王 澤，張 巖，陳煉紅,

（1.西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

牦牛是中國青藏高原特有的家畜資源[1]。牦牛乳作為高寒牧區(qū)牧民的重要食物[2]，與牛乳相比，不僅脂肪酸、蛋白質(zhì)、乳糖等干物質(zhì)含量更高，還具有耐缺氧、抗疲勞和抗氧化等功能特性[3]。當(dāng)前牦牛乳的生產(chǎn)加工主要集中在曲拉、酥油和牦牛酸乳等傳統(tǒng)制品[4]，商業(yè)價值較低且不易貯藏，牦牛干酪作為高附加值的耐保存乳制品亟需進(jìn)一步開發(fā)研究。牦牛干酪具有風(fēng)味濃郁、出品率高與營養(yǎng)價值高等特點(diǎn)[5]，近年來，人們對優(yōu)質(zhì)乳制品的需求不斷增加，牦牛干酪具有廣闊的市場前景。

Edam干酪又稱紅波奶酪，原產(chǎn)于荷蘭[6]，常以牛乳或水牛乳為原料[7]，是經(jīng)熱水浸燙浸泡排出乳清，洗滌乳糖，于10～14 ℃發(fā)酵成熟的半硬質(zhì)浸洗干酪。浸洗是Edam干酪獨(dú)特的生產(chǎn)工藝，能夠有效控制乳酸的產(chǎn)生，使干酪pH值保持在5.0～5.2范圍內(nèi)[8]。Edam干酪成熟周期通常為6～10 周[9]，其口感細(xì)膩溫和，略有咸味，內(nèi)部呈淡黃色，微帶彈性，初試干酪者容易接受。

干酪成熟過程主要包含蛋白降解、脂肪氧化和糖酵解3 種生化反應(yīng)[10]。蛋白質(zhì)水解是其中重要一環(huán)，蛋白質(zhì)在凝乳酶、蛋白酶以及微生物酶的作用下逐漸降解成大肽、小肽以及氨基酸，從而形成干酪特有的組織形態(tài)和風(fēng)味[11]。酪蛋白（casein，CN）富含人體所需的必需氨基酸[12]，作為干酪骨架的主要結(jié)構(gòu)，成熟過程中不斷被降解，其氨基酸含量、疏水基團(tuán)數(shù)量、二級結(jié)構(gòu)等皆會發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白分子交聯(lián)程度與交聯(lián)方式發(fā)生改變，從而影響干酪的質(zhì)地和功能特性。

探究成熟過程中牛乳Edam干酪的蛋白質(zhì)降解已成為研究熱點(diǎn)，Sabikhi等[13]發(fā)現(xiàn)Edam干酪成熟3 個月后α-CN和β-CN均被水解，但α-CN水解程度更高；Ml?ek等[14]采用近紅外光譜法檢測Edam干酪中游離氨基酸和可溶性氮（soluble nitrogen，SN）含量評估干酪成熟階段；Aljewicz等[15]使用鼠李糖桿菌和嗜酸乳桿菌作為輔助發(fā)酵劑能夠顯著提升Edam干酪蛋白水解過程；Pachlová等[16]發(fā)現(xiàn)成熟時間與成熟溫度能夠顯著影響Edam干酪中游離氨基酸含量，其中（10±2）℃的成熟效果最好。

目前，鮮見Edam牦牛干酪成熟期間品質(zhì)及蛋白質(zhì)降解的深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)以牦牛乳為原料制備Edam牦牛干酪，基于實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有最佳加工工藝，研究其在成熟過程中理化指標(biāo)、物性指標(biāo)、蛋白質(zhì)和脂肪分解指標(biāo)變化，分析CN結(jié)構(gòu)與降解情況，探究各指標(biāo)之間相關(guān)性。本研究可為Edam干酪品質(zhì)評價和成熟機(jī)理提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Edam牦牛干酪（實(shí)驗(yàn)室自制，得率19.41%）；新鮮牦牛乳采自四川省紅原縣麥洼（乳密度1.033、蛋白質(zhì)含量4.72%、脂肪含量6.54%）。

