劉曉琴， 郭敏芳， 谷青芳， 李艷花 ， 李紅霞， 魏文悅，張海飛 ， 尉杰忠 ，2，3△， 馬存根 ，2△

（1山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所/附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，山西 大同 037009；2山西中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西 晉中 030619；3山西省大同市第四人民醫(yī)院，山西 大同 037009）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）是一種發(fā)病隱匿、進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，它的特征性病理改變?yōu)榧?xì)胞外的β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein， Aβ）沉積和細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化τ蛋白（phosphorylated Tau protein， p-Tau）的聚集，同時伴有突觸和線粒體功能異常、大腦區(qū)域性的葡萄糖代謝降低，最終導(dǎo)致神經(jīng)元萎縮、變性及丟失［1］。在AD的發(fā)病過程中，神經(jīng)元突觸數(shù)目的減少是導(dǎo)致早期認(rèn)知功能障礙的主要因素。神經(jīng)元樹突棘作為神經(jīng)元突觸的一個重要結(jié)構(gòu)，其形態(tài)的改變必然導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變。臨床數(shù)據(jù)顯示，神經(jīng)元樹突棘丟失是AD患者大腦內(nèi)最先可以觀察到的結(jié)構(gòu)改變之一，且早于神經(jīng)元的丟失和纖維斑塊的沉積［2］。在AD模型鼠中，纖維斑塊的附近或遠(yuǎn)端也可觀察到樹突棘數(shù)量的減少，且這些樹突的形態(tài)異常，樹突內(nèi)p-Tau含量增加［3］。與正常小鼠的神經(jīng)元樹突棘相比，AD模型鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元樹突棘的頭部更寬大，頸部更短而粗［4］。進(jìn)一步的研究顯示，多聚化的Aβ的很多靶點(diǎn)都與神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞及突觸的功能相關(guān)，這些Aβ多聚體可以在細(xì)胞膜上形成離子可通過的孔道，從而增加Ca2+的流入，對神經(jīng)元造成毒性［5］。雖然Aβ產(chǎn)生的突觸毒性在AD的發(fā)展早期發(fā)揮作用，也可能是導(dǎo)致其它神經(jīng)毒性特征的關(guān)鍵驅(qū)動因素，但是其中的具體作用機(jī)制仍未得到闡明［6］。

Rho相關(guān)激酶（Rho-associated kinase， ROCK）是一類以GTP酶RhoA調(diào)控為主的多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過細(xì)胞表面受體接受各種信號激活后，在細(xì)胞骨架、細(xì)胞遷移和細(xì)胞生長等方面起主要調(diào)控作用。研究顯示ROCKs在AD、帕金森?。≒arkinson disease， PD）和多發(fā)性硬化（multiple sclerosis， MS）等多種神經(jīng)退行性疾病中會過量表達(dá)，使用Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾（fasudil）或Y-27632，能夠有效改善這些疾病的癥狀，并延緩病程的進(jìn)展［7-9］。但是，Rho激酶信號通路復(fù)雜，fasudil或Y27632對很多激酶存在廣泛的抑制作用，如AGC激酶家族中的蛋白激酶A（protein kinase A， PKA）和蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）等，從而限制了這些激酶抑制劑在臨床治療中的應(yīng)用［10］。ROCK有兩個異構(gòu)體：ROCK1和ROCK2，兩者氨基酸序列的相似性為65%，N端的激酶結(jié)構(gòu)域的一致性為92%［11］，但在組織分布和功能上并不完全相同。ROCK2在大腦的表達(dá)量更高，ROCK1主要表達(dá)在血細(xì)胞和胸腺中［12］；在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y或人胚胎腎細(xì)胞HEK293中，敲減ROCK2均能夠降低Aβ水平，敲減ROCK1蛋白反而增加Aβ的表達(dá)［11］。這些結(jié)果提示，在大腦的生命活動及AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中，ROCK2發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。

