陳艷霞， 柯 本， 涂衛(wèi)平， 陳 艷， 黃 翀， 朱淑英

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，江西 南昌 330006）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是威脅人類健康的主要疾病之一，其患病率超過10%［1］，其中礦物質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致的血管鈣化（vascular calcification， VC）是其特有且常見的并發(fā)癥或合并癥。CKD患者死亡的主要原因為心血管疾?。╟ardio vascular diseases， CVD），發(fā)生比例為 61.5%［2］，其死亡率增加的獨立危險因素為VC，同時VC被認為是最高的心血管危險因素［3］。據(jù)報道，CKD5期患者VC的發(fā)生率高達80%～90%［4］。許多因素參與了VC的發(fā)病機制［5］，CKD患者的高磷血癥已被證實是VC發(fā)病率和死亡率的獨立危險因素［6］。VC是一個被積極調(diào)節(jié)的病理生理過程［7］，且關(guān)鍵環(huán)節(jié)是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）向成骨細胞的轉(zhuǎn)化［8］。前期研究顯示高磷（high phosphorus，HP）能夠誘導(dǎo)VSMCs的鈣化，促使其向成骨細胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，表達骨分化的標志物如骨形態(tài)發(fā)生蛋白9、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2等，同時其收縮表型如α-平滑肌肌動蛋白的表達下調(diào)［9］。深入探討CKD患者VC的病理發(fā)生發(fā)展過程，對防治CKD患者的CVD，改善預(yù)后降低心血管風(fēng)險具有重要研究意義和臨床價值。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNA）HOTAIR可通過靶向miRNA-130b-3p抑制VSMCs的凋亡［10］，參與VC過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR可通過靶向miR-126上調(diào)Klotho從而抑制Wnt/β-catenin信號通路逆轉(zhuǎn)HP誘導(dǎo)的VSMCs鈣化［11］。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR的上游轉(zhuǎn)錄因子為 E2F、E2F-1、E2F-2、E2F-3a、E2F-4和叉頭框蛋白 O1a（forkhead box protein O1a， FOXO1a），且已有研究表明E2F可通過調(diào)控細胞凋亡、炎癥并介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用，下調(diào)VC相關(guān)的骨橋蛋白的表達［12-14］，提示E2F在VC發(fā)揮重要作用，但具體機制不清楚。本研究擬探討E2F調(diào)控lncRNA HOTAIR在HP誘導(dǎo)VSMCs鈣化中的作用及其機制，為VC防治尋找新的干預(yù)靶點和治療策略提供研究方向。

材料和方法

1 主要試劑與儀器

人VSMCs購自于Lonza；鈣沉積含量測定試劑盒購自于Biovision；細胞培養(yǎng)液中的胎牛血清購自Gibco；DMEM/F12 培養(yǎng)液購自 HyClone；Trizol試劑、qPCR用試劑盒、BCA試劑盒、Lipofectamine 2000、雙螢光素酶相關(guān)的試劑、抗體、引物等均購自Invitrogen。核酸蛋白測定儀、PCR擴增儀和凝膠圖像成像系統(tǒng)購自Bio-Rad；DYPC-31DN型電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品；酶標儀為Thermo產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 HP誘導(dǎo)VSMCs鈣化構(gòu)建細胞鈣化模型和實驗分組 以人主動脈VSMCs為研究對象，采用HP［10 mmol/L β-磷酸甘油酯（β-glycerol phosphate， β-GP）］誘導(dǎo)12 d后構(gòu)建細胞鈣化模型［9］。實驗分組如下：正常對照（control）組，正常VSMCs培養(yǎng)；HP組，正常VSMCs+10 mmol/L β-GP共培養(yǎng)；HP+空載（HP+Adlaz）組，正常VSMCs+10 mmol/L β-GP共培養(yǎng)+Adlaz；HP+過表達 E2F（HP+AdE2F）組，正常 VSMCs+10 mmol/L β-GP共培養(yǎng)+AdE2F。以上實驗處理中，轉(zhuǎn)染時間為48 h。

2.2 RT-qPCR Trizol法提取組織或細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Primer Premier5.0設(shè)計上游和下游引物，將所得cDNA加至PCR反應(yīng)體系中擴增目標片段。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 min；94 ℃變性30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40個循環(huán)，以GAPDH作為參考。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.3 Western blot 首先采用RIPA裂解液裂解細胞收集蛋白并進行蛋白濃度的測定，其次SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白電泳后濕轉(zhuǎn)于PVDF膜上，采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h，加入Ⅰ抗孵育過夜后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色。凝膠成像分析儀攝像并計算出檢測蛋白灰度值。