蛋白定量測定試劑盒、巰基測定試劑盒、蛋白質(zhì)羰基含量測試盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒 江蘇省南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-800-GSI人工氣候培養(yǎng)箱 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C精密pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；MODEL手持式色度計 廣東省深圳市威福光電科技有限公司；K-9840凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；JOYN-SXT-6B粗脂肪自動測定儀上海喬躍儀器有限公司；TG16-WS低溫高速離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；V-100紫外分光光度計 翱藝儀器（上海）有限公司；TA.XT.Plus食品物性分析儀 英國Stable Micro System公司；DHR-3流變儀 美國TA公司；ALPHA 1-4 LSC1-4冷凍干燥機(jī) 德國Marin Christ公司；DYY-12電腦三恒多用電泳儀 北京市六一儀器廠；Nicolet 380傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 Edam牦牛干酪制備

根據(jù)課題組前期工藝優(yōu)化研究基礎(chǔ)，Edam牦牛干酪按如下流程制備：

原料乳→過濾→標(biāo)準(zhǔn)化→巴氏滅菌（63 ℃，30 min）→冷卻（32 ℃）→添加發(fā)酵劑（0.006%）→調(diào)節(jié)pH值至5.6→添加氯化鈣（0.01%）→添加凝乳酶→凝乳（32 ℃，30 min）→切割、熱縮→排出乳清→浸洗（45 ℃）→排出乳清→壓榨成型→鹽漬（12%）→干燥→封蠟→成熟

1.3.2 成熟

將Edam牦牛干酪置于13 ℃、相對濕度85%的人工氣候箱中進(jìn)行發(fā)酵成熟，分別在成熟第0、20、40、60、80天取樣測定。

1.3.3 感官評價實(shí)驗(yàn)

參考GB 5420—2021《干酪》[17]中感官要求制定Edam牦牛干酪感官評價標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。

表1 Edam牦牛干酪感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Edam yak cheese

1.3.4 理化指標(biāo)測定

根據(jù)GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[18]中直接干燥法測定水分含量；根據(jù)GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》[19]測定pH值；根據(jù)Delgado等[20]的方法測定亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。

1.3.5 物性指標(biāo)測定

1.3.5.1 質(zhì)構(gòu)測定

參考姜納川等[10]的方法并加以修改。將樣品分為5 cm×5 cm×3 cm塊，使用食品物性分析儀進(jìn)行測定。測定參數(shù)：負(fù)載類型為Auto-5 g；測試速率1 mm/s；壓緊距離10 mm；保持時間0 s；探頭恢復(fù)速率1 mm/s；探測類型為p-0.5。

1.3.5.2 流變學(xué)特性測定

根據(jù)Ma Xixiu等[21]的方法并加以修改。將干酪樣品切成直徑為2 cm、厚度為0.3 cm的圓形切片。使用流變儀，選用20 mm的不銹鋼平板探頭進(jìn)行測定。進(jìn)行小幅振蕩動態(tài)剪切變溫掃描時，升溫（或降溫）范圍設(shè)定為25～80 ℃，升溫（或降溫）速率5 ℃/min，測試?yán)?.05%，頻率0.1 Hz。

1.3.6 蛋白質(zhì)分解指標(biāo)測定

根據(jù)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[22]中凱氏定氮法測定總蛋白含量，根據(jù)Mane等[23]的方法測定pH 4.6條件下干酪中SN含量（pH 4.6-SN），根據(jù)高代微等[24]的方法測定12%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）條件下干酪中SN含量（12% TCA-SN）。

