李夢瑤，梁 琪,*，宋雪梅

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

α-淀粉酶是消化系統(tǒng)中的一種關鍵酶，抑制α-淀粉酶的活性可阻止碳水化合物水解為可吸收的單糖，降低餐后血糖水平，達到預防和治療II型糖尿?。╠iabetes mellitus type 2，T2DM）的目的[1]。Ganesan[2]和Ummuhan[3]等發(fā)現(xiàn)阿卡波糖、米格列醇等藥物可作為α-淀粉酶抑制劑用于治療T2DM，但長期使用此類藥物會導致腹痛腹瀉等不良癥狀。近年來，國內(nèi)外研究人員從天然食物蛋白水解物中提取的α-淀粉酶抑制肽成為治療T2DM的研究熱點，發(fā)現(xiàn)肽可通過占據(jù)α-淀粉酶的活性位點減少碳水化合物的消化[4-6]。

生物活性肽存在于蛋白質(zhì)序列中，經(jīng)酶解和微生物發(fā)酵等方式得以釋放[7]。干酪成熟期間在發(fā)酵劑和凝乳酶的作用下，產(chǎn)生了具有多種功能的生物活性肽[8]。同時，干酪蛋白質(zhì)的降解會產(chǎn)生大量苦味肽，研究表明肽的苦味源自Leu、Gln、Ile和Pro等疏水性氨基酸，這些疏水性氨基酸又與肽的生物活性密切相關[9-11]。牦牛乳干酪是高原地區(qū)居民傳統(tǒng)食物，成熟時間可達6 個月至2 年，更易產(chǎn)生大量肽序列。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)牦牛乳干酪苦味肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性、抗氧化活性及抑菌活性，然而關于牦牛乳干酪苦味肽的α-淀粉酶抑制活性及其作用機制的研究還處于空白階段。

ExPASy-ProtParam、Innovagen和Biopep-UWM數(shù)據(jù)庫等生物信息學工具和分子對接技術可以高效準確地預測肽的生物活性。根據(jù)肽的結構特征及基本理化性質(zhì)研究其對生物活性的影響，并且能通過分子對接技術分析肽與受體蛋白之間的相互作用，闡明生物活性肽的作用機制[12-13]。楊保軍等[14]利用生物信息學方法研究了牦牛乳源抑菌肽的分子機制。

本實驗利用課題組前期鑒定的牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7，通過生物信息學工具分析肽的理化性質(zhì)及序列特征，結合分子對接闡明α-淀粉酶抑制肽的作用機制，并進行體外活性實驗，為α-淀粉酶抑制肽的作用機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RK7和KQ7由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；α-淀粉酶、3,5-二硝基水楊酸 上海麥克林生化科技有限公司；阿卡波糖 石藥集團歐意藥業(yè)有限公司；可溶性淀粉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酒石酸鉀鈉、結晶苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純） 天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

VersaMax酶標儀 美國Molecular Devices公司；VM-500S渦旋混合器 群安實驗儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；FR224CN電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；HWS26恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司；Discovery Studio Client v16.1.0（DS） 美國Accelys公司；ChemBioDraw Ultra 11.0美國Cambridge Soft公司。

1.3 方法

1.3.1 生物活性及理化性質(zhì)的預測

利用Innovagen、PepDraw和ExPASy ProtParam等生物信息學工具預測肽的分子質(zhì)量、等電點、疏水性和疏水氨基酸比例等基本理化性質(zhì)[15]。

1.3.2 配體和受體的準備

RK7與KQ7的結構式如圖1所示。使用ChemBioDraw Ultra 11.0構建肽RK7和KQ7的二維結構，使用DS軟件中CHARMm程序進行能量最小化處理，使用Prepare Ligands程序優(yōu)化肽RK7和KQ7結構。

圖1 RK7與KQ7的分子結構Fig.1 Molecular structures of RK7 and KQ7

α-淀粉酶三維結構圖見圖2。從RCSB Protein Date Bank（PDB，http://www.Pdb.org）中下載α-淀粉酶（PDB: 3BAJ）蛋白晶體的X射線三維結構[16]。使用Discovery Studio 2016軟件打開PDB文件，刪除其3D晶體結構的水分子和雜原子，通過Macromolecules模塊中的“Clean Protein”優(yōu)化蛋白質(zhì)構象，去除蛋白多構象[17]。

