李 婷，廖梓康，李 珍，吳金鴻，汪少蕓，黃軼群，王發(fā)祥，劉永樂，李向紅,

（1.長沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；2.湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410114；3.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；4.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108）

晚期糖化終末產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs）是在非酶促條件下，由蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)的游離氨基與還原糖的活性羰基經(jīng)過縮合、重排、裂解、氧化修飾等途徑形成的一系列結(jié)構(gòu)復(fù)雜的共價(jià)加成物[1]，可與人體多種組織細(xì)胞結(jié)合，增加多種慢性疾病的發(fā)病概率，危害人類健康[2]。食源性AGEs主要通過美拉德反應(yīng)形成，還可以通過還原糖的自氧化、脂質(zhì)過氧化和多元醇降解等途徑生成[3-5]。食品的熱加工過程會促使脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生氧化降解，產(chǎn)生大量活性氧自由基，誘導(dǎo)形成更活躍的α-二羰基化合物，如乙二醛（glyoxal，GO）和丙酮醛（methylglyoxal，MGO）等，可與賴氨酸和精氨酸殘基直接反應(yīng)生成AGEs[6]。

鰱魚（又稱白鰱）價(jià)格低廉，產(chǎn)量大，養(yǎng)殖產(chǎn)量在2020年達(dá)381.29萬 t，占全國淡水魚產(chǎn)量的12.34%，是我國冷凍魚糜加工的主要淡水魚品種[7]。魚糜制品是以冷凍魚糜為主要原料加工得到的水產(chǎn)制品，口感細(xì)嫩，營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛[8]。由于我國目前的冷鏈系統(tǒng)并不完善，在貯運(yùn)、銷售或消費(fèi)過程中，凍藏環(huán)境會產(chǎn)生較大的溫度波動(dòng)，導(dǎo)致凍結(jié)食品的多次解凍和再凍結(jié)[9]。魚糜制品含有豐富的蛋白質(zhì)和少量的脂質(zhì)，且需經(jīng)過斬拌、加熱等工序；原料的凍融和熱加工過程會引起脂肪氧化及蛋白質(zhì)降解[10]，極有可能促進(jìn)AGEs的形成，但目前國內(nèi)外鮮有關(guān)于凍融及加工工序中魚糜制品的脂肪氧化和蛋白質(zhì)降解與AGEs產(chǎn)生規(guī)律的報(bào)道。

因此，本研究將鰱魚魚糜在不同凍藏溫度下（-20、-60 ℃）進(jìn)行多次凍融循環(huán)（6 次）后，測定熱加工過程中（45 ℃、30 min和45 ℃、30 min+90 ℃、20 min）魚糜制品脂肪氧化、蛋白質(zhì)降解、內(nèi)源性熒光、α-二羰基化合物及AGEs的變化情況，分析凍融循環(huán)及加熱過程對魚糜制品中脂肪氧化、蛋白質(zhì)降解和AGEs形成的影響，探討脂肪氧化、蛋白質(zhì)降解與AGEs形成的相關(guān)性，以期獲得凍融循環(huán)和熱加工魚糜制品中AGEs形成機(jī)制，為優(yōu)化原料凍藏條件及魚糜制品加工方法以降低AGEs的產(chǎn)生提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚購于湖南省長沙市高云市場，每尾質(zhì)量（2.5±0.5）kg。

木瓜蛋白酶（10 U/mg） 美國Sigma公司；羧甲基賴氨酸（Nε-carboxylmethyl-lysine，CML）、D4-CML加拿大Toronto Research Chemicals有限公司；混合型強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱（CNW Poly-Sery MCX SPE）中國安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T10型手持式均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司；LD5-10型離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；DYCZ-25D型電泳儀北京六一生物科技有限公司；ZB-20型斬拌機(jī) 山東諸城華鋼機(jī)械有限公司；EVOQ GC-TQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 德國布魯克公司；F-7100型熒光分光光度儀日本日立有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津有限公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（2695 HPLC系統(tǒng)）美國Waters公司；Qtrap 4500 MS系統(tǒng) 新加坡AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜制品的制備