ROCK2通過調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架系統(tǒng)在細(xì)胞黏附和運(yùn)動、平滑肌收縮及神經(jīng)元突觸可塑性等方面發(fā)揮著重要作用。研究顯示，與野生型（wild-type，WT）小鼠相比，ROCK2敲除小鼠的海馬神經(jīng)元樹突棘密度沒有變化，但是樹突棘的長度增加。而雜合ROCK2缺陷（ROCK2+/-）小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的樹突棘數(shù)目較WT小鼠降低，長度增加，頭部變小，無論是ROCK2敲除小鼠還是ROCK2缺陷雜合小鼠，它們的興奮性突觸數(shù)量均相應(yīng)減少［13-14］。但是，在AD的動物模型或細(xì)胞模型中，ROCK2的表達(dá)顯著增加，興奮性突觸數(shù)量卻顯著降低，從而導(dǎo)致AD模型鼠的認(rèn)知功能下調(diào)［15］。那么，在AD模型鼠中敲減ROCK2，神經(jīng)元突觸的樹突棘形態(tài)怎么改變？興奮性突觸數(shù)量有什么變化？AD的典型病理特征是否改善？目前還未見相關(guān)報道。基于以上問題，本研究以APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)和Western blot等實(shí)驗(yàn)探究ROCK2在小鼠海馬齒狀回區(qū)（dentate gyrus， DG）樹突棘形態(tài)的調(diào)控作用，為今后AD的治療及藥物研發(fā)提供參考。

材料和方法

1 動物

雄性8月齡的SPF級C57BL/6小鼠8只和雄性8月齡的SPF級APP/PS1小鼠32只，體重均為（20±2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2018-004。動物飼養(yǎng)于山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所動物室，明暗交替周期為12 h，環(huán)境溫度為23～27 ℃，濕度為40%～60%，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)獲得山西大同大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

2 主要試劑

抗ROCK2抗體購自Abcam；抗Aβ抗體購自Millipore；抗Tau抗體來源于ABclonal公司；抗p-Tau（Ser404）抗體、抗GAPDH抗體和抗突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95， PSD95）抗體、辣根過氧化物酶連接的羊抗兔Ⅱ抗、羊抗鼠Ⅱ抗及Alexa Flour 488購自Cell Signaling Technology；突觸結(jié)合蛋白1（synaptotagmin 1， Syt1）抗體和囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 1（vesicular glutamate transporter 1， VGLUT1）抗體購自 Synaptic Systems；含 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）的封閉液購買于北京索萊寶科技有限公司；試劑RIPA裂解液購買于上海碧云天科技生物有限公司；腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus， AAV）和ROCK2敲減病毒由武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司提供。

3 主要方法

3.1 動物分組 8只C57BL/6小鼠為WT組；32只APP/PS1小鼠隨機(jī)分為3組，第1組為8只，給予生理鹽水治療，記為NS組；第2組為12只，在小鼠海馬區(qū)注射腺相關(guān)對照病毒（AAV-U6-BBSI-shRNA-CMV-mCherry-pA，AAV9），其中6只小鼠同時注射神經(jīng)元示蹤病毒（AAV-hSyn-EGFP-WPRE-pA），另外6只小鼠不注射，均記為shRNA組；第3組為12只，在小鼠海馬區(qū)注射ROCK2敲減病毒［AAV-U6-shRNA（ROCK2）-CMV-mCherry， AAV9］，其中6只小鼠同時注射神經(jīng)元示蹤病毒（AAV-hSyn-EGFP-WPRE-pA），另外6只小鼠不注射，均記為shROCK2組。

3.2 腦立體定位注射 參考小鼠病毒注射相關(guān)文獻(xiàn)，對小鼠進(jìn)行腦立體定位注射病毒［16-17］。采用腹腔注射0.3%的戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg），對每只APP/PS1小鼠進(jìn)行麻醉，待麻醉完全，剪去頭頂部毛發(fā)，通過調(diào)節(jié)前夾及小鼠耳桿的位置，輕柔地將小鼠固定到腦立體定位儀上，使其眶上腦部在同一個水平面。用碘伏清潔眶上腦部兩次，手術(shù)延眶上方約1.5 cm處做矢狀位切口，暴露前囟。將微量注射器固定到定位注射槽內(nèi)，吸入病毒。根據(jù)小鼠腦圖譜確定注射坐標(biāo)，以前囟為0點(diǎn)，注射位點(diǎn)為：X=±1.25 mm，Y=-2.18 mm，Z=1.62 mm，注射速度為0.2 μL/min，結(jié)束后停留2 min以促進(jìn)病毒吸收，后緩慢抬起注射器，縫合頭皮，碘伏消毒。最后，將小鼠放置于保溫環(huán)境中適應(yīng)。實(shí)驗(yàn)過程中也要時刻注意給小鼠保溫，以提高注射后小鼠的存活率。