圖2 α-淀粉酶三維結構Fig.2 Three-dimensional structure of α-amylase

1.3.3 分子對接

利用DS軟件中的LibDock模塊，選擇阿卡波糖（陽性對照）的活性位點，坐標為（X：10.1522，Y：15.8388，Z：41.1172，R：10.2578 ?），將肽RK7和KQ7與α-淀粉酶（PDB：3BAJ）進行LibDock對接。

1.3.4 肽RK7和KQ7的合成及α-淀粉酶抑制活性的測定

采用固相合成法對肽RK7和KQ7進行合成，并通過液相色譜-質(zhì)譜分析合成肽的純度和分子質(zhì)量。肽的合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

α-淀粉酶抑制活性采用DNS比色法測定[18]，并根據(jù)下式計算α-淀粉酶抑制率：

式中：ODS為樣品組光密度值；ODSB為樣品空白組光密度值；ODC為對照組光密度值；ODB為空白組光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個樣品重復3 次，使用SPSS進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 肽RK7與KQ7理化性質(zhì)預測

如表1所示，RK7分子質(zhì)量為875.07 Da，等電點為11.57，凈電荷為3，RK7含有3 個疏水性氨基酸，分別為Pro（2）和Ile，疏水氨基酸比例為42.86%，疏水值為16.80 kcal/mol；KQ7分子質(zhì)量為779.98 Da，等電點為9.84，凈電荷為1，KQ7含有5 個疏水性氨基酸，分別為Val（2）、Pro（2）和Leu，疏水氨基酸比例為71.42%，疏水值為9.58 kcal/mol。肽的分子質(zhì)量及氨基酸組成在α-淀粉酶抑制活性中起著至關重要的作用[19]。Miguel等[20]提出分子質(zhì)量小于1 kDa的肽組分對α-淀粉酶的抑制作用更強。本實驗的牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7含有疏水性氨基酸Pro、Leu、Ile和Val。Ngoh等[19]研究斑豆蛋白水解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)疏水性氨基酸（Ala、Leu、Phe、Val、Pro和Gly）在抑制α-淀粉酶活性中占有重要地位。此外，具有芳香環(huán)的高分子質(zhì)量氨基酸，如Arg、Phe、Trp和Tyr對α-淀粉酶活性位點的相互作用也至關重要[21]。

表1 肽的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of peptides

2.2 分子對接分析RK7、KQ7與α-淀粉酶相互作用

2.2.1 阿卡波糖與α-淀粉酶（3BAJ）

為了闡明肽和阿卡波糖與α-淀粉酶之間的相互作用，進行分子對接研究。由圖3可知，阿卡波糖與α-淀粉酶（3BAJ）的氨基酸殘基Glu233、Asp300、Thr163、Gln63和Lys200形成氫鍵作用力，其中氨基酸殘基Asp300與阿卡波糖形成3 個氫鍵，鍵長分別為4.14、4.61 ?和5.04 ?；阿卡波糖與α-淀粉酶的氨基酸殘基Ala198（5.15 ?）、His101（6.72 ?）和Leu162（4.84 ?）形成疏水相互作用，與Ala198（4.06 ?）、Asp197（4.26 ?/4.16 ?）和Gly104（3.04 ?）形成碳氫鍵，與His305、Trp58、Trp59、His201和Tyr62等形成范德華力。阿卡波糖通過與α-淀粉酶的相關氨基酸殘基相互作用產(chǎn)生抑制效果。

