潘麗潔，王 斌，潘 力

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東 廣州 510006）

蛋白酶是目前重要的工業(yè)酶，約占全球酶總銷量的60%，具有極高的商業(yè)價值[1]，在食品發(fā)酵、脫苦、烘焙等行業(yè)有重要的應(yīng)用[2-5]。其中，胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）屬于絲氨酸蛋白酶，作為專一性切割的堿性水解酶，應(yīng)用于食品加工、生物醫(yī)藥、皮革加工等領(lǐng)域[6-7]。胰蛋白酶最早在動物胰臟中發(fā)現(xiàn)，作用是降解或活化其他蛋白酶原[8-9]。最初認(rèn)為胰蛋白酶只存在于脊椎和無脊椎動物中，隨著研究的深入，胰蛋白在原核和真核微生物中被發(fā)現(xiàn)[10-11]。通過微生物發(fā)酵獲得的胰蛋白酶濃度相對較高、易提純，因此通過微生物重組表達(dá)各種來源的胰蛋白酶成為當(dāng)前趨勢[12-16]。

來自金黃色葡萄球菌的胰凝乳蛋白酶SplB屬于絲氨酸蛋白酶家族，是胰蛋白酶樣蛋白酶。該蛋白具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤ELQut特異性切割活性，是一種理想的N端標(biāo)簽切除酶。Reed等[17]首次發(fā)現(xiàn)并獲得該蛋白的氨基酸序列。Popowicz等[18]通過大腸桿菌異源表達(dá)了蛋白酶SplB，并通過不同的表達(dá)方式確定該蛋白酶與其他胰蛋白一樣，改變N端氨基酸會極大的影響其活性。Dubin等[19]通過枯草芽孢桿菌表達(dá)蛋白酶SplB，分離純化后最終產(chǎn)量為2.5 mg/L。通過構(gòu)建并水解底物庫，發(fā)現(xiàn)蛋白酶SplB特異性識別WELQ（色氨酸-谷氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺）肽段并切割，同時通過X射線衍射揭示了SplB扭曲的活性中心，雖然折疊方式與胰凝乳蛋白酶相似，但SplB不需要前肽水解重排活性中心[20]且活性中心的空間位置使蛋白酶有與其他胰蛋白酶不同的切割傾向。Pustelny等[21]在WELQ肽段兩端連接發(fā)光基團(tuán)GST、YFP，并在WELQ肽段后添加不同氨基酸，確定了蛋白酶SplB不僅對P1位置嚴(yán)格限制，同時對P1’位置也有偏好性。在P1’位置，SplB更喜好極性不帶電氨基酸，如谷氨酰胺和天冬酰胺；其次是側(cè)鏈較小的氨基酸如甘氨酸和丙氨酸；而含有較大側(cè)鏈的疏水性氨基酸是最不利于反應(yīng)的。丁晨等[22]在枯草芽孢桿菌中表達(dá)了該蛋白，并篩選了最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件。取誘導(dǎo)前菌液OD600nm2.0、IPTG濃度0.5 mmol/L、誘導(dǎo)4 h時，獲得最高的表達(dá)量，純化后每升發(fā)酵液獲得16 mg蛋白，對比Dubin等[19]在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)，其產(chǎn)量提升了6 倍。在蛋白酶的最適反應(yīng)條件方面，Dubin等[19]以明膠、彈性蛋白、膠原蛋白、白蛋白和酪蛋白的熒光標(biāo)記衍生物為底物，測定蛋白酶SplB的酶學(xué)性質(zhì)，確定了SplB的最適pH值為8.0～8.5，在pH 7.0和pH 9.0時活性下降到50%。最適反應(yīng)溫度在37～42 ℃之間，當(dāng)溫度超過50 ℃，或低于15 ℃時，酶活力開始下降[19]。

由于蛋白酶SplB應(yīng)用在蛋白的標(biāo)簽切割時，反應(yīng)時間較長，商品酶反應(yīng)時間在1～16 h。因此在設(shè)置反應(yīng)條件時，應(yīng)貼合被切割蛋白的最佳保存條件，以最大程度保護(hù)被切割蛋白的生物活性。目前有關(guān)SplB的報道中，鮮見對蛋白酶SplB溫度以及pH值耐受性等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行完整研究的文獻(xiàn)，這嚴(yán)重限制了蛋白酶SplB的實際應(yīng)用場景。