3.3 水迷宮和Y迷宮實(shí)驗(yàn) 從腦立體定位注射后的第21天開始，對4組小鼠的行為學(xué)進(jìn)行測試。水迷宮和Y迷宮的檢測參考之前的實(shí)驗(yàn)［7，18］，簡單介紹如下：水迷宮測試的前5天為訓(xùn)練期，每天上午和下午均進(jìn)行1次訓(xùn)練，每只小鼠均從同一入水點(diǎn)入水，每次訓(xùn)練用時不超過60 s，若小鼠60 s內(nèi)無法自行找到平臺，則人為引導(dǎo)其到達(dá)平臺并停留60 s。第6天，撤去平臺，對小鼠的空間認(rèn)知及記憶能力進(jìn)行正式測試。Y迷宮訓(xùn)練階段，新異臂入口被阻擋，小鼠從起始臂開始，在起始臂和其他臂中進(jìn)行10 min的活動。1 h后開始正式測試，此時開放新異臂入口，小鼠依然從起始臂開始，在3個臂中進(jìn)行5 min的活動，測試小鼠的空間記憶及學(xué)習(xí)能力。水迷宮和Y迷宮中，小鼠測試的全過程利用SMART 3.0系統(tǒng)進(jìn)行記錄及分析。

3.4 樣本采集 腦立體定位注射后的第27天，處死小鼠。每只小鼠使用0.3%的戊巴比妥鈉溶液，按照50 mg/kg的量進(jìn)行腹腔注射麻醉，每組4只小鼠（shRNA和shROCK2組中，有和無神經(jīng)元示蹤的小鼠各取2只）用生理鹽水對心臟進(jìn)行灌注，當(dāng)肝臟變白時，冰上快速取腦組織，并分離出海馬區(qū)域，迅速加入400 μL預(yù)冷的RIPA裂解液，進(jìn)行超聲：功率30 W，總超聲時間20 s，冰上放置10 min后，15 000×g、4 ℃離心5 min，收集上清。分裝后凍-80 ℃，用于后續(xù)的Western blot檢測。每組中剩余的小鼠在生理鹽水灌注心臟后，換用4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注來固定組織，冰上快速取出腦組織，放入4%多聚甲醛中繼續(xù)固定24 h，之后進(jìn)行蔗糖梯度脫水和optimal cutting temperature compound （OCT）包埋。在液氮中制備組織塊，使用冰凍切片機(jī)對組織進(jìn)行冠狀切割。對于神經(jīng)元示蹤的小鼠，切片厚度為50 μm，用于后續(xù)的神經(jīng)元樹突棘形態(tài)觀察；對于無神經(jīng)元示蹤的小鼠，切片厚度均為10 μm，用于后續(xù)的免疫組化分析。

3.5 神經(jīng)元樹突棘形態(tài)觀察及分析 參考相關(guān)文獻(xiàn)對神經(jīng)元的樹突棘形態(tài)進(jìn)行分析［19-20］。選取shRNA和shROCK2組的有神經(jīng)元示蹤的50 μm厚度海馬區(qū)域切片，用含DAPI的封片液進(jìn)行封片，使用激光共聚焦顯微鏡FV1000（Olympus）的100倍油鏡進(jìn)行拍照：在1 024×1 024的模式下，掃描速度為12.5幅/s，放大倍數(shù)為1.2倍，z軸掃描厚度為每片1.2 μm。圖像使用Imairs軟件進(jìn)行3D重構(gòu)，神經(jīng)元上的樹突及樹突棘利用軟件中的Filament工具進(jìn)行手動繪制，在檢測樹突棘的模塊中，樹突棘最小的頭部直徑設(shè)置為1 μm，最大長度設(shè)置為10 μm，樹突棘直徑最大不超過5 μm。選擇并導(dǎo)出要統(tǒng)計的參數(shù)，包括神經(jīng)元樹突棘的密度、長度、直徑及樹突棘頸的長度和直徑。每組樣品中最少選擇3只小鼠的腦片進(jìn)行拍照統(tǒng)計。

