李 祥，陳貴杰，康貽軍,*，Amirsalar KHANDAN

（1.鹽城師范學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇省鹽土生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鹽城 224051；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.阿米爾卡比爾理工大學(xué)新技術(shù)研究中心，伊朗 德黑蘭 84175119）

人的胃腸道中棲居著數(shù)以萬億計(jì)的微生物，其中細(xì)菌主要包括厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微球菌門（Verrucomicrobia）、梭桿菌門（Fusobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）等，其中結(jié)腸中棲居約1014個(gè)細(xì)菌，這些細(xì)菌在結(jié)腸中形成了一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)[1-2]。越來越多的研究表明腸道菌群與宿主的健康及維持機(jī)體正常的生理機(jī)能息息相關(guān)，包括營養(yǎng)物質(zhì)吸收與代謝、促進(jìn)骨骼發(fā)育、抵御外源病原微生物、維生素及神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)合成等。然而腸道菌群紊亂會(huì)誘導(dǎo)肥胖、糖尿病、高血壓、結(jié)腸炎癌癥等多種疾病[3-5]。因此維持宿主腸道菌群穩(wěn)態(tài)對維護(hù)人體健康、預(yù)防疾病具有重要意義。

作為人體最龐大、最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生物本身及代謝產(chǎn)物不僅能調(diào)節(jié)人體健康，更在膳食和宿主之間起到了重要的橋梁作用。膳食干預(yù)是調(diào)節(jié)腸道微生物群的最有效方法之一，其中膳食纖維不會(huì)被人體消化系統(tǒng)消化吸收從而到達(dá)大腸，并在大腸與腸道菌群發(fā)生相互作用，其中膳食纖維可以促進(jìn)雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）等有益菌增殖并抑制大腸桿菌屬（Escherichia）、志賀氏菌屬（Shigella）等有害菌生長，同時(shí)膳食纖維可以被腸道菌群代謝成短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）[6-8]。通過膳食纖維調(diào)節(jié)腸道微生物群改善宿主健康已被廣泛研究和報(bào)道。如枸杞多糖體外可以促進(jìn)擬桿菌屬（Bacteroides）、Bifidobacterium、普氏菌屬（Prevotella）等有益菌的增殖，同時(shí)增加乙酸、丙酸和丁酸的含量[9]。因此膳食纖維作為一種潛在的益生元受到越來越多的關(guān)注。

甘露糖蛋白（mannoprotein，MP）約占酵母細(xì)胞壁外層的35%～45%，是酵母細(xì)胞壁重要組成成分，MP不僅可以在保持酵母形狀中發(fā)揮作用，還可以保護(hù)酵母細(xì)胞免受滲透壓的影響[10]。甘露糖通過共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)鏈接形成MP共聚物，其中蛋白約占5%～20%，甘露糖占80%～90%，分子質(zhì)量在20～200 kDa之間[11]。酵母MP具有較好的乳化特性，特別在紅酒加工中具有潛在的商業(yè)價(jià)值[12]。近年研究表明，酵母MP具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等生物活性[10,13]。但酵母MP體外發(fā)酵特性及對腸道微生物的影響依然未知。因此，本研究利用體外厭氧發(fā)酵模型結(jié)合高通量測序研究酵母MP在體外的益生活性，利用氣相色譜檢測MP的代謝產(chǎn)物SCFAs含量，利用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的RAW 264.7炎癥細(xì)胞模型評價(jià)MP及其代謝產(chǎn)物的抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MP 安琪酵母股份有限公司；MGC AnaeroPack?-Anaero厭氧盒和厭氧產(chǎn)氣包 日本三菱公司；菊粉、SCFAs 標(biāo)準(zhǔn)品（包括乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸）、巖藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rha） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；內(nèi)標(biāo)（2-乙基丁酸）、木糖（Xyl）、核糖（Rib）、葡萄糖（Glc）、半乳糖醛酸（GalA）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、甘露糖（Man）西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；糞便DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；RAW 264.7細(xì)胞 中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）；Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清 美國Gibco公司；來源于大腸桿菌的LPS、3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP） 美國Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）ELISA試劑盒 深圳欣博盛生物科技有限公司；一氧化氮（NO）試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N型氣相色譜儀 美國Agilent公司；MJX-160B-Z型霉菌培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AY-120/BL-220H型電子天平 日本Shimadzu公司；LDZX-50KBS滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 MP分子質(zhì)量和單糖組成測定

