dairy products from different regions

2.2 不同地區(qū)干制發(fā)酵乳制品α多樣性分析

α多樣性反映出不同地區(qū)乳制品的物種多樣性與豐富度，如表4所示，Illumina MiSeq測序從各區(qū)域采集的干制發(fā)酵乳制品樣本共獲得2421338 條reads，其中clean reads為1871524 條。由表4可知，云南乳扇中細菌Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均明顯高于西藏的曲拉、新疆的酸奶疙瘩以及內(nèi)蒙的奶渣子，表明云南乳扇中細菌微生物群落的種群差異性相對較大、群落多樣性較高。Chao1指數(shù)的結(jié)果與Observed OTUs的結(jié)果相似，這是因為通常用Chao1算法估計樣品中所含OTUs數(shù)目的指數(shù)，用來估計物種數(shù)，即Chao1指數(shù)就是OTUs數(shù)的一個反應(yīng)指標，進一步證明了云南乳扇中細菌微生物群落多樣性以及總體豐度較高。

表4 不同地區(qū)干制乳制品細菌多樣性Table 4 Bacterial diversity of dry fermented dairy products from different regions

2.3 不同地區(qū)干制乳制品中細菌微生物組成

由圖1 a 可知，4 種干制乳制品的優(yōu)勢門均為Firmicutes，其中新疆酸奶疙瘩的豐度最高。由圖1b可知，內(nèi)蒙奶渣子最豐富的科為Streptococcaceae；西藏曲拉的主要科為Lactobacillaceae、Acetobacteraceae、Streptococcaceae和Enterococcaceae；云南乳扇的主要科為Streptococcaceae和Lactobacillaceae；新疆酸奶疙瘩的主要科為Lactobacillaceae和Streptococcaceae。由圖1c可知，內(nèi)蒙奶渣子和云南乳扇都以Lactococcus為主；西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中最豐富的屬均為Lactobacillus，第二主要屬分別為Acetobacter和Streptococcus。

圖1 不同地區(qū)干制乳制品門（a）、科（b）、屬（c）水平各樣本菌群分布圖Fig.1 Distribution of bacterial flora at the level of phylum (a),family (b) and genus (c) in dry fermented dairy products from different regions

通過LEfSe分析，以前6 個特征菌為代表，由圖2可知，內(nèi)蒙奶渣子的特征菌有Lactococcus、Streptococcaceae、Enterobacteriaceae、Enterobacteriales、Serratia和Halomonadaceae。西藏曲拉代表性細菌微生物有Rhodospirillales、Alphaproteobacteria、Acetobacteraceae、Acetobacter、Proteobacteria和Enterococcaceae。云南乳扇中的特征菌有Gammaproteobacteria、Pseudomonadales、Rahnella、Moraxellaceae、Archaea和Neisseriaceae。新疆酸奶疙瘩中，鑒定出了Lactobacillaceae、Lactobacillus、Firmicutes、Lactobacillales、Bacilli和Streptococcus。

圖2 不同地區(qū)干制乳制品LEfSe分析圖Fig.2 LEfSe analysis of dry fermented dairy products from different regions

2.4 不同地區(qū)干制乳制品中脂肪酸分析

脂肪酸在干制乳制品風(fēng)味中起著重要作用，它們能抑制致病菌的生長，促進益生菌的生長。高乙酸含量會導(dǎo)致干制乳制品的不良風(fēng)味，通過對16 種脂肪酸的評價，乙酸含量與總脂肪酸含量相比較少（表5）。由表5可知，云南乳扇中的16 種脂肪酸均高于其他3 個地區(qū)，丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸和硬酯酸含量最為明顯。這可能與云南乳扇的生產(chǎn)工藝有關(guān)，制作過程中會將木瓜提取的酸水加入鮮奶中，酸和熱加速了奶的凝固，酸水在一定程度上引入了系列復(fù)合酶，從而引發(fā)系列水解反應(yīng)，導(dǎo)致乳扇中有相對較多的脂肪酸類物質(zhì)。云南乳扇中的棕櫚酸含量最高，棕櫚酸穩(wěn)定性比較好，可以用來增加食品的色澤，所以乳扇的外表光滑、色澤油亮。內(nèi)蒙奶渣子、西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩的硬酯酸含量最高，硬脂酸是脂肪酸的重要成分，能迅速轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪酸油酸。此外，共軛油酸也是干制發(fā)酵乳制品脂肪中的有益成分，具有抗癌、抗脂肪形成、抗動脈粥樣硬化、抗糖尿病和抗炎等多種生物活性，適量攝入對人體健康有益。

表5 不同地區(qū)干制乳制品中的主要脂肪酸Table 5 Major fatty acids in dry fermented dairy products from different regions