新鮮的鰱魚取背部白肉，用冰水清洗3 次后瀝干表面水分。魚肉中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的食鹽，在斬拌機(jī)中斬拌6 min，期間加入冰水以降低魚糜溫度。將制備好的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（82.04±0.11）%的鰱魚魚糜分別在-20 ℃和-60 ℃冷凍9 h，然后在4 ℃解凍15 h，為1 次凍融循環(huán)。魚糜經(jīng)過0、3、6 次凍融循環(huán)（0-FT、3-FT、6-FT）后，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%的木薯淀粉，充分混合，為未加熱魚糜制品，于45 ℃加熱30 min，為一段加熱魚糜制品；在45 ℃加熱30 min后繼續(xù)在90 ℃加熱20 min，為二段加熱魚糜制品。

1.3.2 揮發(fā)性脂肪氧化產(chǎn)物的測定

魚糜制品的脂肪氧化基于頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測[11]。在3.00 g樣品中加入7 mL飽和NaCl溶液，均質(zhì)30 s，取7.00 g混合物及100 μL內(nèi)標(biāo)2,4,6-三甲基吡啶（0.01 mg/mL）于20 mL頂空氣相瓶中。

氣相色譜條件：DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：色譜柱初溫40 ℃，保持4 min，以5 ℃/min升溫至90 ℃，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min；柱溫40 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，壓力51.3 MPa，總流量17.3 mL/min。以1 mL/min氦氣的恒定流速流動(dòng)，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電離電壓70 eV；離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；全掃描模式；掃描速率769 u/s；質(zhì)量掃描范圍33～500 u。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

取1.00 g樣品于10 mL的2 mg/mL SDS溶液中均質(zhì)，室溫下放置30 min，6000 r/min離心10 min，取0.5 mL上清液，與等體積2 倍還原樣品緩沖液混合，沸水浴5 min后以10000 r/min離心3 min。隨后分別配制濃縮膠和分離膠，將其灌入電泳裝置。加樣后在濃縮膠電流恒定15 mA，分離膠電流恒定25 mA的模式下進(jìn)行電泳。

1.3.4 游離賴氨酸含量的測定

取2.00 g樣品，加入10 mL 0.01 mol/L鹽酸，均質(zhì)30 s后低溫下超聲30 min，定容至50 mL，加入等體積的80 mg/mL磺基水楊酸溶液，于4 ℃靜置12 h，混勻后以6000 r/min離心10 min，取2 mL上清液以11000 r/min再次離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜后用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行檢測分析。用外標(biāo)法計(jì)算樣品中賴氨酸的含量。

1.3.5 內(nèi)源性熒光的測定

在1.00 g樣品中加入10 mL 0.02 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（0.6 mol/L NaCl，pH 6.5）后均質(zhì)，6000 r/min離心10 min，使用熒光分光光度計(jì)對上清液進(jìn)行光譜掃描，激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長310～500 nm，狹縫寬度5 nm。

1.3.6 二羰基化合物的測定

實(shí)驗(yàn)參考Li Lin等[3]的方法。在2.00 g樣品中加入10 mL 0.6 mol/L的高氯酸溶液，均質(zhì)后于4 ℃靜置15 min，8000 r/min離心10 min。取1 mL上清液，加入0.2 mL 0.25 mg/mL的鄰苯二胺溶液，在60 ℃避光加熱3 h，冷卻后過0.22 μm的濾膜，上機(jī)。使用Capcell PAK C18AQ色譜柱（4.6 mm×250 mm），洗脫液分別為0.15%（V/V）的乙酸溶液（溶劑A）和乙腈（溶劑B）。梯度洗脫程序：0～1.0 min，92% A，8% B；1.0～10.0 min，92%～60% A，8%～40% B；10.0～12.0 m i n，60%～52% A，40%～48% B；12.0～13.0 min，52%～40% A，48%～60% B；13.0～15.5 min，40%～20% A，60%～80% B；15.5～20.5 min，20%～96% A，80%～8% B；20.5～25.0 min，92% A，8% B。流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，樣品進(jìn)樣量20 μL，檢測波長313 nm。