2.4 茜素紅S染色 PBS漂洗3次，10%中性甲醛固定，室溫環(huán)境下孵育10 min，雙蒸水漂洗3遍；加茜素紅S染色液滴染1～5 min；McGee-Russell分化液進行迅速分化數(shù)秒，Mayer蘇木素染色核淺染1～2 min后沖洗10 min；使用中性樹膠封固后于倒置顯微鏡下觀察，讀取562 nm處的吸光度（absorbance，A）進行定量。

2.5 鈣沉積含量測定 按說明書操作步驟準備標準曲線，準備好樣品按操作說明書進行具體操作，30 min內(nèi)讀取波長610 nm處的標準液及待測樣品的A值，根據(jù)標準曲線計算待測樣品中鈣含量。

2.6 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?采用生物信息學(xué)軟件進行預(yù)測E2F、lncRNA HOTAIR和Klotho的可結(jié)合區(qū)域，合成E2F、Klotho野生（wild-type， WT）和突變（numtant， MUT）報告質(zhì)粒，分別為E2F-WT-luc、E2F-MUT-luc、Klotho-WT-luc和 Klotho-MUT-luc。當VSMCs培養(yǎng)達到70%～80%融合時，通過Lipofectamine 2000將合成的報告質(zhì)粒與lncRNA HOTAIR模擬物（mimics）或lncRNA HOTAIR陰性對照（negative control， NC）共轉(zhuǎn)染48 h，根據(jù)制造商的方案，通過雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)評估每組螢光素酶相對活性，驗證E2F、lncRNA HOTAIR和Klotho的關(guān)系。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組獎比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 E2F、lncRNA HOTAIR和Klotho在HP誘導(dǎo)的VSMCs鈣化中的表達

采用HP誘導(dǎo)VSMCs鈣化構(gòu)建細胞鈣化模型，結(jié)果表明，HP組VSMCs出現(xiàn)鈣化，鈣沉積含量增加（圖1A）； RT-qPCR顯示E2F mRNA、lncRNA HOTAIR和Klotho mRNA在HP組VSMCs中表達下調(diào)（圖1B）；Western blot顯示E2F和Klotho蛋白在HP組VSMCs中表達下調(diào)（圖1C）。

Figure 1. Expression of E2F， lncRNA HOTAIR and Klotho in calcification of VSMCs induced by high phosphorus （HP）. A： calcium deposit content； B： the expression of E2F mRNA， lncRNA HOTAIR and Klotho mRNA detected by RT-qPCR； C：the expression of E2F and Klotho proteins detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group.圖1 E2F、lncRNA HOTAIR和Klotho在高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化中的表達

2 過表達E2F對HP誘導(dǎo)VSMCs鈣化的影響

茜素紅染色及鈣沉積測定結(jié)果顯示，過表達E2F后VSMCs鈣化程度減輕（圖2A、C）； RT-qPCR結(jié)果顯示，HP+AdE2F組VSMCs中l(wèi)ncRNA HOTAIR和Klotho mRNA表達上調(diào)（圖2B）；Western blot結(jié)果顯示，HP+AdE2F組VSMCs中E2F和Klotho蛋白表達上調(diào)（圖2D）。

Figure 2. Effect of E2F overexpression on high phosphorus （HP）-induced VSMCs. A： alizarin red S staining showed the formation of intracellular calcium nodules； B： the expression of E2F mRNA， lncRNA HOTAIR and Klotho mRNA detected by RT-qPCR； C： calcium deposit content； D： the protein levels of E2F and Klotho detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs HP+Adlaz group.圖2 過表達E2F對高磷誘導(dǎo)VSMCs的影響

3 E2F與lncRNA HOTAIR靶向關(guān)系驗證

生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR的上游轉(zhuǎn)錄因子為E2F，通過GSEA發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR高表達與KEGG通路中基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子通路（BASAL_TRANSCRIPTION_FACTORS）顯著正相關(guān)（NES=1.488，P=0.047），提示lncRNA HOTAIR上游可能受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。Jaspar生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子E2F與lncRNA HOTAIR啟動子存在5個結(jié)合位點。螢光素酶活性分析示lncRNA HOTAIR的低表達顯著降低E2F WT中的螢光素酶活性，E2F的表達水平與lncRNA HOTAIR有直接相關(guān)性，呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，見圖3。

4 Klotho是lncRNA HOTAIR的靶基因

生物學(xué)信息軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR的1 967～1 859位置與Klotho的976～1 117位置存在堿基互作配對，預(yù)測結(jié)合能為-30.3772 kcal/mol，提示lncRNA HOTAIR與Klotho具有可結(jié)合區(qū)域（圖4A）；螢光素酶活性分析示lncRNA HOTAIR的低表達顯著降低Klotho WT中的螢光素酶活性，Klotho的表達水平與lncRNA HOTAIR有直接相關(guān)性，呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)（圖4B）。