3.6 免疫熒光染色 選取4組樣品中10 μm厚度海馬區(qū)域切片，用PBS溶液清洗3次，每次5 min，使用含有1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA）和0.3% Triton X-100的PBS室溫封閉樣品1 h，然后加入對應(yīng)Ⅰ抗，4 ℃下濕盒中過夜孵育。第2天，去除Ⅰ抗，PBS溶液清洗樣品3次，每次5 min，加入對應(yīng)的488熒光標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育2 h。去除Ⅱ抗，用PBS清洗3次，每次5 min，用含有DAPI的封片液進(jìn)行封片，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照。使用Image-Pro Plus軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

3.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 具體操作步驟按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行，簡單描述如下：從-80 ℃中取出上述提取的小鼠海馬組織的蛋白溶液，充分溶解后，加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液，加熱變性蛋白，15 000×g離心5 min后取上清液，進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育及曝光拍照。拍照及蛋白定量分析均使用Image Lab軟件。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，使用軟件GraphPad Prism進(jìn)行分析統(tǒng)計，兩組間的比較使用t檢驗(yàn)，P＜0.05時，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 APP/PS1小鼠海馬神經(jīng)元的ROCK2被有效敲減

利用激光共聚焦的10倍物鏡對一側(cè)海馬進(jìn)行拍攝，如圖1A所示，病毒對海馬神經(jīng)元的侵染效率可以達(dá)到80%以上。Western blot的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)：與shRNA相比，轉(zhuǎn)染shROCK2能夠顯著下調(diào)小鼠海馬組織中的 ROCK2蛋白水平（P＜0.05），見圖1B。

2 ROCK2敲減改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能

利用水迷宮和Y迷宮實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)首先觀察了ROCK2敲減對APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能的影響。圖2A為訓(xùn)練期間不同組小鼠的運(yùn)動軌跡代表圖，從圖中可以看出：WT小鼠游泳路徑短，目的性強(qiáng)，能夠在短時間內(nèi)到達(dá)平臺所在象限；NS組和shRNA組的APP/PS1小鼠游泳路徑隨機(jī)，目的性弱，活動范圍大；shROCK2組的APP/PS1小鼠活動范圍較NS組和shRNA組縮小，有一定的目的性，更傾向于在平臺所在的SW象限附近活動。圖2B～2D的結(jié)果顯示：與WT相比，NS組和shRNA組的小鼠逃避潛伏期、到達(dá)平臺的平均距離，和首次進(jìn)入SW （southwest）象限的時間顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），而shROCK2組小鼠對應(yīng)的指標(biāo)較shRNA組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.05）。從Y迷宮的運(yùn)動軌跡圖可以看出：NS組和shRNA組的APP/PS1小鼠在新異臂穿梭的次數(shù)較WT小鼠顯著減少，而shROCK2組小鼠與WT小鼠在新異臂穿梭的次數(shù)相當(dāng)（圖3A）。數(shù)據(jù)分析顯示：WT組小鼠在新異臂的時間占總時間的比例平均為34.4%，自發(fā)交替率平均為44.18%；NC組和shRNA組的APP/PS1小鼠的對應(yīng)數(shù)值均顯著下調(diào)：NS組分別為22.78%和28.86%（P＜0.05或P＜0.01），shRNA組分別為20.59%和31.01%（P＜0.05），而shROCK2小鼠能夠有效抑制其下調(diào)，分別為32.91%和41.98%（P＜0.05或P＜0.01），見圖3B、C。

