謝水琪，張曉桐，靳奇文，劉利軍，孟祥晨

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

饅頭是中國北方人民日常食用的面制品。隨著人們消費水平的提升，人們不僅要吃得飽，而且要吃得好。傳統(tǒng)的白面饅頭具有高血糖生成指數(shù)的特點，并不適合所有人食用[1]。大部分雜糧屬于低血糖生成指數(shù)食品，含有優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，氨基酸組成模式也優(yōu)于精制小麥粉[2-3]。因此，將雜糧代替精制小麥粉用于研發(fā)低血糖生成指數(shù)的優(yōu)質(zhì)食品已經(jīng)成為食品領(lǐng)域的研究熱點。

目前，雜糧食品存在的主要問題是適口性不佳，且雜糧中存在諸多的抗?fàn)I養(yǎng)因子，如植酸、單寧等[4]，嚴(yán)重影響了雜糧食品的營養(yǎng)品質(zhì)和感官接受度。然而，乳酸菌發(fā)酵雜糧能夠改善雜糧制品的感官接受度，降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，提升營養(yǎng)特性[5-6]。乳酸菌作為一種具有益生作用的微生物，通常是以發(fā)酵劑的形式應(yīng)用到產(chǎn)品中[7]。有研究報道，乳酸菌作為發(fā)酵劑發(fā)酵雜糧不僅可以提升雜糧的營養(yǎng)品質(zhì)，還可以降解豆類蛋白，提升蛋白質(zhì)體外消化率[8]。De Pasquale等[9]在鷹嘴豆半液體面團(tuán)中添加乳酸菌Plantibacillus plantarumT0A10進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明鷹嘴豆面團(tuán)中抗性淀粉（resistant starch，RS）和總游離氨基酸含量顯著升高。另外，乳酸菌發(fā)酵能夠明顯改善雜糧面團(tuán)（multigrain dough，MD）的營養(yǎng)及感官品質(zhì)[10-11]。Li Li等[12]發(fā)現(xiàn)使用乳酸菌預(yù)發(fā)酵麥麩加入面團(tuán)中，對面包的整體特性有積極影響。因此，乳酸菌發(fā)酵劑可應(yīng)用于雜糧制品品質(zhì)和營養(yǎng)的提升。

本研究擬利用混合乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵雜糧面團(tuán)（fermented multigrain dough，F(xiàn)MD），探究發(fā)酵處理對OBG、RS及游離氨基酸含量的影響，分析不同面團(tuán)的微觀結(jié)構(gòu)差異，同時對饅頭的營養(yǎng)及感官評價進(jìn)行評估，旨在開發(fā)廣闊的雜糧資源，提升MD及雜糧饅頭（steamed multigrain bread，SMB）的品質(zhì)，為更多雜糧制品的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豌豆（經(jīng)蒸熟干燥粉碎后過60 目篩制成豌豆粉）馬培中食品股份有限公司；莜麥（經(jīng)粉碎后過60 目篩制成莜麥粉） 惠牛農(nóng)業(yè)（北京）有限公司；高筋小麥粉 河南新鄉(xiāng)市新良糧油加工有限責(zé)任公司；谷朊粉 安徽安特食品股份有限公司；燕麥β-葡聚糖（oatmealβ-glucan，OBG）（食品級） 欣爍生物科技有限公司；直投式發(fā)酵劑RP80（植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌）和YO-PROX-700（嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌） 普爾斯（天津）國際貿(mào)易有限公司；乳酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型） 碧云天生物技術(shù)有限公司；SAKURA 4583型櫻花OCT冷凍切片包埋劑、淀粉含量定量試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖含量定量試劑盒 南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HM730型和面機(jī) 青島漢尚電器有限公司；SPL-150型恒溫培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；TA.XT plus型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；UV-1500C型紫外-可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；LA-8080型氨基酸分析儀 日本日立公司；TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡 德國萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1 面團(tuán)的制備

FMD：將直投式發(fā)酵劑RP80和YO-PROX-700按照1∶1的比例混合，以0.15%接種量接種至雜糧粉基質(zhì)（豌豆粉與莜麥粉添加量均為16.00%，谷朊粉添加量22.86%，OBG添加量2.29%）水分添加量42.85%，使用和面機(jī)將面團(tuán)揉制光滑，于37 ℃發(fā)酵24 h，即得FMD。

