李夢瑤，梁 琪,*，宋雪梅

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

α-淀粉酶是消化系統(tǒng)中的一種關(guān)鍵酶，抑制α-淀粉酶的活性可阻止碳水化合物水解為可吸收的單糖，降低餐后血糖水平，達(dá)到預(yù)防和治療II型糖尿?。╠iabetes mellitus type 2，T2DM）的目的[1]。Ganesan[2]和Ummuhan[3]等發(fā)現(xiàn)阿卡波糖、米格列醇等藥物可作為α-淀粉酶抑制劑用于治療T2DM，但長期使用此類藥物會(huì)導(dǎo)致腹痛腹瀉等不良癥狀。近年來，國內(nèi)外研究人員從天然食物蛋白水解物中提取的α-淀粉酶抑制肽成為治療T2DM的研究熱點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)肽可通過占據(jù)α-淀粉酶的活性位點(diǎn)減少碳水化合物的消化[4-6]。

生物活性肽存在于蛋白質(zhì)序列中，經(jīng)酶解和微生物發(fā)酵等方式得以釋放[7]。干酪成熟期間在發(fā)酵劑和凝乳酶的作用下，產(chǎn)生了具有多種功能的生物活性肽[8]。同時(shí)，干酪蛋白質(zhì)的降解會(huì)產(chǎn)生大量苦味肽，研究表明肽的苦味源自Leu、Gln、Ile和Pro等疏水性氨基酸，這些疏水性氨基酸又與肽的生物活性密切相關(guān)[9-11]。牦牛乳干酪是高原地區(qū)居民傳統(tǒng)食物，成熟時(shí)間可達(dá)6 個(gè)月至2 年，更易產(chǎn)生大量肽序列。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)牦牛乳干酪苦味肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性、抗氧化活性及抑菌活性，然而關(guān)于牦牛乳干酪苦味肽的α-淀粉酶抑制活性及其作用機(jī)制的研究還處于空白階段。

ExPASy-ProtParam、Innovagen和Biopep-UWM數(shù)據(jù)庫等生物信息學(xué)工具和分子對接技術(shù)可以高效準(zhǔn)確地預(yù)測肽的生物活性。根據(jù)肽的結(jié)構(gòu)特征及基本理化性質(zhì)研究其對生物活性的影響，并且能通過分子對接技術(shù)分析肽與受體蛋白之間的相互作用，闡明生物活性肽的作用機(jī)制[12-13]。楊保軍等[14]利用生物信息學(xué)方法研究了牦牛乳源抑菌肽的分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)利用課題組前期鑒定的牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7，通過生物信息學(xué)工具分析肽的理化性質(zhì)及序列特征，結(jié)合分子對接闡明α-淀粉酶抑制肽的作用機(jī)制，并進(jìn)行體外活性實(shí)驗(yàn)，為α-淀粉酶抑制肽的作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RK7和KQ7由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；α-淀粉酶、3,5-二硝基水楊酸 上海麥克林生化科技有限公司；阿卡波糖 石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；可溶性淀粉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

VersaMax酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；VM-500S渦旋混合器 群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FR224CN電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；HWS26恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司；Discovery Studio Client v16.1.0（DS） 美國Accelys公司；ChemBioDraw Ultra 11.0美國Cambridge Soft公司。

1.3 方法

1.3.1 生物活性及理化性質(zhì)的預(yù)測

利用Innovagen、PepDraw和ExPASy ProtParam等生物信息學(xué)工具預(yù)測肽的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性和疏水氨基酸比例等基本理化性質(zhì)[15]。

1.3.2 配體和受體的準(zhǔn)備

RK7與KQ7的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。使用ChemBioDraw Ultra 11.0構(gòu)建肽RK7和KQ7的二維結(jié)構(gòu)，使用DS軟件中CHARMm程序進(jìn)行能量最小化處理，使用Prepare Ligands程序優(yōu)化肽RK7和KQ7結(jié)構(gòu)。

圖1 RK7與KQ7的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of RK7 and KQ7

α-淀粉酶三維結(jié)構(gòu)圖見圖2。從RCSB Protein Date Bank（PDB，http://www.Pdb.org）中下載α-淀粉酶（PDB: 3BAJ）蛋白晶體的X射線三維結(jié)構(gòu)[16]。使用Discovery Studio 2016軟件打開PDB文件，刪除其3D晶體結(jié)構(gòu)的水分子和雜原子，通過Macromolecules模塊中的“Clean Protein”優(yōu)化蛋白質(zhì)構(gòu)象，去除蛋白多構(gòu)象[17]。