1.3.7 AGEs的提取檢測

1.3.7.1 CML的提取檢測

實(shí)驗(yàn)按照Niu Lihong等[1]的方法略有改動(dòng)。稱取0.20 g樣品，加入2 mL硼酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 9.2）和0.4 mL硼氫化鈉溶液（2 mol/L），充分混勻后于4 ℃還原8 h；加入4 mL氯仿-甲醇溶液（1∶2，V/V），充分混勻后在4500 r/min離心10 min。除去液體，加入4 mL 6 mol/L鹽酸，于110 ℃酸解24 h；酸解完的樣品加水定容至10 mL，取2 mL溶液于燒杯中，加入200 μL 0.002 mg/mLD4-CML內(nèi)標(biāo)，于50 ℃進(jìn)行真空干燥。干燥后的樣品復(fù)溶于4 mL水中，取2 mL溶液進(jìn)行過MCX固相萃取小柱，洗脫液于60 ℃水浴氮吹，干燥后復(fù)溶于2 mL甲醇-水溶液（4∶1，V/V），經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后收集待測。使用2695 HPLC系統(tǒng)和Qtrap 4500串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)在電噴霧離子源正電離模式下進(jìn)行分析檢測。HPLC系統(tǒng)中使用Atlantis親水相互作用液相色譜硅膠柱（HILIC，150 mm×2.1 mm，3 μm）對樣品中的CML進(jìn)行分離。

1.3.7.2 熒光AGEs的提取檢測

實(shí)驗(yàn)參考Verzijl等[12]的方法并有所改動(dòng)。將樣品凍干后研磨成粉末狀，取0.015 g凍干粉，加1 mL 2.5 U/mL的木瓜蛋白酶溶液，在55 ℃條件下振蕩4 h，11000 r/min離心15 min，上清液過0.45 μm濾膜進(jìn)行熒光分析。激發(fā)波長365 nm；發(fā)射波長380～600 nm；狹縫寬度5 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 凍融循環(huán)和熱加工過程中魚糜制品的脂肪氧化

脂肪氧化是造成魚肉不良?xì)馕兜闹饕颍扇?-辛烯-3-醇的含量可反映水產(chǎn)品脂肪氧化的程度[13]。醛類化合物屬于次級脂肪氧化產(chǎn)物，由不飽和脂肪酸中的氫過氧化物β-裂解產(chǎn)生，壬醛是油酸在血紅蛋白的催化下氧化降解而形成[14]。如圖1所示，凍融循環(huán)溫度對魚糜制品中壬醛含量無顯著影響（P＞0.05）。凍融循環(huán)對一段加熱魚糜制品中壬醛的含量無明顯影響，但隨著凍融次數(shù)增加，未加熱和二段加熱的魚糜制品中壬醛含量增加，且在6 次凍融循環(huán)后達(dá)到最大值（P＜0.05）。在未加熱樣品中，經(jīng)過6 次凍融后，壬醛含量從（206.05±0.68）ng/g增加至（244.01±32.17）ng/g（-20 ℃）和（237.47±19.69）ng/g（-60 ℃），壬醛含量的增加，說明凍融循環(huán)加劇了魚糜制品中不飽和脂肪酸的過氧化。加工工序?qū)ξ磧鋈谘h(huán)處理的樣品中壬醛的含量無明顯影響，在Li Dongping等[15]的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的情況。但在加熱處理過的魚糜制品中，壬醛含量先降低后增加，在-20 ℃經(jīng)過6 次凍融循環(huán)后的樣品中，一段加熱后，壬醛含量從先（244.01±32.18）ng/g降低至（212.28±14.68）ng/g，二段加熱后又增加至（259.58±3.05）ng/g。壬醛含量的降低表明其降解或消失速率大于形成速率，生成的壬醛可能與氨基酸、肽進(jìn)一步反應(yīng)，從而導(dǎo)致其含量降低[14]。

圖1 凍融循環(huán)及熱加工過程中魚糜制品的揮發(fā)性脂肪氧化產(chǎn)物含量變化Fig.1 Changes in contents of volatile fat oxidation products in surimi during freeze-thaw cycles and thermal processing