MD：雜糧粉基質(zhì)配比與FMD一致，不添加乳酸菌發(fā)酵劑。

1.3.2 面團(tuán)pH值、可滴定酸度（total titratable acid，TTA）測定

參照馬子琳等[13]的方法。

1.3.3 有機(jī)酸的測定

參照曹偉超等[4]的方法。

1.3.4 OBG含量的測定

參照NY/T 2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定》的方法并稍作修改。分別稱取FMD與MD的凍干粉末0.01 g于2 支玻璃試管底部，向試管中添加0.2 mL 50%乙醇溶液，于旋渦混合儀上振蕩6 s，分散后加入4.0 mL的磷酸鈉緩沖溶液（20 mmol/L、pH 6.5）充分振蕩；將試管放入沸水浴中保持1 min，旋渦振蕩6 s后沸水浴中保持2 min，繼續(xù)旋渦振蕩處理數(shù)秒處理備用；將處理好的樣品放置50 ℃中保溫10 min，加入0.2 mL 50 U/mL葡聚糖酶溶液，振蕩6 s后50 ℃水浴60 min，在此期間取出試管振蕩處理3～4 次；水浴后添加5 mL 200 mmol/L乙酸鈉緩沖溶液，混合均勻，室溫冷卻10 min，3000 r/min離心10 min，分別取0.1 mL上清液至2 支試管底部，向其中1 支添加0.1 mL 2 U/mLβ-葡萄糖苷酶溶液，另一支試管添加0.1 mL 50 mmol/L乙酸鈉緩沖溶液作為空白。將上述試管在50 ℃保溫10 min，用葡萄糖定量試劑盒測定其中葡萄糖含量。OBG質(zhì)量分?jǐn)?shù)（干基）計算公式如下：

式中：G為葡萄糖定量試劑盒測定所得葡萄糖含量/μg；94為體積校正因子（9.4 mL取0.1 mL用于分析）；W為固體樣品質(zhì)量/g；0.9為葡萄糖轉(zhuǎn)化樣品為OBG的脫水轉(zhuǎn)換因子。

1.3.5 RS含量的測定

參考Muir[14]和任娜梅[15]等的方法并稍作修改。取FMD、MD兩種面團(tuán)凍干粉末，具體操作步驟如下：1）精確稱取100 mg干燥磨粉后的樣品于試管底部，加入4 mL酶混合溶液（包含10 mg/mL胰α-淀粉酶和3 U/mL淀粉葡萄糖苷酶），旋渦混勻。2）水平放置于恒溫培養(yǎng)箱中，與運動方向平行，37 ℃、200 r/min處理16 h。3）加入4 mL無水乙醇，旋渦混勻，3000 r/min離心10 min。4）轉(zhuǎn)移上清液，用2 mL 50%工業(yè)酒精（industrial methylated spirits，IMS）（含甲醇1%）懸浮沉淀并3000 r/min離心10 min，取沉淀并加入6 mL 50%的IMS溶液，混勻并3000 r/min離心10 min，合并上清液，重復(fù)此步驟2～3 次。5）在吸水紙上倒置試管，吸干水分。6）向沉淀中加入磁轉(zhuǎn)子和2 mL 2 mol/L的氫氧化鉀溶液，冰水浴攪拌并重懸浮沉淀20 min。7）邊攪拌邊向混合液中加入8 mL醋酸鈉緩沖溶液（pH 3.8），并立即加入0.1 mL 3300 U/mL淀粉葡萄糖苷酶溶液，50 ℃水浴處理30 min，期間間歇混勻。8）將7）中的混合液直接8000 r/min離心10 min，用葡萄糖定量試劑盒測定上清液中的葡萄糖含量（G）。RS質(zhì)量分?jǐn)?shù)=G×0.9。

1.3.6 激光共聚焦顯微觀察

分別取1 g FMD、MD，用冷凍包埋劑處理并固定于冷凍切片機(jī)專用托盤，-80 ℃冷凍1 h。將固定好的樣品切成15 μm薄片并置于黏附載玻片上，用丙酮為溶劑配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%羅丹明B和0.25%的異硫氰酸熒光素溶液，對切片染色1 min后用去離子水脫色，蓋上蓋玻片并用指甲油固定四周，置于激光共聚焦顯微鏡放大200 倍觀察。