圖2 α-淀粉酶三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Three-dimensional structure of α-amylase

1.3.3 分子對接

利用DS軟件中的LibDock模塊，選擇阿卡波糖（陽性對照）的活性位點(diǎn)，坐標(biāo)為（X：10.1522，Y：15.8388，Z：41.1172，R：10.2578 ?），將肽RK7和KQ7與α-淀粉酶（PDB：3BAJ）進(jìn)行LibDock對接。

1.3.4 肽RK7和KQ7的合成及α-淀粉酶抑制活性的測定

采用固相合成法對肽RK7和KQ7進(jìn)行合成，并通過液相色譜-質(zhì)譜分析合成肽的純度和分子質(zhì)量。肽的合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

α-淀粉酶抑制活性采用DNS比色法測定[18]，并根據(jù)下式計(jì)算α-淀粉酶抑制率：

式中：ODS為樣品組光密度值；ODSB為樣品空白組光密度值；ODC為對照組光密度值；ODB為空白組光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品重復(fù)3 次，使用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肽RK7與KQ7理化性質(zhì)預(yù)測

如表1所示，RK7分子質(zhì)量為875.07 Da，等電點(diǎn)為11.57，凈電荷為3，RK7含有3 個(gè)疏水性氨基酸，分別為Pro（2）和Ile，疏水氨基酸比例為42.86%，疏水值為16.80 kcal/mol；KQ7分子質(zhì)量為779.98 Da，等電點(diǎn)為9.84，凈電荷為1，KQ7含有5 個(gè)疏水性氨基酸，分別為Val（2）、Pro（2）和Leu，疏水氨基酸比例為71.42%，疏水值為9.58 kcal/mol。肽的分子質(zhì)量及氨基酸組成在α-淀粉酶抑制活性中起著至關(guān)重要的作用[19]。Miguel等[20]提出分子質(zhì)量小于1 kDa的肽組分對α-淀粉酶的抑制作用更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)的牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7含有疏水性氨基酸Pro、Leu、Ile和Val。Ngoh等[19]研究斑豆蛋白水解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)疏水性氨基酸（Ala、Leu、Phe、Val、Pro和Gly）在抑制α-淀粉酶活性中占有重要地位。此外，具有芳香環(huán)的高分子質(zhì)量氨基酸，如Arg、Phe、Trp和Tyr對α-淀粉酶活性位點(diǎn)的相互作用也至關(guān)重要[21]。

表1 肽的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of peptides

2.2 分子對接分析RK7、KQ7與α-淀粉酶相互作用

2.2.1 阿卡波糖與α-淀粉酶（3BAJ）

為了闡明肽和阿卡波糖與α-淀粉酶之間的相互作用，進(jìn)行分子對接研究。由圖3可知，阿卡波糖與α-淀粉酶（3BAJ）的氨基酸殘基Glu233、Asp300、Thr163、Gln63和Lys200形成氫鍵作用力，其中氨基酸殘基Asp300與阿卡波糖形成3 個(gè)氫鍵，鍵長分別為4.14、4.61 ?和5.04 ?；阿卡波糖與α-淀粉酶的氨基酸殘基Ala198（5.15 ?）、His101（6.72 ?）和Leu162（4.84 ?）形成疏水相互作用，與Ala198（4.06 ?）、Asp197（4.26 ?/4.16 ?）和Gly104（3.04 ?）形成碳?xì)滏I，與His305、Trp58、Trp59、His201和Tyr62等形成范德華力。阿卡波糖通過與α-淀粉酶的相關(guān)氨基酸殘基相互作用產(chǎn)生抑制效果。