1.3.7 脂肪分解指標(biāo)測定

根據(jù)GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[25]中索氏抽提法測定脂肪含量；根據(jù)GB/T 5530—2005《酸值和酸度測定》[26]中熱乙醇法測定游離脂肪酸含量；根據(jù)李昂等[27]的方法測定硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值。

1.3.8 CN結(jié)構(gòu)分析

1.3.8.1 CN提取與純度分析

根據(jù)王玲[28]的方法從Edam牦牛干酪中提取CN樣品。稱取一定質(zhì)量CN凍干粉溶解于100 倍稀釋的醋酸鹽緩沖液中，采用蛋白定量測定試劑盒測定CN的純度。

1.3.8.2 SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)

根據(jù)王蔚新[29]的方法測定。

1.3.8.3 傅里葉變換紅外光譜掃描

根據(jù)周穎喆[30]的方法并加以修改。采用透射紅外光譜附件，使用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行分析。背景掃描后，將CN樣品平鋪在樣品的ZnSe芯片上。掃描范圍4000～650 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.8.4 總巰基含量與羰基含量測定

按照試劑盒說明，采用巰基測定試劑盒測定總巰基含量，采用蛋白質(zhì)羰基含量測試盒測定羰基含量。

1.3.8.5 表面疏水性測定

根據(jù)耿瑋蔚等[31]的方法并加以修改。取一定質(zhì)量CN樣品溶于SDS溶液中，靜置30 min，在pH 8.0緩沖液中透析。取透析液0.5 mL，加入10 mL CHCl3，混勻。在CHCl3層中加入0.0024%亞甲基藍(lán)溶液，混勻，2500 r/min離心15 min。取底層SDS和亞甲基藍(lán)的混合物，在655 nm波長處測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 Edam牦牛干酪成熟過程中感官評價分析

由圖1可知，Edam牦牛干酪成熟過程中感官評分呈先顯著下降后顯著上升的趨勢（P＜0.05）。第0天時，干酪無其他明顯風(fēng)味，顆粒較粗糙；成熟20 d時口感最差，發(fā)酵香氣不足；成熟40 d時，感官接受度有所提高，初具干酪發(fā)酵香氣；成熟80 d時，干酪出現(xiàn)明顯香氣，口感細(xì)膩，這是因?yàn)槊钢饾u滲入，干酪成熟使大分子肽逐漸分解為小分子肽，小分子肽繼而分解為氨基酸以及副產(chǎn)物，脂肪在酶的作用下逐漸分解為脂肪酸，脂肪酸與干酪原有的醇類物質(zhì)作用生成酯，產(chǎn)生芳香氣味，改善干酪的感官品質(zhì)[32]。

圖1 Edam牦牛干酪成熟過程各階段感官評分Fig.1 Sensory score of Edam yak cheese during ripening process

2.2 Edam牦牛干酪成熟過程中理化指標(biāo)分析

2.2.1 Edam牦牛干酪成熟過程中水分含量變化

由圖2可知，Edam牦牛干酪的水分含量隨成熟時間延長而降低。成熟初期含水量相對較高，所以成熟0～60 d水分流失較快，此時各階段水分含量差異顯著（P＜0.05）；成熟60 d后，蛋白質(zhì)及脂肪分解基本完成，干酪結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，水分流失逐漸緩和。這與Sabikhi等[13]的結(jié)果一致，均為成熟初期奶酪水分含量顯著降低。水分含量降低的原因是干酪早期網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)空隙小，隨著成熟時間的延長，CN分解導(dǎo)致網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙逐漸變大，水分從空隙中脫落。另外，蛋白質(zhì)和脂肪分解時常伴有水的生成，抵消了一部分流失的水，所以成熟時間越久，水分含量降低越緩慢。

圖2 不同成熟階段Edam牦牛干酪的水分含量Fig.2 Water content of Edam yak cheese during ripening stages