MP分子質(zhì)量利用液相色譜結(jié)合高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）和示差檢測器測定，色譜柱為TSK G4000PWXL柱（7.8 mm×300 mm），流動(dòng)相為0.1 mol/L氯化鈉溶液，流速0.5 mL/min，液相色譜柱溫箱溫度35 ℃，MP質(zhì)量濃度為2 mg/mL，樣品過完0.45 μm膜后進(jìn)樣，進(jìn)樣量20 μL。

MP單糖組成根據(jù)Chen Guijie等[14]衍生化方法進(jìn)行測定。100 μL 6 mg/mL樣品溶液與100 μL 4 mol/L三氟乙酸溶液混合密封后在120 ℃條件下水解2 h，水解后入200 μL的甲醇后旋蒸。旋干后加入100 μL蒸餾水溶解并加入100 μL 0.6 mol/L NaOH溶液，充分混合取100 μL溶液與100 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液混合，并在70 ℃水浴中反應(yīng)100 min。衍生化反應(yīng)后加入鹽酸溶液（0.3 mol/L）進(jìn)行中和反應(yīng)。溶液旋蒸干后加入1 mL的去離子水復(fù)溶，同時(shí)加入1 mL的氯仿萃取并去除未反應(yīng)的PMP，最終得到溶液用于液相色譜檢測。流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）與乙腈按照體積比為83∶17的混合液，流速1 mL/min，檢測波長245 nm，色譜柱為Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為35 ℃，樣品進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.2 體外模擬腸道微生物厭氧發(fā)酵

MP的體外厭氧發(fā)酵模型按照Chen Guijie等[14]方法并稍作修改。4 位近半年內(nèi)沒有接受過抗生素治療且沒有胃腸道疾病的志愿者（年齡均在20～30 歲之間）提供新鮮糞便，將糞便樣品與改性生理鹽水（含9.0 g/L NaCl和0.5 g/L半胱氨酸鹽酸鹽）以1∶9比例稀釋后，500×g離心得到10%的菌群懸浮液。將0.5 g膽汁鹽、1 mg刃天青、4 g酵母提取物、0.46 g半胱氨酸鹽酸鹽、2 g蛋白胨、0.02 g血紅蛋白、10 μL VK1、2.0 mL吐溫80、0.04 g KH2PO4、2.0 g NaHCO3、0.1 g NaCl、0.01 g MgSO4、0.04 g K2HPO4、0.01 g CaCl2溶于1 L去離子水中，調(diào)節(jié)pH 7.0，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將1 mL 10%菌群懸浮液與9 mL含100 mg MP的基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合放入培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)入放有厭氧產(chǎn)氣包的MGC AnaeroPack?-Anaero厭氧盒中，37 ℃進(jìn)行厭氧發(fā)酵，不加碳源的作為空白對照（BLK），菊粉作為陽性對照（INL），發(fā)酵前樣本為ORI組，培養(yǎng)24 h后取樣用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 pH值和SCFAs的測定

發(fā)酵24 h后利用pH計(jì)測定不同組發(fā)酵液的pH值。利用氣相色譜測定不同組發(fā)酵液中的SCFAs水平（包括乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸和異戊酸）[15]。將2-乙基丁酸溶解到0.2 mol/L HCl溶液中，配制0.3 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，將樣品與內(nèi)標(biāo)溶液等體積混合、離心、過膜后用于氣相色譜檢測。色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；檢測器為火焰離子化檢測器；升溫程序：100 ℃并保持1 min，以5 ℃/min的速度升至180 ℃，保持4 min；氮?dú)猓∟2）作為載氣，流速19.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。