圖3 阿卡波糖與α-淀粉酶的對接構(gòu)象圖Fig.3 Docking conformation of acarbose with α-amylase

2.2.2 RK7與α-淀粉酶（3BAJ）

將阿卡波糖作為陽性對照，分析RK7和KQ7在分子對接過程中與α-淀粉酶形成的結(jié)構(gòu)，判斷RK7和KQ7的α-淀粉酶抑制能力。如圖4所示，RK7的Arg與3BAJ的Trp59形成氫鍵，鍵長為4.03 ?，RK7 N端第3位Lys與3BAJ的殘基His305、Glu233和Ala307形成4 個(gè)氫鍵，其中與Glu233形成2 個(gè)較為緊密的氫鍵，鍵長分別為4.06 ?和3.11 ?，RK7的His和Ile分別與3BAJ的氨基酸殘基Glu240和Gly304各形成1 個(gè)氫鍵，鍵長為5.43 ?和4.62 ?；與3BAJ氨基酸殘基Tyr151（4.81 ?）、His305（3.77 ?）和Trp58（6.56 ?）形成屬于疏水相互作用的π-π鍵和π-烷基鍵；與3BAJ的殘基Glu240（8.18 ?）、Tyr151（4.36 ?）、His305（3.05 ?）、Asp197（4.98 ?/4.57 ?）、Asp300（7.87 ?）和Glu233（6.97 ?）形成靜電相互作用。與3BAJ的氨基酸殘基Gly306（4.04 ?）、His305（3.05 ?）、Aps300（4.54 ?）和Tyr62（3.79 ?）形成碳?xì)滏I，與Gly308、Gly309、Val234、Lys200、Ile235、Asp356、Thr163、Arg195、His101、Gln63、Leu165、Leu162、Glu60、Ala198、His201和Ser199之間形成范德華力。抑制劑通過與α-淀粉酶重要氨基酸的結(jié)合產(chǎn)生抑制效果，Ummuhan等[3]通過對含哌嗪和苯并咪唑結(jié)構(gòu)的α-淀粉酶抑制劑的研究，發(fā)現(xiàn)抑制劑與殘基Glu233、Asp197、Asp300、Trp58和Tyr62存在相互作用。分子對接顯示出α-淀粉酶的殘基在抑制機(jī)理中的重要地位。

圖4 RK7與α-淀粉酶的對接構(gòu)象圖Fig.4 Docking conformation of RK7 with α-amylase

2.2.3 KQ7與α-淀粉酶（3BAJ）

如圖5所示，KQ7中N末端Lys與3BAJ的氨基酸殘基Thr163形成2 個(gè)氫鍵，鍵長分別為3.32 ?和5.12 ?，N端第2位Val分別于3BAJ殘基Thr163和Gln63形成2 個(gè)氫鍵，鍵長為3.93 ?和5.34 ?，C端第2位氨基酸Pro與3BAJ殘基Glu233形成氫鍵，鍵長為4.74 ?，C末端Gln與3BAJ氨基酸殘基Lys200形成2 個(gè)氫鍵，鍵長為3.66 ?和5.13 ?，與Ile235形成1 個(gè)氫鍵，鍵長為3.78 ?；與3BAJ的氨基酸殘基Ala198（4.71 ?）、Tyr62（3.78 ?）、Trp58（6.39 ?）、Trp59（4.70 ?）、Leu165（3.53 ?）、His305（5.22 ?）和Leu162（6.33 ?）形成疏水相互作用的烷基鍵和π-烷基鍵；與Asp147形成靜電相互作用，鍵長為4.28 ?；與3BAJ殘基Val234（4.04 ?）、His201（4.56、5.11 ?和4.52 ?）、Glu233（5.62 ?）、Ala198（3.47 ?）、Trp59（4.34 ?）、Thr163（3.03 ?）和Asp147（4.96 ?）之間形成碳?xì)滏I；與Ser199、Gly306、Ala307、Asp300、Arg195、Tyr151、Asp197、His101、Cys101、Asn105、Gly104、Ala106、Val107、Gly164和Ile148形成范德華力。本實(shí)驗(yàn)分子對接結(jié)果顯示氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用和范德華力等相互作用的存在，降低了α-淀粉酶的活性。Liu Fufeng等[22]發(fā)現(xiàn)氫鍵在配體與受體蛋白的相互作用中起重要作用，能形成更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，疏水相互作用、靜電相互作用和范德華力均有效促進(jìn)了多肽與受體蛋白的結(jié)合，達(dá)到降低酶活的目的。