Figure 1. AAV-shRNA-mediated knockdown of ROCK2 in the hippocampus of 8-month-old APP/PS1 mice. A： representative images of the hippocampus after stereotaxic injection of AAV-shRNA/shROCK2 andAAV-hSyn-EGFP in APP/PS1 mice. Neurons co-expressing AAV-shRNA/shROCK2-mCherry（red） and AAV-hSyn-EGFP （green） and DAPI-stained nucleus（blue） in the hippocampus of APP/PS1 mice. B： the expression of ROCK2 in the hippocampus of APP/PS1 mice with injection of AAV-shRNA and AAV-shROCK2， and quantitative analysis of ROCK2 level normalized to GAPDH level by Image Lab software. Mean±SEM. n=3. *P＜0.05 vs shRNA group.圖1 AAV-shRNA調(diào)節(jié)的ROCK2在APP/PS1小鼠大腦海馬區(qū)的敲減

3 ROCK2敲減降低了APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ和p-Tau水平

為了進(jìn)一步評估ROCK2敲減對APP/PS1小鼠認(rèn)知功能的影響，本實(shí)驗(yàn)對AD的典型病理改變Aβ和p-Tau（Ser404）表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。對Aβ進(jìn)行的免疫熒光檢測結(jié)果顯示：NS組和shRNA組的APP/PS1小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)的Aβ含量較WT小鼠顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），shROCK2組中的 Aβ 含量較shRNA組顯著減少（P＜0.05），見圖4。

圖5A、B的免疫熒光數(shù)據(jù)顯示：NS組和shRNA組小鼠海馬DG區(qū)的p-Tau（Ser404）水平顯著升高（P＜0.01），敲減ROCK2可以顯著下調(diào)p-Tau（Ser404）在APP/PS1小鼠DG區(qū)的表達(dá)（P＜0.01）。同時通過Western blot檢測小鼠海馬區(qū)Tau蛋白及p-Tau（Ser404）的表達(dá)，結(jié)果顯示：與WT小鼠相比，APP/PS1小鼠及敲減ROCK2的APP/PS1小鼠海馬區(qū)Tau蛋白總的表達(dá)水平無顯著差異，但NS組和shRNA組小鼠的p-Tau（Ser404）較WT小鼠顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），且p-Tau在總Tau蛋白的占比也顯著增加（P＜0.05），而在shROCK2組中，p-Tau的增加被顯著抑制（P＜0.01），p-Tau與Tau的比例顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖5C～F。

4 ROCK2敲減改變了APP/PS1小鼠海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)元的樹突棘形態(tài)

使用激光共聚焦對神經(jīng)元的樹突棘進(jìn)行觀察，用Imaris軟件對其數(shù)量和形態(tài)進(jìn)行分析。圖6A為Imaris軟件對所拍攝的神經(jīng)元重構(gòu)后的代表圖，圖6B為要分析的樹突棘的代表圖。結(jié)果顯示：與shRNA相比，敲減ROCK2后，樹突棘的密度有增加的趨勢，但統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異。樹突棘的平均長度顯著增加（P＜0.01），直徑平均長度無顯著差異，頸部平均長度顯著增加（P＜0.01），且頸部平均直徑顯著減?。≒＜0.05）。

5 ROCK2敲減增加了APP/PS1小鼠海馬區(qū)的興奮性突觸數(shù)目

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ROCK2敲減對樹突棘形態(tài)的改變是否會影響興奮性突觸的數(shù)目，通過Western blot對不同組小鼠海馬區(qū)的突觸相關(guān)蛋白含量進(jìn)行了檢測。與WT組小鼠相比，NS組和shRNA組小鼠海馬區(qū)中的Syt1、VGLUT1和PSD95的含量顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），shROCK2敲減可顯著抑制Syt1、VGLUT1和PSD95的下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見圖7。

Figure 2. Morris water maze test was performed to detect the spatial memory and learning of the indicated mice. A： representative swimming paths from all mice in 4 groups during the training days and the corresponding parameters； B： latency to the target； C： mean distance to the target； D： latency of the first entrance to SW during the probe trial. Mean±SEM. n=6. *P＜0.05， **P＜0.01 vs WT group； #P＜0.05 vs shRNA group.圖2 水迷宮檢測所示小鼠的空間記憶及學(xué)習(xí)能力