1.3.4 腸道微生物分析

體外發(fā)酵液10000×g離心后，利用糞便DNA提取試劑盒提取沉淀中細(xì)菌DNA，送到杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行16S rDNA序列測序，測序的原始數(shù)據(jù)通過Cutadapt、fastx、FLASH、Usearch軟件進(jìn)行質(zhì)控，按照97%的相似性歸并到一個(gè)可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），通過mothur軟件比對OTU和SILVA（Release 132,https://www.arb-silva.de/documentation/release-132/）數(shù)據(jù)庫確定種屬信息。利用R語言軟件（https://www.r-project.org/）計(jì)算腸道微生物的α多樣性和β多樣性。

1.3.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Wan Peng等[16]方法并稍作修改。復(fù)蘇后的RAW 264.7細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清、1%雙抗的DEME高糖培養(yǎng)基中，在5% CO2、溫度37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)5～6 代穩(wěn)定后，按照200 μL體積接入到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，棄掉舊培養(yǎng)基并加入200 μL含有質(zhì)量濃度為0、50、100、200、400、800、1000、1500、2000 μg/mL MP樣品的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后加入LPS溶液，使最終培養(yǎng)基中LPS質(zhì)量濃度為2 μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用細(xì)胞活力檢測法檢測MP對RAW 264.7細(xì)胞的毒性。按照上述方法，將RAW 264.7細(xì)胞接種在96 孔板中培養(yǎng)24 h后，利用不同質(zhì)量濃度（0、50、100、200、400、800 μg/mL）的MP處理2 h，加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用NO試劑盒檢測培養(yǎng)基中NO水平。按照上述方法，將1 mL的RAW 264.7細(xì)胞接種在12 孔板中，利用不同質(zhì)量濃度（0、50、100、200、400、800 μg/mL）的MP處理2 h，加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。利用細(xì)胞培養(yǎng)基將MP發(fā)酵液（初始MP質(zhì)量濃度10 mg/L）稀釋到相應(yīng)的MP質(zhì)量濃度，BLK和INL組也按照MP稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，按照上述方法評價(jià)MP、INL、BLK發(fā)酵液的抗炎活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SCFAs的抗炎癥活性，根據(jù)1.3.3節(jié)檢測結(jié)果，選取不同濃度的乙酸（5、10、15 mmol/L）、丙酸（5、10、15 mmol/L）和丁酸（2、4、6 mmol/L）進(jìn)行抗炎癥活性評價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 MP化學(xué)組成

對MP的化學(xué)組成進(jìn)行初步研究，MP中含有多糖（86.3±2.37）%、蛋白（14.6±1.45）%，利用Folin-Ciocalteu法未檢測到多酚含量。如圖1所示，利用液相色譜檢測MP的分子質(zhì)量為78 kDa，單糖組成分析結(jié)果表明MP主要由甘露糖和微量葡萄糖組成，其物質(zhì)的量比約為11.2∶1。

圖1 MP分子質(zhì)量HPGPC圖（a）及單糖混標(biāo)（b）、MP樣品PMP-衍生化產(chǎn)物（c）的HPLC圖Fig.1 HPGPC chromatogram of MP (a),and HPLC chromatograms of standard mixture of saccharides (b) and PMP derivatives of MP (c)