1.3.7 游離氨基酸的測定

參照曹偉超等[4]的方法。

1.3.8 饅頭的制作

饅頭的配方如表1所示，制作流程：主料與輔料的準(zhǔn)備與稱質(zhì)量→原料調(diào)粉均勻→雜糧面粉其中一組使用發(fā)酵劑發(fā)酵（37 ℃、24 h）后3 種原料中均加入0.5%的安琪酵母溶液混合均勻→一次發(fā)酵（37 ℃、30 min）→分割搓圓→二次發(fā)酵（37 ℃）至體積1.5～2 倍大小→冷水上鍋蒸25 min。

表1 饅頭配方Table 1 Formulations of steamed bread

1.3.9 饅頭的營養(yǎng)評價

1.3.9.1 饅頭比容和質(zhì)構(gòu)的分析

比容：將制成的饅頭置于室溫冷卻1 h，采用小米置換法測定饅頭的體積，比容/（mL/g）=體積/質(zhì)量。

質(zhì)構(gòu)：參考Kou Xuerui等[16]的方法并稍作修改，饅頭冷卻1 h后，用切片刀將饅頭切成厚度為15 mm的饅頭片，取中間兩片，做3 個平行樣。利用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測定，測試條件設(shè)定為：探頭P/35型，壓縮率為50%，兩次壓縮間隔5 s，測前、測間、測后速率均為1 mm/s，起點感應(yīng)力為10 g。

1.3.9.2 總淀粉含量的測定

使用淀粉含量定量試劑盒測定。

1.3.9.3 蛋白質(zhì)含量的測定

參照曹偉超等[4]的方法。

1.3.9.4 蛋白質(zhì)體外消化率的測定

參照羅昆等[17]方法并稍作修改。取1 g饅頭芯囊的凍干樣品，加入15 mL 20 mg/mL的胃蛋白酶溶液（鹽酸調(diào)節(jié)pH 1.5），37 ℃振蕩2 h。用0.2 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.0，加入15 mL 5 mg/mL胰蛋白酶溶液，37 ℃振蕩1.5 h。加入5 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，混勻靜置1 h，10000 r/min離心15 min保留上清液。采用BCA試劑盒測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，體外蛋白消化率/%=上清液中蛋白質(zhì)含量/樣品中蛋白質(zhì)含量×100。

1.3.9.5 膳食纖維含量的測定

參照GB 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測定》進(jìn)行。

1.3.9.6 饅頭的感官評價

饅頭制作完成后，挑選10 名具有一定感官評定經(jīng)驗的學(xué)生（男女比例為1∶1）對饅頭的質(zhì)地、口感、外觀等進(jìn)行打分評價，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 饅頭感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of steamed bread

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013與GraphPad Prism 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制，所有數(shù)據(jù)均以表示，實驗重復(fù)3 次以上，SPSS 22進(jìn)行方差分析。P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMD pH值、TTA及有機(jī)酸的變化

乳酸菌酸化過程可顯著提升面團(tuán)中抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解以及營養(yǎng)物質(zhì)的部分水解，研究酸化過程具有重要意義。由圖1a可知，面團(tuán)在前10 h內(nèi)迅速酸化，隨后逐漸平緩，在20 h達(dá)到穩(wěn)定。圖1b表明，pH值降低是因為直投式發(fā)酵劑中的乳酸菌發(fā)酵過程中釋放乳酸和乙酸為主[18]，發(fā)酵24 h，乳酸和乙酸質(zhì)量濃度分別達(dá)到24.85 mg/mL和8.98 mg/mL，且有繼續(xù)上升趨勢，相比于乳酸，乙酸的緩沖范圍更廣，酸堿滴定時可以消耗更多的堿液[19]，因此相比預(yù)期的TTA值更大。另外乳酸菌的發(fā)酵過程形成的低pH值環(huán)境能夠有效延長食品保質(zhì)期，提升產(chǎn)品品質(zhì)[20]。

圖1 FMD發(fā)酵過程中pH值、TTA（a）及有機(jī)酸（b）的變化Fig.1 Changes in pH,TTA (a) and organic acids (b) during fermentation of sour dough