因此，本研究利用自主研發(fā)的枯草芽孢桿菌宿主ATCC 6051Δ10和商業(yè)化宿主WB800，通過優(yōu)化表達(dá)元件，進(jìn)行胰凝乳蛋白酶SplB的重組表達(dá)，并進(jìn)一步研究重組SplB的酶學(xué)性質(zhì)，構(gòu)建SplB在重組蛋白Prx標(biāo)簽切割中的應(yīng)用體系，旨在為研究蛋白酶SplB在實際應(yīng)用中存在的問題提供解決思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

本研究使用的菌株及質(zhì)粒見表1。

表1 菌株及質(zhì)粒表 1 List of strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑

2×Premix PrimerSTAR Mix 日本TaKaRa公司；2×NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit 美國紐英倫生物技術(shù)公司；pMD-20 T載體/pMD-18 T載體日本TaKaRa公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物回收試劑盒 廣州美基生物科技公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒美基生物科技公司；WELQ-對硝基苯胺（4-nitroanilide hydrochloride，pNA）、N-苯甲?；?DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽（N-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide hydrochloride，BApNA） 南京肽業(yè)生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：取1 g氯化鈉、1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物，加入去離子水定容至100 mL，攪拌溶解后，調(diào)pH 7.0，固體培養(yǎng)基則再加入2 g瓊脂糖，121 ℃、20 min滅菌；SOC培養(yǎng)基：取3.14 g SOC粉末，加入去離子水定容至100 mL，攪拌充分溶解，116 ℃、30 min滅菌。

1.2 儀器與設(shè)備

垂直蛋白電泳系統(tǒng)、DNA凝膠電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；蛋白層析純化儀 蘇州賽譜儀器有限公司；5 mL鎳柱 美國Healthcare公司；多功能酶標(biāo)儀 德國BMG公司；96 孔酶標(biāo)板 美國康寧公司；電轉(zhuǎn)儀達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司；高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 以pBEs101質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建表達(dá)載體骨架

實驗室保藏質(zhì)粒pBEs101包括雙啟動子P43P43、信號肽SamyQ、RBS位點、終止子Ter、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體通用骨架pBE。通過酶切去除重復(fù)啟動子，獲得單P43通用載體pBEs1011，通過XhoI和XbaI雙酶切獲得表達(dá)載體骨架。

1.3.2SplB表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

根據(jù)UniProt上SplB氨基酸序列，經(jīng)過枯草密碼子優(yōu)化后送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成目的基因，根據(jù)序列信息設(shè)計引物PCR擴(kuò)增分別獲得N端帶Histag、C端帶His-tag和不帶His-tag的3 種目的基因SplB片段（SplB、SplB-His、His-SplB），通過無縫克隆技術(shù)（2×NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit）表達(dá)載體骨架獲得SplB的表達(dá)載體。通過更換表達(dá)載體的啟動子（PamyX、PamyLPspovG、PxylR），構(gòu)建不同啟動子的SplB表達(dá)載體。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大腸桿菌感受態(tài)通過SOC培養(yǎng)基復(fù)蘇，并進(jìn)行測序驗證，使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)克隆正確的轉(zhuǎn)化子。驗證正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌ATCC 6015Δ10、WB800，將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接裝有LB培養(yǎng)基（含卡那霉素）的24 孔板中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后收集菌體、提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.3.3 SplB重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱取出一管保藏的菌液，接入3 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)16 h，作為一級種子液。取1 mL轉(zhuǎn)接入20 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)9～10 h，使菌液處于對數(shù)生長期，作為二級種子液。取二級種子液測菌液OD600nm值，并按等OD600nm值將二級種子液接入100 mL LB搖瓶培養(yǎng)基中（約5%接種量），37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，結(jié)束發(fā)酵。

1.3.4 胰凝乳蛋白酶活力測定

參照Yang Ning等[23]方法設(shè)計底物WELQ-pNA，底物由南京肽業(yè)生物科技有限公司合成。為了更好地對比不同條件下酶活力的差異，參考林曉彤[24]的方法，定義每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μg pNA所需的酶量為1 個酶活力單位。