2.2.2 Edam牦牛干酪成熟過程中pH值變化

由圖3可知，隨著成熟時間的延長，Edam牦牛干酪的pH值呈逐漸下降趨勢，由最初的5.85下降到4.96，屬于Edam干酪的正常pH值。Hoffmann等[33]測得成熟6 周的Edam干酪pH值為5.40，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。成熟0～20 d，pH值顯著下降（P＜0.05），這是因?yàn)樵诟衫页墒爝^程中，乳糖被發(fā)酵劑乳酸菌降解產(chǎn)生乳酸[34]，蛋白被蛋白酶水解產(chǎn)生小分子肽等堿性物質(zhì)，且成熟早期乳糖分解作用較強(qiáng)，從而導(dǎo)致pH值迅速下降。在后熟階段，由于乳糖不斷被消耗，酸性物質(zhì)的生成會逐漸減少，堿性物質(zhì)不斷積累，因此干酪在后熟階段的下降趨勢減緩。

圖3 不同成熟階段Edam牦牛干酪的pH值Fig.3 pH of Edam yak cheese at different ripening stages

2.2.3 Edam牦牛干酪成熟過程中色度變化

干酪的成熟過程中，脂肪含量對色度有重要影響[35]。由表2可知，隨著成熟時間延長，Edam牦牛干酪的L*值呈下降趨勢，下降率為12.44%。成熟過程中菌體分泌的脂肪酶不斷分解脂肪，隨著脂肪減少，L*值不斷下降。隨著成熟時間延長，干酪的a*值不斷增加，其中成熟20～60 d上升顯著（P＜0.05）。這是由于成熟前期，干酪中的紅綠色素被脂類物質(zhì)包裹，所以干酪顏色偏綠，隨著成熟時間的延長，脂類物質(zhì)不斷被凝乳酶和乳酸菌分泌的脂肪酶分解，干酪中的紅綠色素被釋放出來，使干酪逐漸呈現(xiàn)出應(yīng)有的色澤。此外，隨著成熟時間變化，干酪的b*值在各階段顯著上升（P＜0.05），由最初的13.15上升至19.45，上升率為47.91%。隨著成熟的進(jìn)行，蛋白質(zhì)不斷被乳酸菌和凝乳酶分解，部分CN的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，鑲嵌在CN網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的脂肪逐漸暴露，使干酪中游離的黃色素增多，干酪表觀色澤越來越黃。

表2 不同成熟階段Edam牦牛干酪的色度值Table 2 Color parameters of Edam yak cheese at different ripening stages

2.3 Edam牦牛干酪成熟過程中物性指標(biāo)分析

2.3.1 質(zhì)構(gòu)特性分析

由表3可知，隨著成熟時間延長，Edam牦牛干酪的硬度、彈性和膠黏性均呈上升趨勢。干酪在成熟80 d內(nèi)硬度由971.83 g上升到4326.01 g。水分的流失導(dǎo)致硬度不斷增加，后期上升幅度較緩和，這是由于蛋白質(zhì)和脂肪分解產(chǎn)生了一部分水，減緩了硬度增加的速率。干酪的彈性在成熟80 d內(nèi)逐漸增加，彈性增長歸因于蛋白分子內(nèi)破裂的非共價相互作用的復(fù)雜變化；干酪成熟過程中蛋白質(zhì)和脂肪的分解，使各組分作用力趨于穩(wěn)定和平衡，主要表現(xiàn)為彈性增加以及內(nèi)部組織分布更加均勻等。成熟過程中，干酪的凝聚性整體呈下降趨勢，80 d內(nèi)下降率達(dá)85.71%。Moreira等[36]對奶酪成熟過程中凝聚性下降進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象與化學(xué)鍵間的相互結(jié)合有關(guān)，隨蛋白質(zhì)水解程度的增加，蛋白質(zhì)與水相互作用增加，破壞原有化學(xué)鍵，使得凝聚性下降。成熟過程中，干酪的膠黏性在成熟20 d后顯著上升（P＜0.05）。這是因?yàn)楦衫页墒爝^程中蛋白質(zhì)的分解使親水基團(tuán)增加，脂肪降解為游離脂肪酸，導(dǎo)致干酪膠黏性不斷上升。