2.2 面團(tuán)中OBG和RS的含量變化

OBG作為一種可溶性膳食纖維，通過乳酸菌發(fā)酵其在MD中含量是否發(fā)生變化值得探索。此外，RS在人體消化道中能夠抵抗淀粉酶的消化，具有較低的胰島素反應(yīng)，且有一定可溶性膳食纖維的功能，對人體益處廣泛[21]，故本實驗著重研究OBG和RS含量的變化。由圖2可知，在直投式發(fā)酵劑中乳酸菌的發(fā)酵作用下，相比MD，F(xiàn)MD中的OBG含量下降32.56%，RS含量上升32.88%，說明乳酸菌在發(fā)酵過程中顯著降低了MD中OBG含量，這可能是由于OBG是一種可溶性膳食纖維，在發(fā)酵過程中受到乳酸菌的降解作用[22]；但是發(fā)酵過程顯著提高了雜糧粉面團(tuán)中的RS含量，與De等[8]研究結(jié)果一致。FMD中RS和OBG含量變化與最終產(chǎn)品的血糖生成指數(shù)及營養(yǎng)品質(zhì)有關(guān)[21]。

圖2 發(fā)酵前后MD中OBG和RS含量的變化Fig.2 Changes in OBG and RS contents in multigrain dough before and after fermentation

2.3 面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)的觀察

利用激光共聚焦顯微鏡研究乳酸菌發(fā)酵對面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)的影響，淀粉被染成綠色，蛋白質(zhì)被染成紅色，黃色是由綠色和紅色結(jié)合產(chǎn)生（圖3）。FMD中的蛋白質(zhì)和淀粉相互作用更明顯，說明乳酸菌發(fā)酵能夠顯著提升MD中淀粉與蛋白質(zhì)相互作用，相比MD，F(xiàn)MD中的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，間隙區(qū)域明顯減少，這可能是因為乳酸菌發(fā)酵過程中降解了豌豆蛋白和莜麥蛋白，且大分子纖維素發(fā)生降解，這些都有利于面筋網(wǎng)絡(luò)的形成[23]。此外，圖3中a、b所示處可能是莜麥細(xì)胞，在前期處理過程中，莜麥細(xì)胞保持完整，周圍邊緣部分是細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里空洞部分可能是未被染色的淀粉顆粒[24]。從圖3可以看出，相比MD，F(xiàn)MD中大顆粒細(xì)胞體明顯減少，說明乳酸菌發(fā)酵可能對植物細(xì)胞有一定的降解能力[25]。

圖3 發(fā)酵前后MD激光共聚焦微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Confocal laser scanning micrographs of multigrain dough before and after fermentation

2.4 面團(tuán)中游離氨基酸的含量

面團(tuán)中的游離氨基酸代表其營養(yǎng)價值，MD中蛋白質(zhì)在乳酸菌發(fā)酵作用下發(fā)生水解，有利于游離氨基酸的釋放。由圖4可知，F(xiàn)MD經(jīng)過24 h發(fā)酵后，游離氨基酸總量（203.08 mg/100 g）是MD的1.46 倍；必需氨基酸占總游離氨基酸比例也明顯升高，從MD的17.86%提高到30.68%。賴氨酸作為谷物中的第1限制性氨基酸，在谷物中含量極低，且在谷物加工中易分解[26]。經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后FMD中賴氨酸含量是MD的5.43 倍。本研究表明，在乳酸菌發(fā)酵作用下能夠顯著提升MD游離氨基酸含量，優(yōu)化MD中游離氨基酸的組成模式。

圖4 發(fā)酵前后MD中游離氨基酸含量Fig.4 Contents of free amino acids in multigrain dough before and after fermentation