醇類化合物由脂肪酸二級氫過氧化物的降解或羰基化合物還原而形成，1-辛烯-3-醇是花生四烯酸在12-脂氧合酶的氧化催化下作用形成[15]。如圖1所示，經(jīng)過6 次凍融循環(huán)后，1-辛烯-3-醇含量顯著增加（P＜0.05），但凍融循環(huán)溫度對魚糜制品中1-辛烯-3-醇含量無顯著影響（P＞0.05）。經(jīng)過不同次數(shù)的凍融循環(huán)的二段加熱樣品中，-20 ℃和-60 ℃凍融的魚糜制品中1-辛烯-3-醇的含量分別增加了43.01 ng/g（3 次）、94.53 ng/g（6 次）和49.87 ng/g（3 次）、99.63 ng/g（6 次）。任興晨[16]對帶魚魚糜制品進(jìn)行貯藏時(shí)發(fā)現(xiàn)，1-辛烯-3-醇的含量隨著貯藏的時(shí)間延長而增加，并在第12天達(dá)到最大值。在未進(jìn)行凍融的樣品中，熱處理對魚糜制品中的1-辛烯-3-醇的含量沒有影響，但在進(jìn)行3 次和6 次凍融循環(huán)后，加工工序?qū)ζ浜坑绊戯@著（P＜0.05）。與未加熱樣品相比，6 次凍融后的二段加熱后的樣品中1-辛烯-3-醇的含量分別增加了58.65 ng/g（—20 ℃）和85.61 ng/g（—60 ℃），可能是在前期的凍融循環(huán)中，雖然1-辛烯-3-醇含量較低，但隨著脂肪氧化程度的增加，1-辛烯-3-醇的前體物質(zhì)花生四烯酸的含量增加，在加熱后進(jìn)一步氧化產(chǎn)生了更多的1-辛烯-3-醇。

2.2 凍融循環(huán)和熱加工過程中魚糜制品的蛋白質(zhì)降解

鰱魚肌肉蛋白質(zhì)中肌原纖維蛋白（主要由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白組成）占總數(shù)的60%～70%[17]。如圖2所示，樣品中蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量在10～200 kDa之間，各樣品均以肌球蛋白重鏈（200 kDa）和肌動(dòng)蛋白（40～50 kDa）為主。凍融溫度對魚糜制品的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量沒有明顯影響。隨著凍融次數(shù)增加，不同條帶之間的變化均不顯著，可能是因?yàn)轸~肉的主要蛋白為鹽溶性的肌原纖維蛋白，而樣品提取時(shí)用的SDS溶液沒有高效地將其提取出來，導(dǎo)致總蛋白在凍融中的變化趨勢不夠顯著。Jiang Qingqing等[18]在對金槍魚進(jìn)行凍融循環(huán)時(shí)發(fā)現(xiàn)，即使凍融到第8次，樣品的總蛋白質(zhì)組成也沒有明顯差異，但隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，水溶性蛋白和肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜存在顯著差異。隨著加工工序增加，肌球蛋白重鏈逐漸變淡，新增了分子質(zhì)量為150、120 kDa及30 kDa的蛋白，70～85 kDa的條帶明顯加深，說明在加熱過程中，魚糜制品中肌球蛋白逐漸降解成小分子蛋白。而肌動(dòng)蛋白在加熱過程中無明顯變化，說明肌動(dòng)蛋白在加熱時(shí)較為穩(wěn)定，魚糜制品分段加熱過程中的溫度對其影響不大，這與陳躍文等[19]的研究一致。

圖2 凍融循環(huán)及熱加工過程中魚糜制品的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE patterns of proteins in surimi during freeze-thaw cycles and thermal processing

游離氨基酸含量可反映蛋白質(zhì)降解情況，其中，賴氨酸是CML的重要前體之一，其側(cè)鏈中的2 個(gè)伯氨基是氨基酸中最具糖基化反應(yīng)活性的結(jié)構(gòu)[20]，賴氨酸含量與樣品中CML的生成密切相關(guān)。由圖3可知，隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，未加熱和加熱處理后的魚糜制品中游離賴氨酸的含量均增加，在第6次凍融循環(huán)后達(dá)到最大值，在-20 ℃和-60 ℃凍融6 次后，未加熱魚糜制品中賴氨酸含量從（29.86 ± 0.61）mg/100 g分別增加到（31.49±0.71）mg/100 g和（31.09±0.61）mg/100 g。劉秀英等[21]也發(fā)現(xiàn)隨著4 ℃貯藏時(shí)間的延長，馬面魚肉中賴氨酸含量逐漸增加，在第7天后達(dá)到最大值。而隨著加工工序的增加，魚糜制品中賴氨酸的含量先增加后略微降低。Zhu Zongshuai等[22]對燉雞進(jìn)行加工時(shí)也發(fā)現(xiàn)，隨著煎炸時(shí)間的延長，賴氨酸含量逐漸增加，但經(jīng)過進(jìn)一步的煮沸和高溫殺菌后，賴氨酸含量均降低，可能是煎炸促進(jìn)了美拉德反應(yīng)，進(jìn)一步的煮沸和高溫處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)熱降解，賴氨酸逐漸暴露和釋放，此過程中賴氨酸可能與二羰基結(jié)合形成AGEs，導(dǎo)致其含量的降低。