表3 不同成熟階段Edam牦牛干酪質(zhì)構(gòu)特性Table 3 Texture characteristics of Edam yak cheese at different maturity stages

2.3.2 流變學(xué)特性分析

由圖4可知，Edam牦牛干酪在成熟過程中，隨著溫度的升高，發(fā)酵各階段干酪的儲能模量和損耗模量均呈下降趨勢，且趨勢相似。這說明受熱過程中凝乳顆粒的彈性和黏性一直降低，可能與脂肪粒液化發(fā)生形變、CN收縮使蛋白質(zhì)結(jié)合減弱有關(guān)。而隨著發(fā)酵時間的延長，干酪的儲能模量和損耗模量都增加，表明干酪的彈性和黏性都變高，這與質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果一致。此外，整個升溫過程中儲能模量一直大于損耗模量，損耗角正切值始終小于1，說明各成熟階段干酪都以彈性形變?yōu)橹鳎饕憩F(xiàn)出固態(tài)物體的性質(zhì)。

圖4 Edam牦牛干酪成熟過程中儲能模量（a）、損耗模量（b）和損耗角正切值（c）的變化Fig.4 Changes in storage modulus (a),loss modulus (b) and tanδ (c)during ripening of Edam yak cheese

2.4 Edam牦牛干酪成熟過程中蛋白質(zhì)分解指標(biāo)分析

2.4.1 Edam牦牛干酪成熟過程中總氮含量分析

由圖5可知，隨著成熟時間的延長，總蛋白質(zhì)含量逐漸增加，各階段干酪的總氮含量差異顯著（P＜0.05）。CN是干酪骨架的主要支撐，水分和脂肪存在于蛋白骨架間的空隙中。CN結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要由蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與鈣離子間的各種分子間作用力維持，水分和脂肪分子中形成的分子間作用力相對較弱，水分流動性強(qiáng)[37]。因此，在成熟過程中由于水分流失導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量逐漸上升。

圖5 Edam牦牛干酪成熟過程中總氮含量的變化Fig.5 Changes in total nitrogen content during ripening of Edam yak cheese

2.4.2 Edam牦牛干酪成熟過程中pH 4.6-SN含量分析

pH 4.6-SN含量為干酪中游離大分子肽、小分子肽和游離氨基酸的總量，其中大部分為凝乳酶產(chǎn)生的SN組分，代表蛋白質(zhì)水解的廣度。由圖6可知，隨著成熟時間的延長，不同階段干酪中pH 4.6-SN含量差異顯著（P＜0.05），從2.62%增加到18.11%。成熟過程中，蛋白質(zhì)在凝乳酶和其余蛋白酶的作用下水解成不同分子質(zhì)量的肽，使SN不斷累積。

圖6 Edam牦牛干酪成熟過程中pH 4.6-SN含量的變化Fig.6 Changes in pH 4.6-soluble nitrogen content in Edam yak cheese during maturation

2.4.3 Edam牦牛干酪成熟過程中12% TCA-SN含量分析

12% TCA-SN含量代表小分子肽（2～20 個殘基）和游離氨基酸的含量，主要由發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑乳酸菌蛋白酶和肽酶產(chǎn)生[38]，代表蛋白質(zhì)水解的深度。由圖7可知，隨著成熟時間的延長，各階段干酪的12% TCA-SN含量差異顯著（P＜0.05），由3.45%上升至13.70%。這是由于細(xì)胞成熟后，肽酶從凋亡的細(xì)胞體中釋放出來，大分子肽在肽酶和殘余凝乳酶作用下降解為小肽和游離氨基酸，導(dǎo)致12% TCA-SN含量逐漸增加。Zaravela等[39]將山羊乳制備的奶酪進(jìn)行發(fā)酵成熟，成熟過程中12% TCASN含量也呈上升趨勢，但成熟60 d時僅達(dá)到5.91%，明顯低于牦牛干酪。