圖3 阿卡波糖與α-淀粉酶的對接構象圖Fig.3 Docking conformation of acarbose with α-amylase

2.2.2 RK7與α-淀粉酶（3BAJ）

將阿卡波糖作為陽性對照，分析RK7和KQ7在分子對接過程中與α-淀粉酶形成的結構，判斷RK7和KQ7的α-淀粉酶抑制能力。如圖4所示，RK7的Arg與3BAJ的Trp59形成氫鍵，鍵長為4.03 ?，RK7 N端第3位Lys與3BAJ的殘基His305、Glu233和Ala307形成4 個氫鍵，其中與Glu233形成2 個較為緊密的氫鍵，鍵長分別為4.06 ?和3.11 ?，RK7的His和Ile分別與3BAJ的氨基酸殘基Glu240和Gly304各形成1 個氫鍵，鍵長為5.43 ?和4.62 ?；與3BAJ氨基酸殘基Tyr151（4.81 ?）、His305（3.77 ?）和Trp58（6.56 ?）形成屬于疏水相互作用的π-π鍵和π-烷基鍵；與3BAJ的殘基Glu240（8.18 ?）、Tyr151（4.36 ?）、His305（3.05 ?）、Asp197（4.98 ?/4.57 ?）、Asp300（7.87 ?）和Glu233（6.97 ?）形成靜電相互作用。與3BAJ的氨基酸殘基Gly306（4.04 ?）、His305（3.05 ?）、Aps300（4.54 ?）和Tyr62（3.79 ?）形成碳氫鍵，與Gly308、Gly309、Val234、Lys200、Ile235、Asp356、Thr163、Arg195、His101、Gln63、Leu165、Leu162、Glu60、Ala198、His201和Ser199之間形成范德華力。抑制劑通過與α-淀粉酶重要氨基酸的結合產(chǎn)生抑制效果，Ummuhan等[3]通過對含哌嗪和苯并咪唑結構的α-淀粉酶抑制劑的研究，發(fā)現(xiàn)抑制劑與殘基Glu233、Asp197、Asp300、Trp58和Tyr62存在相互作用。分子對接顯示出α-淀粉酶的殘基在抑制機理中的重要地位。

圖4 RK7與α-淀粉酶的對接構象圖Fig.4 Docking conformation of RK7 with α-amylase

2.2.3 KQ7與α-淀粉酶（3BAJ）

如圖5所示，KQ7中N末端Lys與3BAJ的氨基酸殘基Thr163形成2 個氫鍵，鍵長分別為3.32 ?和5.12 ?，N端第2位Val分別于3BAJ殘基Thr163和Gln63形成2 個氫鍵，鍵長為3.93 ?和5.34 ?，C端第2位氨基酸Pro與3BAJ殘基Glu233形成氫鍵，鍵長為4.74 ?，C末端Gln與3BAJ氨基酸殘基Lys200形成2 個氫鍵，鍵長為3.66 ?和5.13 ?，與Ile235形成1 個氫鍵，鍵長為3.78 ?；與3BAJ的氨基酸殘基Ala198（4.71 ?）、Tyr62（3.78 ?）、Trp58（6.39 ?）、Trp59（4.70 ?）、Leu165（3.53 ?）、His305（5.22 ?）和Leu162（6.33 ?）形成疏水相互作用的烷基鍵和π-烷基鍵；與Asp147形成靜電相互作用，鍵長為4.28 ?；與3BAJ殘基Val234（4.04 ?）、His201（4.56、5.11 ?和4.52 ?）、Glu233（5.62 ?）、Ala198（3.47 ?）、Trp59（4.34 ?）、Thr163（3.03 ?）和Asp147（4.96 ?）之間形成碳氫鍵；與Ser199、Gly306、Ala307、Asp300、Arg195、Tyr151、Asp197、His101、Cys101、Asn105、Gly104、Ala106、Val107、Gly164和Ile148形成范德華力。本實驗分子對接結果顯示氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用和范德華力等相互作用的存在，降低了α-淀粉酶的活性。Liu Fufeng等[22]發(fā)現(xiàn)氫鍵在配體與受體蛋白的相互作用中起重要作用，能形成更加穩(wěn)定的結構，疏水相互作用、靜電相互作用和范德華力均有效促進了多肽與受體蛋白的結合，達到降低酶活的目的。