圖3 凍融循環(huán)及熱加工過程中魚糜制品的賴氨酸含量變化Fig.3 Changes in lysine content in surimi during freeze-thaw cycles and thermal processing

2.3 凍融循環(huán)和熱加工過程中魚糜制品的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度變化

內(nèi)源性熒光強(qiáng)度可以反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化[23]。如圖4所示，凍融循環(huán)溫度對內(nèi)源性熒光物質(zhì)含量無顯著影響（P＞0.05）。隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，魚糜制品的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度逐漸增加（P＜0.05）。除了色氨酸殘基的變化，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)與水的相互作用也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，從而導(dǎo)致內(nèi)源性熒光的增加[24-25]。Karoui等[26]對鯛魚魚肉進(jìn)行內(nèi)源性熒光測定時(shí)也發(fā)現(xiàn)凍融循環(huán)增加，熒光強(qiáng)度隨之增加。在同一凍融循環(huán)條件下，內(nèi)源性熒光強(qiáng)度隨著加工工序增加顯著降低（P＜0.05）。在未經(jīng)過凍融循環(huán)的樣品中，一段加熱和二段加熱分別使魚糜制品中內(nèi)源性熒光的強(qiáng)度降低了1895.67和3989.97。加熱過程會導(dǎo)致魚肉蛋白質(zhì)的變性聚集，破壞其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降[27]。

圖4 凍融循環(huán)及熱加工過程中魚糜制品的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度變化Fig.4 Changes in endogenous fluorescence of surimi during freezethaw cycles and thermal processing

2.4 凍融循環(huán)和熱加工過程中魚糜制品的α-二羰基化合物含量變化

GO和MGO是典型的α-二羰基化合物，也是重要的AGEs前體物質(zhì)[28]，其含量變化如圖5所示。凍融循環(huán)溫度對魚糜制品中α-二羰基化合物含量無顯著影響（P＞0.05）。凍融循環(huán)次數(shù)增加，魚糜制品中GO、MGO的含量均有所降低，在未加熱樣品中未表現(xiàn)出顯著性（P＞0.05），但在6 次凍融循環(huán)后的一段加熱和二段加熱樣品表現(xiàn)出顯著性（P＜0.05）。經(jīng)過6 次凍融后，二段加熱樣品GO的含量分別降低了31.57%（-20 ℃）和27.27%（-60 ℃），MGO的含量分別降低了22.49%（-20 ℃）和22.64%（-60 ℃）。α-二羰基化合物可由美拉德反應(yīng)、糖類的自氧化、脂肪氧化和微生物發(fā)酵等多種途徑形成，而魚糜制品中富含不飽和脂肪酸，主要通過脂肪氧化途徑形成α-二羰基化合物[6]。在凍融過程中，脂肪氧化在不斷發(fā)生，形成了許多小分子物質(zhì)，還未生成GO和MGO，與此同時(shí)，魚肉中原本含有的GO和MGO也在不斷發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)，造成凍融期間其含量降低[29]。如圖5所示，GO和MGO經(jīng)過不同加工工序后均有不同程度的增加，GO和MGO的含量在一段加熱后均略微增加，較低的加熱溫度使其增加較為緩慢，在二段加熱后顯著增加（P＜0.05）。在-20 ℃下進(jìn)行不同凍融循環(huán)的樣品中，與未加熱相比，一段加熱使GO和MGO含量增加了0.01～0.04 μg/g和0.03～0.05 μg/g，二段加熱使GO和MGO含量增加了0.10～0.24 μg/g和0.08～0.14 μg/g；-60 ℃凍融的樣品趨勢與-20 ℃一致，一段加熱使GO和MGO含量增加了0.01～0.03 μg/g和0.02～0.04 μg/g，二段加熱使GO和MGO含量增加了0.07～0.24 μg/g和0.07～0.14 μg/g。Maasen等[6]對223 種不同類型食物中的二羰基化合物含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)煎、炸等高溫處理方式比煮、蒸等較為溫和的加工方式會產(chǎn)生更多的二羰基化合物，且處理時(shí)間越長，其含量越高。