2.5 不同地區(qū)干制乳制品中游離氨基酸分析

干制乳制品中的游離氨基酸有助于風(fēng)味的形成，可作為分解代謝反應(yīng)的前體產(chǎn)生酮酸、氨、胺、醛、酸和醇，從而產(chǎn)生干制乳制品的風(fēng)味和香氣。由表6可知，共檢出24 種游離氨基酸，新疆酸奶疙瘩的游離氨基酸種類最為豐富，包含了24 種游離氨基酸，而且多數(shù)游離氨基酸含量高于其他3 個地區(qū)的干制乳制品，因為新疆酸奶疙瘩的蛋白質(zhì)含量與其他3 個地區(qū)的干制發(fā)酵乳制品相比最高（表3），而乳制品在發(fā)酵過程中通過酶的作用可以使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨基酸。其中，谷氨酰胺、組氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸只存在與新疆酸奶疙瘩中，所以新疆酸奶疙瘩的風(fēng)味最為豐富。在4 個地區(qū)不同的干制乳制品中，只有內(nèi)蒙奶渣子不含纈氨酸，西藏曲拉不含酪氨酸。干制發(fā)酵乳制品中氨基酸的存在對其質(zhì)量與風(fēng)味都有直接作用，精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸主要呈現(xiàn)苦味，谷氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸具有酸味，丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸具有甜味[35]。

表6 不同地區(qū)干制乳制品中的游離氨基酸Table 6 Free amino acids in dry fermented dairy products from different regions

2.6 細菌微生物群落與脂肪酸和游離氨基酸的關(guān)系

利用RDA研究細菌微生物群落與α多樣性、脂肪酸和游離氨基酸的關(guān)系，如圖3所示，RDA1和RDA2分別占總方差的44.31%和22%。在西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中，丙氨酸與醋桿菌Acetobacter、乳桿菌Lactobacillus和鏈球菌Streptococcus相關(guān)。在云南乳扇中，高含量的乙酸和丁酸與Acinetobacter相關(guān)，同時，羥脯氨酸也與Acinetobacter相關(guān)。因此，不同地區(qū)干制發(fā)酵乳制品中的微生物群落與其風(fēng)味和營養(yǎng)成分息息相關(guān)。

圖3 細菌微生物群落與脂肪酸和游離氨基酸的RDAFig.3 RDA plot showing the relationship of bacterial communities with fatty acids and free amino acids

3 討論

內(nèi)蒙的奶渣子、西藏的曲拉、云南的乳扇和新疆的酸奶疙瘩的基本營養(yǎng)成分和細菌微生物豐富度和多樣性均存在一定差異。其中，與其他地區(qū)相比，云南乳扇中水分含量和細菌微生物群落多樣性以及總體豐度最高，這可能與云南乳扇獨特的制作方式以及較多的環(huán)境微生物有關(guān)。首先，云南乳扇是鮮牛乳巴氏殺菌后，充分凝乳形成凝塊后進行熱燙洗滌，然后借助木桿將其拉伸成獨特的紙扇形狀上架晾干而制成，制作工藝相對復(fù)雜，制作流程相對較多[36]，與環(huán)境的接觸更為密集。其次，云南是中國的旅游大省，流動人口遠高于新疆、西藏和內(nèi)蒙3 個地區(qū)[37]，環(huán)境微生物相對于其他地區(qū)更加復(fù)雜多樣。

內(nèi)蒙的奶渣子、西藏的曲拉、云南的乳扇和新疆的酸奶疙瘩都含有Lactobacillus、Lactococcus和Streptococcus，這些細菌利用乳糖和其他碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)和肽，產(chǎn)生短肽、游離氨基酸、脂肪酸和芳香化合物，在風(fēng)味形成和營養(yǎng)成分中發(fā)揮重要作用[38]。Lactococcus是中國傳統(tǒng)干制發(fā)酵乳制品和西方干制發(fā)酵乳制品的主要菌屬[39]。本研究中，云南乳扇和內(nèi)蒙奶渣子中Lactococcus的含量最高，西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中最豐富的屬為Lactobacillus。Lactobacillus所表達的酶能夠分解苯丙氨酸和酪氨酸，從而產(chǎn)生芳香化合物，使西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩散發(fā)出特殊的香味[40]。在RDA圖中，Acinetobacter增加了云南乳扇中的丁酸含量，丁酸由微生物代謝產(chǎn)生，與病理性疾病有關(guān)。丁酸作為主要能量來源被結(jié)腸上皮吸收，從而增強腸道屏障功能[41]。而且只有云南乳扇中含有丙酸，丙酸參與了干制乳制品特有風(fēng)味的形成，對Salmonella、Escherichia、Listeria monocytogenes等病原菌也有抑制作用[42]。因此，云南乳扇可能比內(nèi)蒙的奶渣子、西藏的曲拉和新疆的酸奶疙瘩更健康。一般而言，干制發(fā)酵乳制品脂肪中含有66%的飽和脂肪酸、30%的單不飽和脂肪酸，硬脂酸和棕櫚酸是干制乳制品飽和脂肪酸的重要組成部分[43]，所以4 個牧區(qū)的傳統(tǒng)干制發(fā)酵乳制品的硬脂酸和棕櫚酸含量較高。綜上所述，不同的加工工藝導(dǎo)致4 個牧區(qū)傳統(tǒng)干制發(fā)酵乳制品的微生物組成不同，這可能會影響微生物代謝產(chǎn)生的氨基酸和脂肪酸的含量，從而導(dǎo)致營養(yǎng)成分和風(fēng)味的差異。