2.2 MP對腸道微生物多樣性的影響

利用Illumina Novaseq平臺(tái)對體外發(fā)酵樣品中細(xì)菌16S rDNA V3～V4區(qū)域進(jìn)行高通量測序，研究MP對腸道菌群的影響。表1顯示，BLK組具有較低的OTU數(shù)和Chao1指數(shù)（P＜0.05），因此，沒有碳源條件下菌群包含物種的數(shù)目顯著降低，然而BLK組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著高于其他組，說明BLK組腸道菌群多樣性高于其他組。MP組的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao1指數(shù)與ORI和INL組均沒有顯著差異（P＞0.05）。如圖2所示，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）、主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和基于Bray-Curtis距離的聚類分析評價(jià)不同處理組腸道菌群的結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一組樣品聚在一起而不同處理組樣品顯著分開，表明不同處理組腸道菌群結(jié)構(gòu)有顯著差異（P＜0.05），同時(shí)，INL組、MP組與ORI組樣品靠的比較近，說明這3 組腸道菌群結(jié)構(gòu)類似而與BLK組顯著不同，說明MP可能與菊粉具有類似的益生活性。

表1 MP對腸道微生物豐富性和α多樣性的影響Table 1 Effect of MP on the richness and α-diversity of gut microbiota

圖2 MP對腸道微生物β多樣性的影響Fig.2 Effect of MP on the β-diversity of gut microbiota

2.3 MP對腸道菌群組成的影響

圖3 顯示，不同組腸道菌群均由Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria組成。腸道菌群組成與其他文獻(xiàn)的結(jié)果一致[14]。然而，與ORI組相比，發(fā)酵后BLK組的Firmicutes相對豐度顯著增加，而Bacteroidetes相對豐度顯著降低進(jìn)而導(dǎo)致Firmicutes/Bacteroidetes比例顯著增加。而菊粉和MP的添加均可以顯著降低Firmicutes相對豐度，而顯著增加Bacteroidetes相對豐度，從而降低Firmicutes/Bacteroidetes比值。同時(shí)，BLK組的Proteobacteria顯著增加，而菊粉和MP均可以顯著降低Proteobacteria相對豐度，此外，菊粉可以顯著增加Actinobacteria的相對豐度，但MP對Actinobacteria沒有顯著影響。

圖3 MP對腸道微生物門水平組成的影響Fig.3 Effect of MP on the composition of gut microbiota at the phylum level

本研究選取在科水平相對豐度前20的腸道微生物做顯著性分析（表2），相比于ORI組，BLK組中擬桿菌科（Bacteroidaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、紅蝽菌科（Coriobacteriaceae）、Lactobacillaceae相對豐度顯著降低，而毛螺菌科（Lachnospiraceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、韋榮球菌科（Veillonellaceae）、薩特氏菌科（Sutterellaceae）、氨基酸球菌科（Acidaminococcaceae）、紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、梭桿菌科（Fusobacteriaceae）、疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）相對豐度顯著增加，然而菊粉和MP干預(yù)均可以逆轉(zhuǎn)BLK組的腸道菌群，其中INL和MP均可以增加Bacteroidaceae、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、Lactobacillaceae并且降低Lachnospiraceae、Enterobacteriaceae、Sutterellaceae、Porphyromonadaceae、Streptococcaceae、Fusobacteriaceae、Verrucomicrobiaceae、Erysipelotrichaceae，因此INL和MP具有相似的調(diào)節(jié)腸道菌群的活性，INL可以顯著增加雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）的增殖，而MP對Bifidobacteriaceae相對豐度沒有顯著影響。

表2 科水平相對豐度前20腸道微生物的比較分析Table 2 Comparative analysis of top 20 families with the largest relative abundance in gut microbiota%