討 論

AD是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，在其發(fā)病過程中，伴隨著神經(jīng)元的丟失及神經(jīng)再生的功能障礙。大腦海馬區(qū)在學(xué)習(xí)、記憶和空間定位方面發(fā)揮著重要的作用，海馬的DG區(qū)是成年動物神經(jīng)再生的一個主要區(qū)域。之前的研究顯示Rho激酶的抑制劑能夠顯著改善AD動物模型的認(rèn)知功能，促進(jìn)神經(jīng)再生［7，21］。但是，Rho激酶抑制劑對很多激酶具有廣譜性，是否是主要通過ROCK2來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效果，目前的實(shí)驗(yàn)證據(jù)較少。本研究通過在APP/PS1小鼠海馬區(qū)特異性敲減ROCK2，觀察APP/PS1小鼠的行為學(xué)及DG區(qū)神經(jīng)元的樹突棘形態(tài)改變，探索內(nèi)在機(jī)制，從而明確ROCK2敲減在APP/PS1小鼠發(fā)病過程中對神經(jīng)元突觸可塑性的調(diào)控作用。

Figure 3. The Y-maze test was performed to detect the spatial learning and memory of the indicated mice. A： illustration of the Y-maze and the typical diagrams of all 4 groups； B： the percentage of time in the novel arm over all the arms； C： the alternation rate in indicated groups in the Y-maze. Mean±SEM. n=6. *P＜0.05， **P＜0.01 vs WT group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs shRNA group.圖3 Y迷宮檢測所示小鼠的空間探索和記憶能力

Figure 4. Knockdown of ROCK2 reduced Aβ aggregation in the cortex of 8-month-old APP/PS1 mice. The expression of Aβ （green）in the cortex of mice was detected by immunohistochemistry. Nuclei were stained with DAPI（blue）. Scale bar=100 μm.Quantitative analysis of the area （polygon） of Aβ deposits was shown. Mean±SEM. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs WT group； #P＜0.05 vs shRNA group.圖4 ROCK2敲減減少了8月齡APP/PS1小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Aβ的聚集

ROCK2在多種神經(jīng)變性疾病中被過度激活，參與免疫炎癥、線粒體自噬、神經(jīng)元凋亡及突觸結(jié)構(gòu)及功能等多個方面的調(diào)控，被認(rèn)為是異病同治的重要靶點(diǎn)之一［9］。但是，目前對ROCK2在神經(jīng)變性疾病中的具體作用機(jī)制知之甚少，限制了人們對其進(jìn)行相關(guān)的藥物設(shè)計及后期的臨床應(yīng)用。本研究的結(jié)果顯示：利用AAV在APP/PS1小鼠海馬區(qū)敲減ROCK2后，可以顯著改善APP/PS1的空間探索、記憶及學(xué)習(xí)能力，這與之前報道的使用慢病毒敲低APP/PS1小鼠海馬區(qū)ROCK2的結(jié)果一致［22］。Aβ和p-Tau是AD的主要病理特征，過度的Aβ表達(dá)會改變激酶的活性，引起Tau高度磷酸化，最終導(dǎo)致神經(jīng)纏結(jié)的產(chǎn)生［23］。之前的研究顯示，利用小分子藥物SR3677抑制ROCK2激酶后，能夠降低AD鼠腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生，其可能的機(jī)制為：抑制了β位點(diǎn)APP裂解酶1（β-site-APP cleaving enzyme 1， BACE1）的酶活性，從而降低了Aβ的產(chǎn)生；改變了BACE1的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)，促進(jìn)APP在溶酶體內(nèi)的降解；ROCK2蛋白對APP蛋白654位蘇氨酸（threonine， T）的磷酸化在APP的降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，下調(diào)ROCK2蛋白改變了T654的磷酸化狀態(tài)，降低了Aβ的產(chǎn)生［11］。本研究則通過AAV直接對ROCK2進(jìn)行敲減，進(jìn)一步證實(shí)了ROCK2蛋白的下調(diào)有利于減少APP/PS1小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)的Aβ沉積及DG區(qū)的p-Tau表達(dá)，從而有利于APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能的改善。