1.3.4.1 pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取1 g左右pNA于烘箱中徹底烘干，烘干后用分析天平精確稱量0.1381 mg pNA，溶于30 mL水中，后定容至1 L，得到1 mmol/L pNA母液。后將母液稀釋至0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12 mmol/L。吸取200 μL混合液置于96 孔酶標(biāo)板，測405 nm波長處的吸光度。以吸光度為橫軸、濃度為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 酶活力測定

酶活力測定實驗均重復(fù)3 次，且采用方差分析其差異顯著性，P＞0.5表明實驗結(jié)果可靠。將酶液均分于兩個EP管中，每管200 μL分別為實驗組和對照組。實驗組于40 ℃水浴保溫，對照組在沸水浴15 min使之失活。實驗組與對照組皆在40 ℃水浴保溫5 min，取出加入750 μL Tris-HCl（100 mmol/L，pH 8.0），加入50 μL 10 mmol/L的WELQ-pNA溶液，吹吸混勻。對照組提前加入100 μL 50%乙酸溶液，終止反應(yīng)。將實驗組與對照組皆置于40 ℃水浴反應(yīng)30 min，取出反應(yīng)液，在實驗組中加入100 μL 50%乙酸溶液，結(jié)束反應(yīng)。吸取200 μL反應(yīng)液于酶標(biāo)板，每個反應(yīng)測3 組。用酶標(biāo)儀測405 nm波長處的吸光度。酶活力計算公式如下：

式中：A為實驗組與對照組平均吸光度差對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的pNA濃度/（mmol/L）；138.12為pNA分子質(zhì)量（g/mol）；N為發(fā)酵液稀釋的倍數(shù)；5.5為反應(yīng)總體系對酶液的稀釋倍數(shù)；T為反應(yīng)時間/min。

1.3.5 蛋白純化與酶學(xué)性質(zhì)檢測

1.3.5.1 蛋白純化

發(fā)酵液預(yù)處理：將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液均分于100 mL離心管中，配平，4 ℃、12000 r/min離心10 min，收集上清液。用0.45 μm濾頭過濾上清夜，該步驟于冰上操作。

鎳柱親和層析：ddH2O沖洗系統(tǒng)，沖洗至紫外線水平，裝鎳柱；Buffer A液沖洗柱子至基線平衡。上蛋白粗酶液約30 mL，并收集上樣峰；5% Buffer B液洗脫雜蛋白，后按10%梯度遞增Buffer B液，洗脫蛋白，并收集各個組分出峰時的流出液。

1.3.5.2 酶學(xué)性質(zhì)

溫度對SplB活力的影響：在pH 8.0條件下，4～70 ℃范圍內(nèi)，測定不同溫度條件下SplB活力，確定最適反應(yīng)溫度。

pH值對SplB活力的影響：在最適反應(yīng)溫度條件下，pH 2.0～11.0范圍內(nèi)測定SplB活力，確定最適反應(yīng)pH值。體系中的底物與酶液量不變，反應(yīng)緩沖液替換為不同pH值的緩沖液。其中pH 2～6、10～11為Btitton-Robinson緩沖液，pH 7～9由Tris-HCl配制。

SplB熱穩(wěn)定性：將純化后SplB酶液稀釋一定倍數(shù)，在10～70 ℃范圍的水浴鍋和金屬浴中孵育0～4 h，在最適反應(yīng)溫度和最適pH值下，測定孵育不同時間后SplB活力。SplB pH值穩(wěn)定性：于4 ℃冰箱中，將純化后的酶液在pH 2.0～12.0范圍的沖液中孵育7 d，每隔一段時間取出一部分酶液，在最適條件下測定孵育不同時間后SplB活力。