對屬水平相對豐度前20的腸道微生物的進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3所示。相對于ORI組，發(fā)酵后BLK組的Bacteroides、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、Lachnospiracea_incertae_sedis、柯林斯氏菌（Collinsella）、羅斯氏菌屬（Roseburia）顯著降低，而Escherichia、Lachnospiraceae_unclassified、副薩特氏菌屬（Parasutterella）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、韋榮球菌屬（Veillonella）、克雷白氏桿菌屬（Klebsiella）、布勞特氏菌屬（Blautia）、鏈球菌屬（Streptococcus）、Clostridium_XlVb、Parabacteroides、梭菌屬（Fusobacterium）顯著升高。MP和INL組可以顯著調(diào)節(jié)Bacteroides、Esc her ic hia、Lac hnospira ce ae_uncla ssified、Parasutterella、Faecalibacterium、Klebsiella、Collinsella、Streptococcus、Clostridium_XlVb、Parabacteroides、Fusobacterium。因此，菊粉和MP在科和屬的水平都具有相似的益生活性。利用LEfSe對發(fā)酵后樣品（BLK、INL和MP組）相對豐度大于0.1%的OTU繼續(xù)進(jìn)行差異化分析，圖4結(jié)果表明，BLK、INL和MP組共有41 個(gè)差異OTU，其中BLK、INL和MP分別有20、12 個(gè)和9 個(gè)OTU顯著大于其他兩組，其中INL組有5 個(gè)OTU（OTU39795、OTU39651、OTU39814、OTU41158、OTU39766）屬于Bifidobacterium，均顯著增加，其中3 個(gè)OTU 鑒定為假小鏈雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum），1 個(gè)OTU鑒定為長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum），因此INL可以通過增加Bifidobacterium從而發(fā)揮其益生活性。MP主要增加了Bacteroides（OTU16459），同時(shí)可以顯著增加Veillonella（OTU97和OTU7744）、Clostridium_sensu_srticto（OTU47674）、Blautia（OTU46124）、Faecalibacterium（OTU43046）、Fusicatenibacter（OTU47625）、Butyricicoccus（OTU41468）。

表3 屬水平相對豐度前20腸道微生物的比較分析Table 3 Comparative analysis of top 20 genera with the largest relative abundance in gut microbiota %

圖4 利用LEfSe在OTU水平分析BLK、INL和MP組腸道微生物的差異Fig.4 Comparison of gut microbiota among the BLK,INL and MP groups at the OTU level using LEfSe

2.4 pH值和SCFAs的測定結(jié)果

膳食纖維在腸道中被腸道菌群利用并代謝成SCFAs，其中乙酸、丙酸和丁酸是腸道菌群代謝的主要代謝產(chǎn)物，并且SCFAs可以被人體吸收進(jìn)入內(nèi)循環(huán)進(jìn)而維持人體健康、預(yù)防各種疾病[17-18]。本研究測定了發(fā)酵后不同組發(fā)酵液中乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸和正戊酸的含量，從而了解腸道菌群對MP的代謝情況，并進(jìn)一步評價(jià)MP的健康活性。如圖5所示，乙酸、丙酸和丁酸是主要的代謝產(chǎn)物，其中INL可以顯著增加正丁酸和正戊酸的水平，而MP組乙酸和丙酸濃度顯著高于BLK和INL組（P＜0.05），同時(shí)，MP總酸含量顯著高于BLK和INL組，因此結(jié)果表明MP與INL具有促進(jìn)SCFAs的活性。檢測發(fā)酵后發(fā)酵液pH值，發(fā)現(xiàn)INL和MP組pH值均顯著低于BLK組（圖6），可能跟INL和MP生成大量SCFAs有關(guān)[14]。