圖5 凍融循環(huán)及熱加工過程中魚糜制品的α-二羰基化合物含量變化Fig.5 Changes in contents of α-dicarbonyl compounds in surimi during freeze-thaw cycles and thermal processing

2.5 凍融循環(huán)和熱加工過程中魚糜制品的AGEs含量變化

2.5.1 凍融循環(huán)和熱加工過程中魚糜制品的CML含量變化

目前，在已發(fā)現(xiàn)的20多種AGEs中，CML被廣泛用作代表性物質(zhì)進(jìn)行研究[30]。如圖6所示，凍融循環(huán)溫度對魚糜制品中CML的含量無顯著影響（P＞0.05）。在未加熱樣品中，凍融循環(huán)對CML含量無明顯影響（P＞0.05），但在加熱的樣品中，經(jīng)過6 次凍融循環(huán)后，CML含量顯著增加（P＜0.05）。與未凍融樣品相比，一段加熱和二段加熱的樣品經(jīng)過6 次凍融循環(huán)后CML的含量增加了0.22 mg/kg（-20 ℃）、0.49 mg/kg（-60 ℃）和0.31 mg/kg（-20 ℃）、0.69 mg/kg（-60 ℃）。加工工序顯著促進(jìn)了魚糜制品中CML含量的增加（P＜0.05）。樣品在凍融循環(huán)中發(fā)生脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)降解，這些變化（如肽鍵的斷裂和氨基酸殘基的暴露）有助于在加熱過程中產(chǎn)生CML，導(dǎo)致在二段加熱后CML含量迅速增加[31]。Yu Ligang等[32]發(fā)現(xiàn)生豬肉凍藏時(shí)間從0 d增加至120 d后，熱加工制成的肉丸中的CML含量從13.26 mg/kg蛋白顯著增加到43.30 mg/kg蛋白。

圖6 凍融循環(huán)及熱加工過程中魚糜制品的CML含量變化Fig.6 Changes in CML content of surimi during freeze-thaw cycles and thermal processing

2.5.2 凍融循環(huán)和熱加工過程中魚糜制品的熒光AGEs含量變化

具有熒光吸收特性的AGEs被統(tǒng)稱為熒光AGEs，如戊糖素和交聯(lián)素等，其含有較多的雜環(huán)結(jié)構(gòu)[33]。如圖7所示，隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，熒光AGEs含量增加（P＜0.05），在第6次凍融循環(huán)后達(dá)到最大值，凍融循環(huán)溫度對魚糜制品中熒光AGEs的含量無顯著影響（P＞0.05），與CML的變化趨勢一致。與未凍融樣品相比，在-20 ℃和-60 ℃凍融6 次后，未加熱、一段加熱、二段加熱的樣品中的熒光AGEs含量分別增加了95.97（-20 ℃）、88.60（-60 ℃）、67.33（-20 ℃）、41.13（-60 ℃）、121.83 AU（-20 ℃）和63.10 AU（-60 ℃）。在不同凍融循環(huán)次數(shù)的樣品中，加工工序增加，熒光AGEs的含量也顯著增加（P＜0.05）。在第0天未加熱樣品中，一段加熱和二段加熱分別使熒光AGEs含量增加了17.03%和62.99%。加熱的時(shí)間和溫度會顯著增加魚糜制品中的蛋白質(zhì)降解和脂肪氧化程度，促進(jìn)樣品中熒光AGEs的形成。Wu Runlin等[34]在對草魚塊進(jìn)行油炸處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，油炸后的樣品中熒光AGEs含量顯著增加，且油炸時(shí)間越長，其含量越高。

圖7 凍融循環(huán)及熱加工過程中魚糜制品的熒光AGEs含量變化Fig.7 Changes in fluorescent AGEs content in surimi during freezethaw cycles and thermal processing