金屬離子和化學(xué)物質(zhì)對SplB活力的影響：用pH 8.0的Tris-HCl配制K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+等金屬離子溶液，獲得500 mmol/L母液；后再根據(jù)需要稀釋成50 mmol/L和5 mmol/L濃度的溶液。用pH 8.0的Tris-HCl配制不同化學(xué)物質(zhì)母液（乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）），使得各種化學(xué)物質(zhì)濃度分別為100、20 mmol/L和20 mmol/L。再根據(jù)需要稀釋成不同濃度溶液。反應(yīng)體系為700 μL Tris-HCl（100 mmol/L，pH 8.0），加入50 μL 10 mmol/L的WELQ-pNA、50 μL酶液、50 μL不同稀釋度的離子或化學(xué)溶液，在最適反應(yīng)溫度與pH值下測定SplB活力。

1.3.6 蛋白酶SplB在標(biāo)簽切割中的應(yīng)用

1.3.6.1 TrxA標(biāo)簽蛋白的構(gòu)建

為驗證蛋白酶SplB的實際應(yīng)用價值，構(gòu)建了一種N端帶有TrxA標(biāo)簽的過氧化物酶Prx，且在Prx與TrxA之間加入WELQ肽段，以驗證SplB切割TrxA標(biāo)簽的效果。將過氧化物酶Prx構(gòu)建到pET32a載體，在Prx的C端添加His-tag，轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建Prx大腸桿菌工程菌株。通過鎳柱親和層析獲得胞內(nèi)表達(dá)的蛋白Prx，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鑒定目的蛋白。

1.3.6.2 SplB蛋白切割Prx的應(yīng)用

通過BCA試劑盒測定蛋白濃度，按100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1的比例添加Prx與SplB，室溫反應(yīng)20 h。聚丙烯酰胺凝膠電泳，確定最佳反應(yīng)比例。反應(yīng)結(jié)束后通過SDS-PAGE分析切割效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

酶活力實驗均復(fù)3 次，取其平均值，且采用方差分析其差異顯著性，P＞0.5表明實驗結(jié)果可靠，并通過Origin繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰凝乳蛋白酶SplB的重組表達(dá)及表達(dá)元件、宿主優(yōu)化

2.1.1 胰凝乳蛋白酶SplB的生物信息學(xué)分析

金黃色葡萄球菌絲氨酸蛋白酶SplB，在MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫分類為胰凝乳蛋白酶家族S1（Family S1）中S1B亞家族的特征性肽酶S01.282，搜尋了Uniprot數(shù)據(jù)庫中注釋為絲氨酸蛋白酶SplB的基因，并同時在Swiss-Prot注釋過的14 個SplB基因進(jìn)行同源比對（圖1）。絲氨酸蛋白酶SplB包含240 個氨基酸，其中前36 個氨基酸為信號肽（圖中粉紅色標(biāo)注），其催化活性中心為催化三聯(lián)體組氨酸、天冬氨酸和絲氨酸（75H、113D、193S，圖中紅色標(biāo)注），活性中心保守。其中，Uniprot Q2FXC3的絲氨酸蛋白酶SplB已完成了晶體結(jié)構(gòu)解析[20]。SplB屬于胰凝乳蛋白酶家族，一般而言，胰凝乳蛋白酶酶原通過水解N端前肽，重排活性中心的結(jié)構(gòu)激活，只有精確的N末端加工才能釋放野生型蛋白酶的全部水解活性，但激活蛋白酶SplB的分子機(jī)制存在顯著差異，其酶原和成熟體的晶體結(jié)構(gòu)比較未發(fā)現(xiàn)活性位點重排，但是天然信號肽或任何N端延伸對SplB具有抑制作用[18]。

圖1 Uniprot數(shù)據(jù)庫中注釋為SplB基因的同源比對Fig.1 Homologous alignment of the SplB gene annotated as a serine protease in the Uniprot database

2.1.2 His-tag位置對SplB活力的影響

為了重組SplB的純化，需要在重組蛋白上添加Histag。分別構(gòu)建了N端、C端添加His-tag的重組SplB菌株。重組菌株發(fā)酵上清液酶活力測定結(jié)果顯示（圖2），N端帶His-tag的酶活力最低，而C端帶His-tag的菌株與不帶His-tag的菌株酶活力差別不大，這與文獻(xiàn)[19,25]的結(jié)論一致，即SplB的N端是其重要結(jié)構(gòu)域，而C端相對不重要。