圖5 發(fā)酵液中SCFAs含量Fig.5 Concentrations of SCFAs in fermentation both

圖6 發(fā)酵液中pH值的變化Fig.6 Changes in pH of fermentation broth

2.5 發(fā)酵液抗炎活性

很多研究表明膳食纖維可以調(diào)節(jié)炎癥[19]，因此，本研究利用細(xì)胞模型評價(jià)MP的抗炎癥活性。首先研究MP的細(xì)胞毒性和抗炎癥活性，圖7結(jié)果表明，MP在0～400 μg/mL范圍內(nèi)對RAW 264.7沒有顯著毒性，LPS可以顯著誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分泌NO，表明LPS可以顯著誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥，然而MP在低劑量（50～100 μg/mL）時(shí)可以稍微降低NO產(chǎn)量，而高劑量（200～400 μg/mL）對NO沒有顯著影響。因此，MP本身對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥調(diào)節(jié)活性有限，很多研究表明，膳食纖維可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物達(dá)到改善炎癥活性，同時(shí)SCFAs等腸道菌群的代謝產(chǎn)物具有抗炎活性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，MP可以顯著增加SCFAs的含量，因此本研究繼續(xù)利用LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7炎癥細(xì)胞模型評價(jià)MP代謝產(chǎn)物的抗炎活性。圖8表明，MP發(fā)酵液在稀釋到0～400 μg/mL范圍內(nèi)對RAW 264.7沒有顯著毒性，BLK和INL組稀釋到相同倍數(shù)時(shí)也沒有顯著細(xì)胞毒性。繼續(xù)檢測不同組發(fā)酵液對NO和炎癥因子TNF-α和IL-6分泌量的影響，結(jié)果表明BLK、INL和MP組的發(fā)酵液均可以劑量依賴性降低NO、TNF-α和IL-6的水平，BLK組效果較差，而INL和MP組在抑制炎癥因子釋放均體現(xiàn)出優(yōu)異的效果。

圖7 MP對RAW 264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力（a）和NO分泌量（b）的影響Fig.7 Effect of MP on the cell viability (a) and NO production (b) in RAW 264.7 macrophages

圖8 發(fā)酵液對RAW 264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力（a）、NO（b）、TNF-α（c）和IL-6（d）分泌量的影響Fig.8 Effect of fermentation broth on the cell viability (a),and the production of NO (b),TNF-α (c) and IL-6 (d) in RAW 264.7 macrophages

越來越多的研究表明膳食多糖的代謝產(chǎn)物SCFAs具有潛在抗炎癥活性，而乙酸、丙酸和丁酸是MP發(fā)酵后的主要的代謝產(chǎn)物。因此本研究繼續(xù)研究乙酸、丙酸和丁酸的抗炎癥活性，如圖9所示，乙酸、丙酸和丁酸均可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO釋放水平，同時(shí)丙酸和丁酸抗炎活性具有劑量依賴性，而乙酸雖然具有抗炎活性但是并沒有顯著劑量依賴性。因此本研究進(jìn)一步證明了MP發(fā)酵后的抗炎活性可能來源于SCFAs的增加。

圖9 乙酸、丙酸和丁酸對RAW 264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞NO分泌量的影響Fig.9 Effects of acetic acid,propionic acid and butyric acid on the production of NO in RAW 264.7 macrophages

3 討論

人體胃腸道中棲居著數(shù)以萬億計(jì)的微生物，并在腸道中形成了復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)[21]。腸道菌群與人體生理功能息息相關(guān)，比如可以抵御外源微生物入侵、促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育、營養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收等，然而腸道微生物失調(diào)會(huì)導(dǎo)致肥胖、糖尿病、心血管疾病、癌癥等各種疾病[3]。因此，維持腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)腸道健康對人體健康意義重大。膳食纖維作為調(diào)節(jié)腸道菌群的潛在益生元收到越來越多的重視，很多文獻(xiàn)報(bào)道，膳食纖維可以選擇性促進(jìn)Akkermansia、Lactobacillus、Bacteroides等有益菌的增殖、抑制Escherichia、Shigella等有害菌的增長，同時(shí)可以增加腸道中SCFAs濃度[22-24]。因此，挖掘具有腸道益生活性的膳食纖維對改善人們身體健康具有重要意義。