圖5 KQ7與α-淀粉酶的對接構象圖Fig.5 Docking conformation of KQ7 with α-amylase

2.2.4 RK7、KQ7與阿卡波糖的對比分析

由于抑制劑與酶結合期間氫鍵穩(wěn)定，因此氫鍵的數(shù)量和鍵長決定了肽的親和力。由表2可以看出，RK7、KQ7和阿卡波糖分別與α-淀粉酶形成10、17 個和12 個氫鍵。其中RK7與Glu233形成2 個作用較強的氫鍵，距離為4.06 ?和3.11 ?，KQ7與Glu233形成1 個氫鍵和1 個碳氫鍵距離分別為4.74 ?和5.62 ?，阿卡波糖與Glu233形成1 個氫鍵距離為4.95 ?；RK7與3BAJ的殘基Trp59形成的氫鍵鍵長為4.03 ?，KQ7與Trp59形成碳氫鍵，距離為4.34 ?，RK7形成的作用更強；KQ7和阿卡波糖與3BAJ的Lys200、Thr163和Gln63共同形成氫鍵相互作用，其中KQ7與Thr163形成4 個氫鍵，但阿卡波糖與之形成的氫鍵距離較短，作用更強。Subhiksha等[23]從鷹嘴豆蛋白水解物中得到的肽KMTAGSGVT（KT9）與3BAJ形成12 個氫鍵，對比發(fā)現(xiàn)RK7與KT9共同作用于3BAJ殘基His305、Gly306和Gly304形成氫鍵，KQ7和KT9與殘基His201和Lys200形成氫鍵。除擁有共同的氫鍵作用外，KQ7和阿卡波糖與殘基Ala198和Leu162形成疏水相互作用，與Ser199、Arg195、Tyr151和Gly164形成范德華力，KQ7和阿卡波糖與3BAJ的結合有更多相同的相互作用，因此，KQ7與阿卡波糖具有一致的α-淀粉酶抑制機制。KQ7是三者中與3BAJ發(fā)生最多相互作用的抑制劑，但與3BAJ的重要氨基酸殘基結合較少，抑制效果低于RK7和阿卡波糖。抑制劑與α-淀粉酶關鍵氨基酸Glu233、Asp300、Lys200、Gln63和Thr163形成氫鍵相互作用可以更加牢固的將抑制劑固定在活性部位[24]。Nurul等[25]從羅勒種子中得到的肽ACGNLPRMC可與α-淀粉酶的重要殘基Glu233、Asp300、Lys200、Gln63發(fā)生相互作用產(chǎn)生抑制效果。RK7和KQ7與3BAJ的氨基酸結合情況可以看出，RK7和KQ7與3BAJ的重要殘基形成了氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和范德華力等相互作用，使之與3BAJ形成穩(wěn)定的復合物結構。KQ7與3BAJ的氨基酸殘基形成的氫鍵數(shù)目更多，其與α-淀粉酶的結合更加穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)Glu233、Asp300和Asp197是α-淀粉酶活性位點上的重要氨基酸[26]。RK7與這3 種氨基酸均產(chǎn)生了相互作用，而KQ7僅與Glu233相互作用，因此，RK7的活性強于KQ7。分子對接揭示了RK7、KQ7和阿卡波糖與3BAJ的作用機制，發(fā)現(xiàn)KQ7和阿卡波糖與3BAJ的結合有更多一致的相互作用，因而KQ7的作用機制與阿卡波糖一致。

表2 3BAJ氨基酸結合對照Table 2 Comparison of RK7,KQ7 and acarbose binding to α-amylase

肽抑制酶的作用機制之一是肽與底物競爭酶的催化位點，中斷酶與底物之間的相互作用，從而達到抑制效果[27]。α-淀粉酶與底物相互作用的氨基酸殘基包括Asp165、Asp197、Lys200、Glu233、Asp236、Asp300、Trp59、Tyr62、His101、Pro163、Ile235、Tyr58、His299、His305和Ala307[28]。RK7和KQ7通過與這些氨基酸殘基的結合占據(jù)底物與3BAJ的結合位點抑制α-淀粉酶的活性。