圖2 3 種表達(dá)方式的SplB活力測定Fig.2 Enzyme activities of SplB gene transformants with His-tag at different terminals

2.1.3 重組SplB的表達(dá)元件及宿主優(yōu)化

為提高SplB的表達(dá)水平，對重組表達(dá)宿主和啟動子進(jìn)行了篩選。分別構(gòu)建了以P43、PamyX、PamyLPspovG、PxylR作為啟動子的SplB表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌宿主菌WB800、ATCC6051Δ10。對所得重組SplB菌株進(jìn)行發(fā)酵并測定發(fā)酵液的酶活力，圖3、4結(jié)果顯示，相同啟動子的重組菌株在發(fā)酵相同時間條件下，以ATCC6051Δ10作為宿主的重組菌株酶活力均高于以WB800為宿主的菌株，說明ATCC6051Δ10宿主更適合蛋白酶SplB的表達(dá)。同時，啟動子P43介導(dǎo)的SplB重組表達(dá)活力最高，達(dá)到10.24 U/mL。

圖3 不同宿主發(fā)酵液SplB活力測定Fig.3 Enzyme activities of SplB expressed in different hosts

圖4 不同宿主發(fā)酵液SDS-PAGE圖Fig.4 SDS-PAGE patterns of SplB expressed in different hosts

2.2 重組SplB的純化與酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 重組SplB的純化及最適反應(yīng)條件分析

通過His-tag親和純化重組SplB菌株的發(fā)酵上清液，純化過程見圖5，SDS-PAGE結(jié)果顯示發(fā)酵上清液純化過程中的峰2、峰3洗脫液為雜蛋白，峰4為目標(biāo)蛋白SplBHis，蛋白酶SplB在40% Buffer B處出峰，對應(yīng)的咪唑洗脫濃度為200 mmol/L。

圖5 SplB-His蛋白酶洗脫峰與SDS-PAGE圖Fig.5 Chromatographic separation and SDS-PAGE pattern of SplB

圖6結(jié)果顯示，重組SplB的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，且在10～60 ℃范圍內(nèi)可維持80%以上酶活力，酶活力變化不明顯。重組SplB的最適反應(yīng)pH值為8.5，在pH 7～9.5范圍內(nèi)酶活力維持在80%以上。當(dāng)pH值大于10或低于5時，酶活力急劇下降。從該結(jié)果看，SplB的適用溫度與pH值范圍寬廣，應(yīng)用潛力高，具有較大的商業(yè)應(yīng)用價值。

圖6 SplB蛋白酶最適溫度及pH值Fig.6 Optimal temperature and pH of SplB protease

2.2.2 重組SplB的穩(wěn)定性

圖7結(jié)果顯示，在不同溫度下溫育相同時間，其酶活力變化趨勢一致。并且短時間內(nèi)，60 ℃孵育可小幅提高酶活力。繼續(xù)孵育后酶活力開始下降，但下降幅度較小，同條件下10 ℃、5 h孵育酶活力下降最大，降至74%。說明溫度對SplB活力影響不大，SplB可在不同溫度條件下保留較長時間而極少損失酶活力，具有非常好的溫度穩(wěn)定性。pH值穩(wěn)定性結(jié)果顯示，除在pH 8.0條件下，SplB在其他pH值條件下溫育4 h時，酶活力反而升高，其中中性條件下酶活力漲幅最大，達(dá)到初始酶活力的124%。之后酶活力慢慢下降。并且下降幅度較小，其中酶活力下降最多的條件為pH 8.0溫育100 h，酶活力下降為初始酶活力的86%。以上結(jié)果說明重組蛋白酶SplB具有非常好的pH值穩(wěn)定性，特殊pH值條件孵育較短時間甚至可以提高相對酶活力，此性能賦予SplB較廣的應(yīng)用場景，提高了SplB的商業(yè)應(yīng)用潛力。