圖5 KQ7與α-淀粉酶的對接構(gòu)象圖Fig.5 Docking conformation of KQ7 with α-amylase

2.2.4 RK7、KQ7與阿卡波糖的對比分析

由于抑制劑與酶結(jié)合期間氫鍵穩(wěn)定，因此氫鍵的數(shù)量和鍵長決定了肽的親和力。由表2可以看出，RK7、KQ7和阿卡波糖分別與α-淀粉酶形成10、17 個(gè)和12 個(gè)氫鍵。其中RK7與Glu233形成2 個(gè)作用較強(qiáng)的氫鍵，距離為4.06 ?和3.11 ?，KQ7與Glu233形成1 個(gè)氫鍵和1 個(gè)碳?xì)滏I距離分別為4.74 ?和5.62 ?，阿卡波糖與Glu233形成1 個(gè)氫鍵距離為4.95 ?；RK7與3BAJ的殘基Trp59形成的氫鍵鍵長為4.03 ?，KQ7與Trp59形成碳?xì)滏I，距離為4.34 ?，RK7形成的作用更強(qiáng)；KQ7和阿卡波糖與3BAJ的Lys200、Thr163和Gln63共同形成氫鍵相互作用，其中KQ7與Thr163形成4 個(gè)氫鍵，但阿卡波糖與之形成的氫鍵距離較短，作用更強(qiáng)。Subhiksha等[23]從鷹嘴豆蛋白水解物中得到的肽KMTAGSGVT（KT9）與3BAJ形成12 個(gè)氫鍵，對比發(fā)現(xiàn)RK7與KT9共同作用于3BAJ殘基His305、Gly306和Gly304形成氫鍵，KQ7和KT9與殘基His201和Lys200形成氫鍵。除擁有共同的氫鍵作用外，KQ7和阿卡波糖與殘基Ala198和Leu162形成疏水相互作用，與Ser199、Arg195、Tyr151和Gly164形成范德華力，KQ7和阿卡波糖與3BAJ的結(jié)合有更多相同的相互作用，因此，KQ7與阿卡波糖具有一致的α-淀粉酶抑制機(jī)制。KQ7是三者中與3BAJ發(fā)生最多相互作用的抑制劑，但與3BAJ的重要氨基酸殘基結(jié)合較少，抑制效果低于RK7和阿卡波糖。抑制劑與α-淀粉酶關(guān)鍵氨基酸Glu233、Asp300、Lys200、Gln63和Thr163形成氫鍵相互作用可以更加牢固的將抑制劑固定在活性部位[24]。Nurul等[25]從羅勒種子中得到的肽ACGNLPRMC可與α-淀粉酶的重要?dú)埢鵊lu233、Asp300、Lys200、Gln63發(fā)生相互作用產(chǎn)生抑制效果。RK7和KQ7與3BAJ的氨基酸結(jié)合情況可以看出，RK7和KQ7與3BAJ的重要?dú)埢纬闪藲滏I、靜電相互作用、疏水相互作用和范德華力等相互作用，使之與3BAJ形成穩(wěn)定的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。KQ7與3BAJ的氨基酸殘基形成的氫鍵數(shù)目更多，其與α-淀粉酶的結(jié)合更加穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)Glu233、Asp300和Asp197是α-淀粉酶活性位點(diǎn)上的重要氨基酸[26]。RK7與這3 種氨基酸均產(chǎn)生了相互作用，而KQ7僅與Glu233相互作用，因此，RK7的活性強(qiáng)于KQ7。分子對接揭示了RK7、KQ7和阿卡波糖與3BAJ的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)KQ7和阿卡波糖與3BAJ的結(jié)合有更多一致的相互作用，因而KQ7的作用機(jī)制與阿卡波糖一致。

表2 3BAJ氨基酸結(jié)合對照Table 2 Comparison of RK7,KQ7 and acarbose binding to α-amylase

肽抑制酶的作用機(jī)制之一是肽與底物競爭酶的催化位點(diǎn)，中斷酶與底物之間的相互作用，從而達(dá)到抑制效果[27]。α-淀粉酶與底物相互作用的氨基酸殘基包括Asp165、Asp197、Lys200、Glu233、Asp236、Asp300、Trp59、Tyr62、His101、Pro163、Ile235、Tyr58、His299、His305和Ala307[28]。RK7和KQ7通過與這些氨基酸殘基的結(jié)合占據(jù)底物與3BAJ的結(jié)合位點(diǎn)抑制α-淀粉酶的活性。