2.6 魚糜制品中脂肪氧化、蛋白質(zhì)降解與AGEs的相關(guān)性分析和AGEs形成機(jī)制分析

魚糜制品在經(jīng)過不同凍融循環(huán)和加工工序后脂肪氧化和蛋白質(zhì)降解與AGEs之間的相關(guān)性尚不明確，因此，對各指標(biāo)之間進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)及顯著性水平見表1。結(jié)果顯示，壬醛、1-辛烯-3-醇與凍融循環(huán)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），GO與凍融循環(huán)呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說明脂肪氧化與凍融循環(huán)次數(shù)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。1-辛烯-3-醇、賴氨酸與熱加工過程呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），內(nèi)源性熒光物質(zhì)與熱加工過程呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），GO、MGO、CML、熒光AGEs與熱加工過程呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明脂肪氧化、蛋白質(zhì)降解以及AGEs的形成與熱加工過程存在很強(qiáng)的相關(guān)性。根據(jù)相關(guān)性結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，與凍融循環(huán)次數(shù)相比，熱加工過程是影響AGEs及其前體物質(zhì)形成的主要因素。CML和熒光AGEs均與1-辛烯-3-醇、MGO呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與賴氨酸、GO呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與內(nèi)源性熒光呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），熒光AGEs與壬醛呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表1 凍融循環(huán)及熱加工過程中魚糜制品脂肪氧化、蛋白質(zhì)降解、α-二羰基化合物及AGEs之間的相關(guān)性Table 1 Pearson’s correlation between lipid oxidation,protein degradation, α-dicarbonyl compounds and AGEs in surimi during freezethaw cycles and thermal processing

脂質(zhì)氧化產(chǎn)生多種氧化產(chǎn)物，其中的二羰基化合物可直接與氨基酸結(jié)合生成AGEs；蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致肌原纖維蛋白重鏈的展開、產(chǎn)生小分子肽和活性氨基基團(tuán)，賴氨酸可直接與二羰基化合物結(jié)合形成AGEs；蛋白的結(jié)構(gòu)的變化還可能暴露AGEs的一些特異性結(jié)合位點(diǎn)[35]。魚糜制品的原料在凍融循環(huán)過程中冰晶的重結(jié)晶會導(dǎo)致細(xì)胞破裂釋放脂質(zhì)氧化酶和血紅素鐵等催化劑，且冰晶消失產(chǎn)生的孔隙使原料和與氧氣接觸面積增大，促進(jìn)脂肪氧化[36]；此外，冰晶的重結(jié)晶導(dǎo)致魚肉蛋白纖維斷裂，在內(nèi)源酶和微生物的作用下，結(jié)合脂肪氧化進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)降解。因此，原料的凍融循環(huán)為魚糜制品中AGEs的形成提供二羰基化合物和活性氨基等前體物質(zhì)。在加工過程中，魚糜制品中少量的還原糖可以與蛋白質(zhì)的活性氨基通過美拉德反應(yīng)途徑[1]產(chǎn)生AGEs，產(chǎn)生的席夫堿和Amadori產(chǎn)物可以分別通過Namiki途徑[37]和Amadori重排[38]產(chǎn)生二羰基化合物；溫度的增加進(jìn)一步促進(jìn)了脂肪氧化和蛋白質(zhì)降解，可以通過Acetol途徑[39]產(chǎn)生AGEs，與此同時(shí)，原料凍融期間產(chǎn)生的AGEs前體物質(zhì)也通過加熱迅速反應(yīng)，通過多種途徑在魚糜制品中形成AGEs。

3 結(jié)論

魚糜制品經(jīng)過6 次凍融后，壬醛、1-辛烯-3-醇、內(nèi)源性熒光、賴氨酸、CML和熒光AGEs含量顯著增加（P＜0.05），GO、MGO含量顯著降低（P＜0.05），蛋白質(zhì)分子質(zhì)量無明顯變化；加熱后，1-辛烯-3-醇、GO、MGO、CML和熒光AGEs含量顯著增加（P＜0.05），色氨酸含量顯著降低（P＜0.05），賴氨酸含量先增加后降低，肌球蛋白重鏈逐漸降解。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示CML和熒光AGEs均與1-辛烯-3-醇、MGO呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與內(nèi)源性熒光呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與賴氨酸、GO呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），熒光AGEs與壬醛呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。因此，原料的凍融循環(huán)為魚糜制品中AGEs的形成提供大量前體物質(zhì)。在加工過程中，魚糜制品中的少量的還原糖也可通過美拉德反應(yīng)途徑產(chǎn)生AGEs，溫度的升高進(jìn)一步促進(jìn)了脂肪氧化和蛋白質(zhì)降解，與此同時(shí)，原料凍融期間產(chǎn)生的AGEs前體物質(zhì)也通過加熱迅速反應(yīng)，通過多種途徑在魚糜制品中形成AGEs，影響其食用安全性，本研究為優(yōu)化魚糜凍藏條件及魚糜制品加工方法以降低AGEs的產(chǎn)生提供理論依據(jù)。