不斷增加的人類活動，包括工業(yè)化、城市化、人口、旅游業(yè)和其他變化，可以改變近地表大氣中環(huán)境微生物的數(shù)量和類型[44]。內(nèi)蒙的奶渣子、西藏的曲拉、云南的乳扇和新疆的酸奶疙瘩是中國4 個牧區(qū)的傳統(tǒng)干制發(fā)酵乳制品，沒有添加發(fā)酵劑乳酸菌。與大多數(shù)西方干制發(fā)酵乳制品不同的是，它們的細菌微生物幾乎完全來自環(huán)境。結(jié)果表明，奶渣子、曲拉、乳扇和酸奶疙瘩可作為研究中國不同地理區(qū)域與環(huán)境微生物關(guān)系的指示性案例。在4 個牧區(qū)中，乳扇的細菌微生物群落顯著豐富，其次是奶渣子和酸奶疙瘩，最后是曲拉。因為，曲拉產(chǎn)于西藏，西藏的生態(tài)環(huán)境質(zhì)量最好，工業(yè)化、城市化和人口規(guī)模最小，這反映了云南乳扇可能比其他3 種干制發(fā)酵乳制品受到更多的環(huán)境污染。這種污染在干制發(fā)酵乳制品生產(chǎn)過程中普遍存在，應(yīng)該在進一步研究干制發(fā)酵乳制品細菌微生物群時加以考慮。

眾所周知，微生物在發(fā)酵過程中對風(fēng)味代謝產(chǎn)物的特性起著至關(guān)重要的作用。此外，干制發(fā)酵乳制品成熟過程中復(fù)雜的微生物組成與多種代謝物的形成有關(guān)，這是干制發(fā)酵乳制品風(fēng)味多樣化的潛在工具[45]。本研究測定了干制發(fā)酵乳制品樣品中24 種游離氨基酸的含量，其中酸奶疙瘩中多數(shù)氨基酸的含量高于乳扇、曲拉和奶渣子。芳香氨基酸、支鏈氨基酸和含硫氨基酸等游離氨基酸的產(chǎn)生，是干制發(fā)酵乳制品獨特風(fēng)味和香氣的形成因素[46]。同時，乳扇生產(chǎn)地區(qū)丁酸含量最高、人口最多。丁酸不僅是一種益生菌，也是干制發(fā)酵乳制品的一種香味。研究表明，陳年干制發(fā)酵乳制品的味道非常濃郁，這可能與丁酸有關(guān)[47]。綜上所述，地理區(qū)域與人口、旅游等人類活動相結(jié)合，可能會影響干制發(fā)酵乳制品的細菌微生物豐富度、多樣性、組成以及干制發(fā)酵乳制品的風(fēng)味。

4 結(jié)論

采用國標中的系列方法對基本營養(yǎng)成分進行測定，利用高通量測序技術(shù)，對中國4 個主要牧區(qū)特色干制發(fā)酵乳制品的細菌微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析，同時測定游離氨基酸和脂肪酸的含量并對其進行RDA。研究表明，云南乳扇中水分含量和細菌微生物多樣性最高，脂肪含量和16 種脂肪酸含量均高于其他3 個地區(qū)。新疆酸奶疙瘩的蛋白質(zhì)含量和游離氨基酸種類最為豐富，檢測到24 種游離氨基酸，而且多數(shù)游離氨基酸含量高于其他3 個地區(qū)的干制發(fā)酵乳制品。在4 個地區(qū)不同的干制發(fā)酵乳制品中，只有內(nèi)蒙奶渣子不含纈氨酸，西藏曲拉不含酪氨酸。在西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中，丙氨酸與Acetobacter、Lactobacillus及Streptococcus相關(guān)。由此可見，不同的地理位置和環(huán)境條件會在很大程度上改變細菌微生物的數(shù)量和種類，導(dǎo)致干制發(fā)酵乳制品中細菌微生物的分布和化學(xué)成分不同。本研究為我國各省份傳統(tǒng)干制發(fā)酵乳制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定理論支持。