2.3 肽RK7、KQ7的合成與α-淀粉酶活性驗(yàn)證

2.3.1 肽RK7、KQ7的合成

如圖6所示，RK7理論分子質(zhì)量為875.09 Da，實(shí)際分子質(zhì)量為875.1 Da；KQ7理論分子質(zhì)量為779.98 Da，實(shí)際分子質(zhì)量為779.80 Da，分子質(zhì)量均與理論值接近，RK7與KQ7純度分別為98.18%和99.93%，合成結(jié)果達(dá)到預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。將經(jīng)固相合成的牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7用于α-淀粉酶活性的驗(yàn)證。

圖6 合成肽RK7與KQ7的譜圖Fig.6 HLPC chromatograms and mass spectra of synthetic peptides RK7 and KQ7

2.3.2 肽RK7與KQ7的體外活性驗(yàn)證

通過DNS比色法對苦味肽RK7和KQ7進(jìn)行α-淀粉酶抑制率的測定，結(jié)果如圖7所示。RK7、KQ7和阿卡波糖的α-淀粉酶抑制率隨質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.6 mg/mL時(shí)，抑制率的增速有所降低。阿卡波糖的α-淀粉酶抑制率曲線為y=-50.14x2+118.03x+14.39，R2=0.9763，質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍變化時(shí)，阿卡波糖的抑制率為37.08%～82.02%；肽RK7的α-淀粉酶抑制率曲線為y=-33.91x2+84.36x+18.74，R2=0.9926，肽質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍變化時(shí)，RK7的α-淀粉酶抑制率為34.18%～69.62%，KQ7的α-淀粉酶抑制率曲線為y=-17.30x2+57.87x+12.89，R2=0.9942，肽質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍變化時(shí)，KQ7的α-淀粉酶抑制率為24.19%～53.23%。根據(jù)抑制率曲線求得RK7與KQ7的IC50分別為0.45 mg/mL和0.86 mg/mL，阿卡波糖為0.36 mg/mL。RK7活性強(qiáng)于KQ7，且RK7與KQ7均強(qiáng)于Ramadhan等[29]發(fā)現(xiàn)的肽YSFR（10.82 mg/mL）和PGGP（4.23 mg/mL）具有良好的抑制活性。與分子對接結(jié)果一致，RK7與α-淀粉酶關(guān)鍵氨基酸結(jié)合數(shù)量更多，因此比KQ7具有更強(qiáng)α-淀粉酶抑制活性，但兩者均低于阿卡波糖的α-淀粉酶抑制活性。體外活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明RK7和KQ7均對α-淀粉酶具有良好的抑制作用，且α-淀粉酶抑制效果隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。不同的氨基酸組成和肽序列影響肽的生物活性，疏水性氨基酸對α-淀粉酶的抑制活性有較大影響[30]。由于RK7與α-淀粉酶的重要氨基酸結(jié)合數(shù)相對較多，因此，RK7相較于KQ7具有更高的抑制活性。

圖7 肽質(zhì)量濃度對α-淀粉酶抑制率的影響Fig.7 Effect of peptide concentration on percentage of α-amylase inhibition

3 結(jié)論

通過生物信息學(xué)工具及體外活性實(shí)驗(yàn)探討牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7的α-淀粉酶抑制活性。與Biopep-UWM數(shù)據(jù)庫對比發(fā)現(xiàn)肽RK7和KQ7是2 種新型的α-淀粉酶抑制肽，分子質(zhì)量分別為875.07 Da和779.98 Da，均為低分子肽，肽序列中含有疏水性氨基酸Leu、Pro、Val和Ile有利于α-淀粉酶的抑制活性；分子對接揭示肽RK7和KQ7與α-淀粉酶形成氫鍵、范德華力、靜電和疏水等相互作用，使之與α-淀粉酶穩(wěn)定結(jié)合，達(dá)到抑制效果；體外活性實(shí)驗(yàn)證明RK7的IC50為0.45 mg/mL，KQ7的IC50值為0.86 mg/mL，α-淀粉酶抑制活性：RK7＞KQ7。分子對接等生物信息學(xué)方法可高效快速預(yù)測肽的生物活性，并準(zhǔn)確揭示牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7抑制α-淀粉酶的作用機(jī)理，為牦牛乳源低分子肽生物活性的研究提供重要參考。