2.3 肽RK7、KQ7的合成與α-淀粉酶活性驗證

2.3.1 肽RK7、KQ7的合成

如圖6所示，RK7理論分子質(zhì)量為875.09 Da，實際分子質(zhì)量為875.1 Da；KQ7理論分子質(zhì)量為779.98 Da，實際分子質(zhì)量為779.80 Da，分子質(zhì)量均與理論值接近，RK7與KQ7純度分別為98.18%和99.93%，合成結果達到預期標準。將經(jīng)固相合成的牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7用于α-淀粉酶活性的驗證。

圖6 合成肽RK7與KQ7的譜圖Fig.6 HLPC chromatograms and mass spectra of synthetic peptides RK7 and KQ7

2.3.2 肽RK7與KQ7的體外活性驗證

通過DNS比色法對苦味肽RK7和KQ7進行α-淀粉酶抑制率的測定，結果如圖7所示。RK7、KQ7和阿卡波糖的α-淀粉酶抑制率隨質(zhì)量濃度的增加而增加，當質(zhì)量濃度達到0.6 mg/mL時，抑制率的增速有所降低。阿卡波糖的α-淀粉酶抑制率曲線為y=-50.14x2+118.03x+14.39，R2=0.9763，質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍變化時，阿卡波糖的抑制率為37.08%～82.02%；肽RK7的α-淀粉酶抑制率曲線為y=-33.91x2+84.36x+18.74，R2=0.9926，肽質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍變化時，RK7的α-淀粉酶抑制率為34.18%～69.62%，KQ7的α-淀粉酶抑制率曲線為y=-17.30x2+57.87x+12.89，R2=0.9942，肽質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍變化時，KQ7的α-淀粉酶抑制率為24.19%～53.23%。根據(jù)抑制率曲線求得RK7與KQ7的IC50分別為0.45 mg/mL和0.86 mg/mL，阿卡波糖為0.36 mg/mL。RK7活性強于KQ7，且RK7與KQ7均強于Ramadhan等[29]發(fā)現(xiàn)的肽YSFR（10.82 mg/mL）和PGGP（4.23 mg/mL）具有良好的抑制活性。與分子對接結果一致，RK7與α-淀粉酶關鍵氨基酸結合數(shù)量更多，因此比KQ7具有更強α-淀粉酶抑制活性，但兩者均低于阿卡波糖的α-淀粉酶抑制活性。體外活性驗證實驗進一步證明RK7和KQ7均對α-淀粉酶具有良好的抑制作用，且α-淀粉酶抑制效果隨質(zhì)量濃度的增加而增強。不同的氨基酸組成和肽序列影響肽的生物活性，疏水性氨基酸對α-淀粉酶的抑制活性有較大影響[30]。由于RK7與α-淀粉酶的重要氨基酸結合數(shù)相對較多，因此，RK7相較于KQ7具有更高的抑制活性。

圖7 肽質(zhì)量濃度對α-淀粉酶抑制率的影響Fig.7 Effect of peptide concentration on percentage of α-amylase inhibition

3 結論

通過生物信息學工具及體外活性實驗探討牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7的α-淀粉酶抑制活性。與Biopep-UWM數(shù)據(jù)庫對比發(fā)現(xiàn)肽RK7和KQ7是2 種新型的α-淀粉酶抑制肽，分子質(zhì)量分別為875.07 Da和779.98 Da，均為低分子肽，肽序列中含有疏水性氨基酸Leu、Pro、Val和Ile有利于α-淀粉酶的抑制活性；分子對接揭示肽RK7和KQ7與α-淀粉酶形成氫鍵、范德華力、靜電和疏水等相互作用，使之與α-淀粉酶穩(wěn)定結合，達到抑制效果；體外活性實驗證明RK7的IC50為0.45 mg/mL，KQ7的IC50值為0.86 mg/mL，α-淀粉酶抑制活性：RK7＞KQ7。分子對接等生物信息學方法可高效快速預測肽的生物活性，并準確揭示牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7抑制α-淀粉酶的作用機理，為牦牛乳源低分子肽生物活性的研究提供重要參考。