2.5 饅頭比容和質(zhì)構(gòu)分析

比容和質(zhì)構(gòu)是評價饅頭質(zhì)量的客觀指標(biāo)，也是消費者選擇產(chǎn)品的重要依據(jù)。比容越大代表饅頭質(zhì)量越好。由表3可知，與SMB相比，SFMB的比容顯著提高，且接近于SWB。饅頭的比容取決于面團(tuán)中二氧化碳含量及面團(tuán)自身的流變學(xué)特性[27]，乳酸菌在發(fā)酵過程中分解大分子蛋白和纖維素，提高面團(tuán)的延展性，使得面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，利于二氧化碳的積累[28]。質(zhì)構(gòu)儀測試結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵顯著降低SMB的硬度和咀嚼性，但是SMB和SFMB的彈性、黏聚性及回復(fù)性無顯著差異。由圖5可知，SFMB氣室顯著比SMB更加均勻且細(xì)小，且接近于SWB，饅頭更加蓬松，顏色方面也有所改善，這可能是乳酸菌在發(fā)酵過程中降解了大分子蛋白和纖維素，促進(jìn)了面筋蛋白二硫鍵的形成[28]，該結(jié)果也從側(cè)面驗證了面團(tuán)的微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果。

表3 饅頭的比容和質(zhì)構(gòu)分析Table 3 Specific volume and texture properties of steamed bread

圖5 不同饅頭的切面圖Fig.5 Cross-sections of different steamed bread samples

2.6 饅頭的營養(yǎng)成分及感官評價分析

由表4可知，相比SMB，SFMB中總淀粉和蛋白質(zhì)含量有所下降，但差異不顯著，說明乳酸菌發(fā)酵對淀粉和蛋白質(zhì)含量的影響不明顯。SFMB和SMB的總膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于6%，符合GB 28050—2011《預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》對于高膳食纖維食品的定義，MD經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，總膳食纖維顯著降低，可溶性膳食纖維升高，但差異不顯著。難溶性膳食纖維顯著降低，原因可能是乳酸菌在發(fā)酵過程中把難溶性膳食纖維降解為可溶性膳食纖維，并將可溶性膳食纖維降解為葡萄糖等小分子加以利用[29]。因此，SFMB的難溶性膳食纖維降低為SMB的2.26 倍。乳酸菌在發(fā)酵過程中能夠激活雜糧機(jī)制中的天然纖維酶，其中內(nèi)切葡聚糖酶可將難溶性膳食纖維長鏈降解為可溶性小分子膳食纖維[30]。蛋白質(zhì)體外消化率表明，MD在乳酸菌發(fā)酵的作用下蛋白質(zhì)體外消化率有顯著提高，這可能是因為乳酸菌在發(fā)酵過程中降解了部分植酸、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)。此外，發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)發(fā)生部分水解使其對蛋白酶更加敏感[9]，且SFMB和SMB蛋白質(zhì)體外消化率均顯著低于SWB，這可能是因為MD中的膳食纖維和脂質(zhì)、淀粉與蛋白質(zhì)形成“蛋白質(zhì)-糖-油”膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低了蛋白質(zhì)與蛋白酶的接觸面積，從而降低了蛋白質(zhì)的體外消化率[31]。

表4 饅頭的總淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維含量及體外蛋白消化率Table 4 Total starch,protein and dietary fiber contents and in vitro protein digestibility of steamed bread%

由表5可知，相比于SMB，SFMB的外觀、色澤、結(jié)構(gòu)、氣味、回彈性、比容等得到了顯著提升，口感得分雖有提升但差異不顯著。SFMB的感官總評分顯著高于SMB，說明乳酸菌發(fā)酵使SMB的可接受性更高。

表5 饅頭感官評分Table 5 Results of sensory evaluation of steamed bread

3 結(jié)論

通過直投式混合乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵，有利于改善MD及SMB的品質(zhì)。在營養(yǎng)品質(zhì)方面，乳酸菌在發(fā)酵面團(tuán)過程中表現(xiàn)出很強(qiáng)的酸化能力，且酸化穩(wěn)定期長，有利于MD中乳酸菌代謝產(chǎn)物的積累。同時，乳酸菌發(fā)酵能夠顯著提高M(jìn)D中RS含量和蛋白質(zhì)體外消化率，降低OBG和難溶性膳食纖維含量，提高游離氨基酸總含量，優(yōu)化氨基酸組成模式。此外，乳酸菌發(fā)酵能夠加強(qiáng)MD中淀粉與蛋白質(zhì)的相互作用，降解大分子蛋白質(zhì)和纖維素。在感官評價方面，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后，饅頭感官指數(shù)顯著提升。本研究結(jié)果有助于了解混合乳酸菌發(fā)酵劑對MD及SMB所帶來的諸多變化，為發(fā)酵技術(shù)在雜糧制品中工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。