Figure 5. Knockdown of ROCK2 decreased the expression levels of p-Tau in the DG of 8-month-old APP/PS1 mice. A： expression of p-Tau （green） in the DG of hippocampus was detected by immunohistochemistry. Nuclei were stained with DAPI （blue）.Scale bar=100 μm. B： quantitative analysis of the area （polygon） of p-Tau deposits by Image-Pro Plus software. C： the p-Tau and Tau levels in the hippocampus of mice were detected by Western blot. D to F： the quantification of p-Tau （D） and Tau（E） levels normalized to GAPDH level and p-Tau level normalized to Tau level （F） by Image Lab software. Mean±SEM. n=3. *P＜0.05. **P＜0.01 vs WT group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs shRNA group.圖5 ROCK2敲減減少了8月齡APP/PS1小鼠大腦海馬區(qū)p-Tau的表達(dá)

Figure 6. Knockdown of ROCK2 altered the morphology of dendritic spines in DG neurons of 8-month-old APP/PS1 mice. A： representative dendrites of DG neurons of the mice in shRNA and shROCK2 groups（scale bar=5 μm）， and quantitative data showing spine density， spine length and spine diameter in the DG of 8-month-old APP/PS1 mice； B： representative dendritic spine of the mice in shRNA and shROCK2 groups ［the analyzed spines （yellow） are located on the neurons infected by AAV-shRNA/shROCK2-mCherry（red） and AAV-hSyn-EGFP（green）； scale bar=1 μm］， and quantitative data showing an increase in spine neck length and a decrease in spine neck diameter in shROCK2 mice compared with shRNA mice.Mean±SEM. n=3. *P＜0.05. **P＜0.01 vs shRNA group.圖6 ROCK2敲減改變了8月齡APP/PS1小鼠DG區(qū)神經(jīng)元樹突棘的形態(tài)