圖7 Edam牦牛干酪成熟過程中12% TCA-SN含量的變化Fig.7 Changes in 12% TCA-soluble nitrogen content in Edam yak cheese during maturation

2.5 Edam牦牛干酪成熟過程中脂肪分解指標(biāo)分析

2.5.1 Edam牦牛干酪成熟過程中脂肪含量分析

由圖8可知，隨著成熟時間的延長，Edam牦牛干酪的脂肪含量呈先上升后下降趨勢。由于脂肪酶的存在，干酪成熟過程中脂肪處于分解狀態(tài)。成熟初期，由于干酪水分流失較快，脂肪分解速率遠(yuǎn)小于水分流失速率，所以脂肪占比逐漸上升；后期水分含量趨于穩(wěn)定，隨著干酪中微生物的不斷增長，脂肪酶的含量也逐漸增多，脂肪分解加快，因此出現(xiàn)脂肪含量下降的現(xiàn)象。

圖8 Edam牦牛干酪成熟過程中脂肪含量的變化Fig.8 Changes in fat content of Edam yak cheese during maturation

2.5.2 Edam牦牛干酪成熟過程中游離脂肪酸含量分析

由圖9可知，隨著成熟時間的延長，Edam牦牛干酪中游離脂肪酸含量逐漸上升，說明脂肪的水解在持續(xù)進(jìn)行。成熟0～20 d內(nèi)游離脂肪酸含量上升速率最快，后期速率減緩。這可能與脂肪酶活力有關(guān)，前期水分含量較高，脂肪酶不斷將脂肪分解產(chǎn)生游離脂肪酸，后期水分含量降低，氧化速率增加緩慢。趙征等[40]測得牛乳干酪在10 ℃成熟90 d的游離脂肪酸含量為19.79%，低于本研究結(jié)果，這可能與牦牛乳高脂肪含量以及成熟溫度有關(guān)。

圖9 Edam牦牛干酪成熟過程中游離脂肪酸含量的變化Fig.9 Changes in free fatty acid content in Edam yak cheese during ripening

2.5.3 Edam牦牛干酪成熟過程中TBA值分析

TBA可以將脂質(zhì)過氧化降解產(chǎn)物丙二醛著色，通過檢測丙二醛相對含量的變化，可反映出干酪中脂肪過氧化的情況。由圖10可知，隨著成熟時間的延長，干酪的TBA值呈逐漸上升趨勢，由最初的0.0169 mg/kg上升至0.1621 mg/kg。因此干酪在成熟過程中，伴有脂肪過氧化現(xiàn)象，但過氧化程度不大，對干酪的品質(zhì)影響較小。

圖10 Edam牦牛干酪成熟過程中TBA值的變化Fig.10 Changes in TBA value in Edam yak cheese during ripening

2.6 Edam牦牛干酪成熟過程中CN結(jié)構(gòu)分析

2.6.1 CN純度分析

CN和乳清蛋白是牦牛乳中的主要蛋白，大部分乳清蛋白在干酪制作過程中被排除，CN得以保留成為干酪的主要基質(zhì)，干酪成熟過程中，CN的結(jié)構(gòu)變化會導(dǎo)致干酪的質(zhì)地改變，而高純度的CN是準(zhǔn)確探究其結(jié)構(gòu)的前提。由表4可知，從Edam牦牛干酪中提取的CN純度相對較高，可以作為后續(xù)CN結(jié)構(gòu)研究的實(shí)驗(yàn)材料。

表4 不同Edam牦牛干酪成熟階段CN純度的變化Table 4 Changes in CN purity in Edam yak cheese at different maturation stages