討 論

lncRNA為大于200個核苷酸的非編碼RNA，可直接調(diào)控基因的表達，也可通過“分子海綿”作用靶向多個 miRNA，間接調(diào)控基因的表達［15］。lncRNA HOTAIR的基因定位于12號染色體，為轉(zhuǎn)錄自HOXC位點的反義鏈［16］。在人主動脈瓣膜細胞中，lncRNA HOTAIR可被循環(huán)拉伸及受Wnt/β-catenin調(diào)節(jié)抑制細胞鈣化［17］。lncRNA HOTAIR抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，其作用機制與調(diào)控Wnt/β-catenin途徑有關(guān)［11］。lncRNA HOTAIR可通過靶向miRNA-130b-3p抑制VSMCs的凋亡［10］，參與VC鈣化的過程。同時我們發(fā)現(xiàn)在HP誘導(dǎo)VSMCs鈣化的細胞模型中，lncRNA HOTAIR可通過靶向miR-126上調(diào)Klotho抑制Wnt/β-catenin信號通路逆轉(zhuǎn)HP誘導(dǎo)的VSMCs鈣化［18］。由此可見，lncRNA HOTAIR參與CKD患者的VC過程。

Figure 4. Klotho was the target gene of lncRNA HOTAIR. A：binding regions between lncRNA HOTAIR and Klotho； B： low expression of lncRNA HOTAIR significantly reduced the luciferase activity in Klotho-WT. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs sh-NC group.圖4 Klotho是lncRNA HOTAIR的靶基因

轉(zhuǎn)錄因子E2F最初是由于發(fā)現(xiàn)其能激活腺病毒E2啟動子而被命名的，目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物存在著多種E2F蛋白，每種E2F蛋白由300～500個氨基酸組成，且在結(jié)構(gòu)上形成其特有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域，為其發(fā)揮復(fù)雜功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。E2F家族包括E2F1～8，通過介導(dǎo)特定下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞周期。E2F家族還具有調(diào)節(jié)自噬、線粒體功能和DNA損傷反應(yīng)的作用［19］。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR的上游轉(zhuǎn)錄因子為E2F、E2F-1、E2F-2、E2F-3a、E2F-4和FOXO1a，且已有研究表明E2F可通過調(diào)控細胞凋亡和炎癥并介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用，下調(diào)VC相關(guān)的骨橋蛋白的表達［12-14］，提示E2F在VC中發(fā)揮重要作用，但具體機制不清楚。我們研究發(fā)現(xiàn)HP誘導(dǎo)的VSMCs鈣化中，HP組E2F和lncRNA HOTAIR表達下調(diào)，E2F蛋白也表達下調(diào)，提示E2F參與HP誘導(dǎo)的VSMCs鈣化。過表達E2F，HP誘導(dǎo)的VSMCs鈣化減輕，lncRNA HOTAIR表達逆轉(zhuǎn)，提示E2F對HP誘導(dǎo)的VSMCs鈣化具有保護作用，同時本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR是E2F的靶基因，且具有正相關(guān)。因此，我們推測E2F通過調(diào)控lncRNA HOTAIR表達參與HP誘導(dǎo)VSMCs鈣化過程。

Klotho介導(dǎo)VC的調(diào)控機制復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，LRRC75A-AS1可通過抑制VSMCs成骨樣表型轉(zhuǎn)化改善 VC［20］。lncRNAH19 通過 MAPK 信號通路調(diào)控Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的表達誘導(dǎo)VSMCs成骨樣表型轉(zhuǎn)化促進VC［21］。lncRNAES3可介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的VSMCs鈣化［22］。雖對lncRNA的研究在不斷增加，但lncRNA調(diào)控VC的研究較少［23］。我們既往研究提示lncRNA-SNHG29可通過下調(diào)miR-200b-3p激活Klotho/FGF23軸抑制 HP 誘導(dǎo)的 VSMCs的鈣化［24］，Klotho可通過抑制Wnt7b/β-catenin信號通路逆轉(zhuǎn)HP誘導(dǎo)的VC過程［8］。本研究發(fā)現(xiàn)在HP誘導(dǎo)的VSMCs鈣化中，HP組E2F和Klotho mRNA表達下調(diào)，Klotho蛋白也表達下調(diào)。過表達E2F后，Klotho mRNA表達呈現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，結(jié)合本項目組既往研究結(jié)果，推測E2F通過調(diào)控lncRNA HOTAIR介導(dǎo)Klotho參與HP誘導(dǎo)VSMCs鈣化過程。

本實驗?zāi)壳熬窒拊诩毎降难芯浚瑒游锼郊芭R床水平E2F通過調(diào)控lncRNA HOTAIR介導(dǎo)Klotho參與HP誘導(dǎo)VSMCs鈣化過程需要進一步探討。本研究提示E2F通過調(diào)控lncRNA HOTAIR介導(dǎo)Klotho參與HP誘導(dǎo)VSMCs鈣化過程，為CKD患者VC的防治提供新的思路和依據(jù)。