神經(jīng)元樹突棘是大腦中大多數(shù)興奮性突觸的突觸后部分，在突觸的信號傳遞和可塑性方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，其形態(tài)和數(shù)目在不同的生理和病理?xiàng)l件下會發(fā)生動態(tài)的變化，而且神經(jīng)元樹突棘和突觸的結(jié)構(gòu)和功能可塑性對大腦的學(xué)習(xí)和記憶能力非常重要［24］。樹突棘頸部的直徑和長度是樹突棘區(qū)室化形成的關(guān)鍵因素：長而細(xì)的樹突棘頸部比短而粗的樹突棘頸部阻力更大，會限制一些突觸信號的擴(kuò)散，如鈣離子。作為樹突棘信號傳遞過程中的一個重要條件因子，鈣離子在樹突棘中的滯留會導(dǎo)致其濃度增加，從而更有利于下游信號的傳導(dǎo)，使突觸的可塑性更強(qiáng)［24-25］。而且，神經(jīng)元樹突棘的頭部越大，它對信號傳遞的能力越強(qiáng)［26］。目前，對于ROCK2敲減對神經(jīng)元樹突棘形態(tài)的改變，研究結(jié)果并不完全一致。研究顯示，與野生型相比，ROCK2+/-的雜合子小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度顯著降低，長度增加，頭部變窄［14］；ROCK2-/-的純合子小鼠海馬神經(jīng)元樹突棘密度不變，長度增加［13］；大鼠海馬神經(jīng)元中敲減ROCK2后，神經(jīng)元樹突棘的頭部變寬［27］。這些結(jié)果的差異可能是由于不同的動物背景，不同基因突變以及不同的實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)致的［14］，因此亟待更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)對其進(jìn)行論證。在AD發(fā)病過程中，ROCK2被異常激活［9］，那么在AD模型鼠的背景下，敲減ROCK2對神經(jīng)元樹突棘形態(tài)的影響是怎樣的呢？本研究利用共表達(dá)mCherry及神經(jīng)元示蹤的方法，在APP/PS1小鼠海馬區(qū)下調(diào)ROCK2激酶，檢測到敲減ROCK2使APP/PS1小鼠DG區(qū)神經(jīng)元樹突棘的密度雖然有增加的趨勢，但并無統(tǒng)計學(xué)差異。神經(jīng)元樹突棘的總長度及頸的長度顯著增加，頸的直徑顯著減?。煌瑫r，由于總的神經(jīng)元樹突棘的直徑變化無差異性，推測樹突棘的頭部直徑有增大的趨勢。這些結(jié)果提示ROCK2敲減更有利于APP/PS1小鼠大腦DG區(qū)突觸信號的傳遞，促進(jìn)突觸強(qiáng)度的增加。目前認(rèn)為ROCK2激酶對神經(jīng)元樹突棘形態(tài)的調(diào)控與其下游的cofilin的磷酸化有關(guān)，ROCK2對cofilin的第3位絲氨酸進(jìn)行磷酸化，可以調(diào)節(jié)肌動蛋白的重構(gòu)，有利于神經(jīng)元樹突棘的成熟，但是抑制ROCK2同樣能夠促進(jìn)樹突棘的形成及其頭部變寬［27］。Cofilin的磷酸化在AD鼠模型和AD病人的腦組織中含量均顯著增加。在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中，Aβ多聚體也能夠誘導(dǎo)cofilin發(fā)生磷酸化，利用Fasudil抑制ROCK2能夠降低cofilin的磷酸化，同時減輕Aβ多聚體引起的突觸毒性，如抑制了興奮性突觸的減少［28］。本研究進(jìn)一步對興奮性突觸相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測。PSD是調(diào)節(jié)樹突棘形態(tài)的關(guān)鍵組成部分，其中，PSD95就是興奮性突觸中主要的PSD支架蛋白之一，也是突觸后的主要標(biāo)志物［25，29］；Syt1在突觸前神經(jīng)末梢神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［30］。谷氨酸鹽是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)是由突觸囊泡膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白維持的，其中，VGLUT1是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中含量最高的一個蛋白［31］。本研究的數(shù)據(jù)顯示：NS和shRNA組中APP/PS1小鼠海馬區(qū)中的Syt1、PSD95和VGLUT1表達(dá)量較WT顯著下調(diào)；但是，在APP/PS1小鼠海馬區(qū)下調(diào)ROCK2表達(dá)后，Syt1、PSD95和VGLUT1表達(dá)量顯著增加，說明ROCK2敲減能夠增加APP/PS1小鼠海馬區(qū)興奮性突觸的數(shù)量，促進(jìn)突觸信號的傳遞。綜上結(jié)果表明，ROCK2敲減改變了APP/PS1小鼠DG區(qū)樹突棘形態(tài)，進(jìn)而增加了興奮性突觸的數(shù)量，減輕了Aβ和p-Tau對小鼠的毒性作用，從而有利于改善APP/PS1小鼠認(rèn)知功能。

Figure 7. Knockdown of ROCK2 increased the number of excitatory synapses in the hippocampus of 8-month-old APP/PS1 mice. A：the levels of SYT1 and VGLUT1 in the hippocampus from mice of the 4 groups were detected by Western blot； B： the level of PSD95 in the hippocampus from mice of the 4 groups was detected by Western blot. The quantitative analysis of SYT1，VGLUT1 and PSD95 levels normalized to GAPDH level was performed by Image Lab software. Mean±SEM. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs WT group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs shRNA group.圖7 ROCK2敲減增加了8月齡APP/PS1小鼠海馬區(qū)興奮性突觸的數(shù)量

本研究通過AAV特異性的對AD模型鼠APP/PS1小鼠海馬區(qū)的ROCK2進(jìn)行敲減，探索了ROCK2敲減對APP/PS1小鼠的治療作用及其相關(guān)的分子機(jī)制。ROCK2敲減能夠顯著提高APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)、記憶及空間探索能力，降低大腦內(nèi)累計的Aβ斑塊及p-Tau表達(dá)水平，并能夠改變DG區(qū)神經(jīng)元樹突棘的形態(tài)，顯著增加海馬區(qū)興奮性突觸的數(shù)量。本研究明確了ROCK2敲減對APP/PS1模型鼠認(rèn)知功能、基本病理改變及DG區(qū)樹突棘形態(tài)的調(diào)控作用，肯定了ROCK2在AD病理過程中對樹突棘形態(tài)調(diào)控的重要性，為深入揭示其中的分子機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。