2.6.2 SDS-PAGE分析

由圖11可知，電泳圖譜共有8 條清晰電泳帶。參考Ianni等[41]的文獻(xiàn)，得到電泳帶從上向下依次是αs2-CN、αs1-CN、β-CN、κ-CN和4 種CN水解副產(chǎn)物。αs1-CN和αs2-CN是凝膠中的主要電泳帶，說明在CN中αs-CN的含量最高。隨著成熟時間的延長，電泳帶顏色變淺、變窄，說明在干酪成熟過程中，CN一直處于分解的狀態(tài)，80 d時變化明顯，表明α-CN、β-CN和κ-CN等大分子蛋白已被降解為小分子肽和游離氨基酸。

圖11 Edam牦牛干酪成熟過程中SDS-PAGE圖譜Fig.11 SDS-PAGE patterns of casein components in Edam yak cheese during ripening

2.6.3 傅里葉變換紅外光譜分析

由圖12可知，CN二級結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角含量最多，其次為無規(guī)卷曲、β-折疊、α-螺旋。隨著成熟時間的延長，α-螺旋和β-折疊逐漸減少，而無歸卷曲逐漸增多，說明CN的二級結(jié)構(gòu)逐漸由有序向無序轉(zhuǎn)變。干酪在成熟過程中大分子肽逐漸被分解為小分子肽，蛋白質(zhì)由穩(wěn)定向不穩(wěn)定發(fā)展。α-螺旋向無規(guī)卷曲的轉(zhuǎn)化受pH值的影響，隨著pH值逐漸降低，α-螺旋內(nèi)氫鍵遭到破壞，無法形成螺旋結(jié)構(gòu)，逐漸向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化。β-折疊是兩條肽鏈之間通過氫鍵維持的一種結(jié)構(gòu)，成熟過程中維持β-折疊穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，導(dǎo)致β-轉(zhuǎn)角的含量在成熟40 d后逐漸增加。

圖12 Edam牦牛干酪成熟過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化Fig.12 Changes in protein secondary structure of Edam yak cheese during ripening

2.6.4 總巰基含量和羰基含量測定分析

總巰基含量反映蛋白質(zhì)降解的程度。羰基含量越高，蛋白質(zhì)氧化程度越高[42]。由圖13可知，隨著干酪成熟時間的延長，CN中總巰基含量一直呈顯著下降趨勢（P＜0.05），由最初的0.0416 mmol/g下降至0.0306 mmol/g。干酪成熟過程中，CN的巰基由于氧化脫氫生成二硫鍵，導(dǎo)致巰基含量不斷減少。由圖14可知，隨著干酪成熟時間的延長，CN中羰基含量呈顯著上升趨勢（P＜0.05），由最初的1.12 nmol/mg上升至2.48 nmol/mg。羰基含量增加表明醛類、酮類、有機(jī)酸等小分子羰基化合物在積累，脂質(zhì)氧化程度增加。CN的巰基含量減少而羰基含量增加，導(dǎo)致干酪抗氧化能力逐漸減弱。

圖13 Edam牦牛干酪成熟過程中總巰基含量的變化Fig.13 Changes in total sulfhydryl content in Edam yak cheese during ripening

圖14 Edam牦牛干酪成熟過程中羰基含量的變化Fig.14 Changes in carbonyl content in Edam yak cheese during ripening

2.6.5 表面疏水性測定分析

表面疏水性直接影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、空間構(gòu)象和功能特性[43]。由圖15可知，隨著干酪成熟時間的延長，CN表面疏水性逐漸增強(qiáng)，吸光度從2.60增加到3.46。CN在其多肽鏈中有相當(dāng)一部分非極性區(qū)域，這是因?yàn)楦衫页墒爝^程中的氧化反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)的改變，三級結(jié)構(gòu)的開放和更多疏水區(qū)域的暴露，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性增加，保水性下降。