M P是由80%～95%甘露糖和5%～20%蛋白組成，是酵母細(xì)胞壁中重要的組成部分[25]。MP的研究主要集中在提取純化、乳化特性及在葡萄酒中的作用機(jī)制[25-27]，然而，酵母MP的發(fā)酵特性和益生活性并沒有相關(guān)報(bào)道，因此，本研究利用厭氧體外發(fā)酵模型研究酵母MP對腸道菌群的影響。結(jié)果表明，酵母MP可以顯著調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，在門水平，菊粉和MP的添加均可以著降低Firmicutes相對豐度，而顯著增加Bacteroidetes相對豐度，從而降低Firmicutes/Bacteroidetes比值。很多文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)irmicutes/Bacteroidetes比值與宿主的能量代謝相關(guān)，F(xiàn)irmicutes/Bacteroidetes比值增加，能增加宿主對能量的吸收進(jìn)而增加肥胖等代謝類疾病的風(fēng)險(xiǎn)[28-29]。因此菊粉和MP均具有通過調(diào)節(jié)腸道菌群從而改善宿主代謝健康的潛在活性，其中菊粉通過調(diào)節(jié)腸道菌群調(diào)節(jié)脂代謝的活性已經(jīng)被廣泛報(bào)道[30-31]，酵母中β-葡聚糖也被報(bào)道可以調(diào)節(jié)腸道菌群從而改善宿主代謝健康[32-33]，而MP調(diào)節(jié)脂代謝的活性需要進(jìn)一步的研究。Proteobacteria中含有Escherichia等多種有害病原體，通常被認(rèn)為是腸道菌群失調(diào)的微生物標(biāo)志，Proteobacteria增值與人類許多疾病正相關(guān)[32,34]。因此，MP可以通過抑制Proteobacteria增殖從而改善宿主健康。在科水平和屬水平，MP與菊粉都具有相似的調(diào)節(jié)腸道菌群的活性，不同的是菊粉可以顯著增加Bifidobacterium相對豐度包括B.pseudocatenulatum和B.longum，其中B.pseudocatenulatum[35-36]和B.longum[37-38]的活性已經(jīng)被廣泛報(bào)道，因此菊粉具有優(yōu)異的益生活性。而MP主要增加了Bacteroides、Veillonella、Clostridium_sensu_srticto、Blautia、Faecalibacterium、Fusicatenibacter、Butyricicoccus，其中Bacteroides可以水解利用膳食纖維并產(chǎn)生SCFAs[14,39-40]，Bacteroides具有免疫調(diào)節(jié)、降脂減肥等多種生物活性[41-42]。Blautia[43]、Faecalibacterium[44]、Butyricicoccus[45]的調(diào)節(jié)宿主健康的活性已經(jīng)被廣泛報(bào)道，因此，MP可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)Bacteroides等有益菌生長而抑制Escherichia有害菌增殖從而改善宿主健康。

不可消化的膳食纖維進(jìn)入結(jié)腸后被腸道菌群水解利用并代謝成SCFAs，SCFAs會(huì)被腸上皮細(xì)胞吸收作為能量來源，同時(shí)，一部分SCFAs進(jìn)入內(nèi)循環(huán)參加宿主的各種生命活動(dòng)[46-47]。因此，SCFAs的活性及其機(jī)制收到越來越多的關(guān)注，同時(shí)SCFAs水平也是評價(jià)益生元重要指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于BLK和INL組，MP可以顯著促進(jìn)乙酸、丙酸和總酸水平，其中乙酸和丙酸均是結(jié)腸中主要的SCFAs，在結(jié)腸中濃度約為10～100 mmol/L[20]。乙酸和丙酸可以通過激活G蛋白偶聯(lián)受體GPR43/FFAR2、GPR41/FFAR3、GPR109A/HCA2等發(fā)揮其活性[20,48]。因此MP可以通過增加結(jié)腸中SCFAs水平從而改善宿主健康。因此，繼續(xù)利用LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7炎癥細(xì)胞模型評價(jià)MP及代謝產(chǎn)物的抗炎活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MP自己本身并不能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥，而MP的發(fā)酵液可以顯著調(diào)節(jié)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，抑制NO和炎癥因子的水平，并且其抗炎活性可能來自于SCFAs作用。因此MP可能是通過調(diào)節(jié)腸道菌群及代謝產(chǎn)物發(fā)揮其活性的，然而實(shí)驗(yàn)結(jié)論需要進(jìn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一步驗(yàn)證。