圖7 SplB蛋白酶pH值與溫度耐受性Fig.7 pH and temperature tolerance of SplB protease

2.2.3 金屬離子與化學(xué)試劑對重組蛋白酶SplB活力的影響

為研究金屬離子與化學(xué)試劑對重組SplB活力的影響，用溶解了離子和化學(xué)試劑的Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液稀釋蛋白酶液作為實驗組，以未溶解離子和化學(xué)試劑的Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液稀釋蛋白酶液作為對照組，對照組酶活力設(shè)為100%。在離子濃度比較高（5 mmol/L）的情況下（表2），金屬離子對其活力都有抑制作用。在離子濃度較低情況下，Co2+對SplB活力有促進(jìn)作用，Mg2+、K+不影響酶活力。而Cu2+、Zn2+、Ni+離子抑制SplB活力，其中，Ni+在低濃度下（1 mmol/L）下抑制作用不明顯，濃度升高后，抑制作用同時提高。另外，SDS可以極大地抑制重組SplB的酶活力，而傳統(tǒng)的絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF卻對重組SplB活力有促進(jìn)作用。

表2 不同濃度離子和化學(xué)物質(zhì)對重組SplB相對酶活力的影響Table 2 Effects of metal ions and chemical reagents on the activity of recombinant SplB%

2.3 重組蛋白酶SplB在重組蛋白Prx標(biāo)簽切割中的應(yīng)用

2.3.1 帶標(biāo)簽的Prx重組蛋白的純化

為了獲得純化的帶標(biāo)簽蛋白Prx，進(jìn)行蛋白標(biāo)簽的切割。通過超聲破碎Prx大腸桿菌工程菌，獲得胞內(nèi)表達(dá)的Prx蛋白溶液。重組Prx蛋白的N端帶有His-tag，大小為39.7 kDa，通過鎳柱親和層析純化該蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示（圖5），當(dāng)Buffer B達(dá)到70%時，蛋白被洗脫，且在80%、90%均有洗脫峰，70%洗脫濃度最大。

2.3.2 重組蛋白酶SplB應(yīng)用于切割Prx蛋白標(biāo)簽

將SplB與帶有WELQ肽段的Prx蛋白按不同質(zhì)量濃度混合，室溫反應(yīng)20 h，通過SDS-PAGE檢測切割效果，以確定蛋白酶SplB的作用。Prx與SplB添加量見表3。WELQ肽段添加在Prx與TrxA基因之間（圖8A），使得酶切蛋白大小分別為18.15、21.12 kDa。切割結(jié)果顯示（圖8B），蛋白酶SplB具有標(biāo)簽切割作用，并且蛋白酶SplB濃度越高，酶切效果越好。

表3 重組Prx蛋白與SplB蛋白的添加量Table 3 Dosages of recombinant Prx and SplB μL

圖8 重組蛋白酶SplB在重組蛋白Prx標(biāo)簽切割中的應(yīng)用Fig.8 Application of recombinant SplB in the tag digestion of recombinant protein Prx

2.4 重組蛋白酶SplB與商品酶在重組蛋白Prx標(biāo)簽切割中的對比

為了對比商品酶和重組蛋白酶SplB的切割效率，將商品酶稀釋至與SplB相同的濃度，分別和帶有WELQ肽段的Prx蛋白按1∶5混合，并延長反應(yīng)時間至48 h，通過SDS-PAGE檢測切割效果，圖9顯示，兩組Prx蛋白都被切割為短肽，且蛋白酶SplB的標(biāo)簽切割效果與商品酶相近。說明本研究獲得的蛋白酶SplB與在售商品酶性質(zhì)相當(dāng)。

圖9 重組蛋白酶SplB與商品酶在重組蛋白Prx標(biāo)簽切割中的對比Fig.9 Comparison of SplB and commercial enzyme in tag cleavage of recombinant protein Prx