圖15 Edam牦牛干酪成熟過程中表面疏水性的變化Fig.15 Changes in surface hydrophobicity of Edam yak cheese during ripening

2.7 成熟時間與各指標(biāo)相關(guān)性分析

由圖16所示，成熟時間與a*值、b*值、膠黏性、總氮含量、pH 4.6-SN含量、12% TCA-SN含量、TBA值、羰基含量、表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；成熟時間與硬度、彈性、游離脂肪酸含量、β-轉(zhuǎn)角含量、無規(guī)卷曲含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；此外，成熟時間與水分含量、pH值、L*值、凝聚性、α-螺旋含量、β-折疊含量、總巰基含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；其中，成熟時間與總氮含量、pH 4.6-SN含量、12% TCA-SN含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.973、0.989、0.995，說明成熟時間對蛋白的水解有著重要影響。此外，硬度、彈性、凝聚性、膠黏性與pH 4.6-SN含量、12% TCA-SN含量均存在顯著相關(guān)性（P＜0.05），說明蛋白質(zhì)的降解能夠顯著影響干酪質(zhì)構(gòu)特性。綜上，成熟時間對干酪的色度、質(zhì)構(gòu)、脂肪氧化、蛋白質(zhì)的降解與結(jié)構(gòu)均有顯著影響。

圖16 成熟時間與各指標(biāo)之間的相關(guān)性熱圖Fig.16 Heat map of correlation between maturity time and quality indices

3 結(jié)論

研究了Edam牦牛干酪在0～80 d成熟過程中的品質(zhì)變化，結(jié)果表明：感官評分呈先下降后上升趨勢，在40 d時有所改觀；水分含量呈下降趨勢；pH值由5.85降到4.96；色度指標(biāo)中，L*值呈下降趨勢，a*和b*值呈上升趨勢；干酪的硬度、彈性、膠黏性呈上升趨勢，凝聚性整體呈下降趨勢；儲能模量與損耗模量上升，干酪彈性和黏性上升，干酪以彈性形變?yōu)橹?；總氮含量、pH 4.6-SN含量、12% TCA-SN含量都有不同程度的升高，蛋白質(zhì)不斷降解為小肽和游離氨基酸；脂肪含量呈先上升后下降趨勢；游離脂肪酸含量和TBA值持續(xù)上升，脂肪有一定程度氧化，但未對干酪品質(zhì)產(chǎn)生明顯影響。

對成熟過程中CN結(jié)構(gòu)變化的測定結(jié)果表明：CN的主要組分為αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-CN和4 種CN水解副產(chǎn)物，且一直處于分解狀態(tài)；成熟80 d時，α-CN、β-CN和κ-CN等大分子蛋白已被降解為小分子肽和游離氨基酸；成熟過程中CN二級結(jié)構(gòu)不斷變化，β-折疊、α-螺旋逐漸向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，說明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)逐漸由有序向無序轉(zhuǎn)變；蛋白質(zhì)不斷降解，氧化性增強(qiáng)，表面疏水性逐漸上升，保水性逐漸下降。

綜上所述，隨著成熟時間的延長，干酪中水分、pH值不斷降低，蛋白質(zhì)不斷降解，有效改善干酪的質(zhì)構(gòu)、流變學(xué)特性與色澤，從而形成成熟干酪特有的組織狀態(tài)和風(fēng)味。結(jié)合感官評價、質(zhì)構(gòu)特性與蛋白質(zhì)降解情況，Edam牦牛干酪適宜成熟時間為60～80 d，此期間干酪內(nèi)部呈現(xiàn)淡黃色，富有成熟Edam干酪的香氣，具有微彈性，軟硬適中，小分子肽和游離氨基酸含量豐富，易于消化吸收，具有較高營養(yǎng)價值。本研究為青藏高原開發(fā)新型牦牛乳制品提供了一定理論依據(jù)，為后續(xù)CN的相關(guān)研究提供參考。