3 討論

胰蛋白酶從被發(fā)現(xiàn)開始，在食品、藥品等領(lǐng)域就獲得廣泛應(yīng)用。因自然界中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)胰蛋白酶來源于哺乳動物，產(chǎn)量低，純化復(fù)雜，使得重組蛋白酶的研究成為一大熱點。哺乳動物來源的胰蛋白酶，因自身蛋白修飾系統(tǒng)復(fù)雜，難以在細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對簡單的微生物中大量表達(dá)，同時哺乳動物來源蛋白酶在藥品領(lǐng)域，始終存在容易引發(fā)免疫應(yīng)答的風(fēng)險。Yee等[26]通過大腸桿菌重組表達(dá)了鼠來源的胰蛋白酶；Viader-Salvadó等[27]在畢赤酵母中重組表達(dá)了對蝦來源的胰蛋白酶。微生物異源表達(dá)胰蛋白酶解決了其純化困難與免疫原性的問題，但動物來源胰蛋白在微生物中產(chǎn)量相對于其他的蛋白酶仍舊低下。因此，尋找微生物來源的類胰蛋白酶，大量表達(dá)代替動物來源的胰蛋白酶，具有非常重要的研究價值。蛋白酶SplB來源于金黃色葡萄球菌，是一種致病菌，本研究利用實驗室自主研發(fā)的枯草芽孢桿菌宿主，表達(dá)重組胰蛋白酶。根據(jù)Guan Chengran等[28]的研究，枯草芽孢桿菌為食品安全菌，且在表達(dá)堿性蛋白上具有優(yōu)勢以枯草芽孢桿菌為宿主，在解決安全性的同時，確保了重組蛋白酶的表達(dá)水平（粗酶液活力10.24 U/mL）。本研究通過枯草芽孢桿菌表達(dá)純化獲得蛋白酶SplB，以研究其酶學(xué)性質(zhì)。

重組SplB的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH值為8.5，與Popowicz等[29]研究結(jié)果一致。本研究獲得的蛋白酶SplB在溫度10～60 ℃、pH 7～9.5范圍內(nèi)可維持80%以上酶活力，酶活力變化不明顯。而Popowicz等[29]研究結(jié)果表明蛋白酶在pH 7.0和pH 9.0時活性下降到50%；在溫度超過50 ℃，或低于15 ℃時，酶活力開始下降，相比之下本研究獲得的蛋白酶SplB溫度和pH值適用范圍更廣。造成該現(xiàn)象的原因尚未可知，在Pustelny等[21]研究中，蛋白酶SplB對底物的空間位阻有所要求，以及P1’位置的氨基酸有偏好性，因此筆者推測兩者使用的底物不同造成了數(shù)據(jù)差異。除Co2+、Cu2+、Zn2+外，多數(shù)陽離子以及金屬螯合劑EDTA-Na2對蛋白酶SplB活力無顯著影響。值得注意的是，常見的胰蛋白酶抑制劑PMSF對蛋白酶SplB無抑制作用，該結(jié)果與已有研究[29-30]結(jié)論一致。

為模擬蛋白酶SplB的真實應(yīng)用場景，本研究設(shè)計了帶有WELQ標(biāo)簽的重組Prx蛋白。通過酶切實驗發(fā)現(xiàn)，該蛋白在實際應(yīng)用中的標(biāo)簽切割效率較低，實際反應(yīng)時間較長，且單次蛋白酶用量高。因此在反應(yīng)過程中，應(yīng)盡量將反應(yīng)條件保持在適合被切割蛋白保存的范圍內(nèi)。根據(jù)本研究獲得的酶學(xué)性質(zhì)數(shù)據(jù)，重組蛋白酶SplB廣泛的溫度和pH值適應(yīng)性以及高度溫度和pH值耐受穩(wěn)定性、對鹽離子的耐受性等性質(zhì)，為蛋白酶SplB在實際場景中的靈活選擇提供參考。同時，蛋白酶SplB的高度穩(wěn)定性，表明該蛋白重復(fù)利用的可行性。繼續(xù)研究蛋白的回收再利用以減少單次使用成本，同時減少對被切割蛋白的污染，可以進(jìn)一步提高該蛋白在商業(yè)應(yīng)用中的潛力。

胰凝乳蛋白酶類蛋白酶屬于絲氨酸家族，是一種具有專一性水解活性的堿性內(nèi)肽酶。SplB為非典型胰凝乳蛋白酶，無前肽，胞外表達(dá)的蛋白酶即為活性酶，且具有WELQ肽段專一性識別與切割活性。本研究通過啟動子優(yōu)化、宿主篩選，成功重組表達(dá)了絲氨酸蛋白酶SplB，對純化的重組蛋白酶SplB酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并實現(xiàn)了重組蛋白酶SplB在重組蛋白Prx標(biāo)簽切割中的應(yīng)用。