汪 杰，張偉蒙，胡 晶

（北京工商大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，北京 100048）

0 前言

PLA材料由于生物降解性能良好，且抗壓強(qiáng)度（2～39 MPa）與天然骨（2～12 MPa）相似［1］，是骨支架制備中的一種常用選擇［2］。PLA雖然具有優(yōu)良的力學(xué)性能，但在骨組織工程支架應(yīng)用過(guò)程中也存在著諸如韌性、親水性、生物相容性差等缺點(diǎn)影響了骨支架的性能，這也成為目前PLA骨支架的研究熱點(diǎn)問(wèn)題。MONDAL等［3］采用3D打印技術(shù)制備了PLA支架，并對(duì)支架表面進(jìn)行羥基磷灰石（HA）修飾，細(xì)胞相容性及力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果表明，納米HA修飾后的PLA支架具有優(yōu)異的細(xì)胞黏附性能。Bouyer等［4］采用FDM技術(shù)制備PLA支架，該支架涂有一層提供成骨生物活性分子（BMP?2）的聚電解質(zhì)膜，通過(guò)比較計(jì)算機(jī)斷層掃描、微計(jì)算機(jī)斷層掃描與自體骨移植的結(jié)果，骨在支架內(nèi)均勻形成，骨修復(fù)效果與自體骨相同。Kao等［5］制備了聚多巴胺（PDA）涂層的PLA 3D支架，來(lái)調(diào)節(jié)人脂肪源性干細(xì)胞（hADSCs）的細(xì)胞黏附、增殖和分化，與未修飾的PLA支架相比，經(jīng)PDA涂層的PLA支架上hADSCs能夠更好地黏附和生長(zhǎng)，細(xì)胞分泌的I型膠原蛋白增加。Wang等［6］采用3D打印技術(shù)和順序浸漬法制備了PDA?PLA包覆硅酸鈣（PDA?PLA?CS）支架。所制備的PDA?PLA?CS支架具有良好的親水性。與無(wú)涂層支架相比，PDA?PLA?CS支架的力學(xué)性能顯著提高。此外，PDA? PLA? CS支架表面的PDA的存在對(duì)細(xì)胞的擴(kuò)散起到了積極的作用，但涂覆支架的界面相容性仍需要改善。

PLGA具有良好的生物相容性和可調(diào)節(jié)的生物降解性，且已獲美國(guó)食品和藥物管理局 （FDA） 批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用［7］。PLGA的3D支架能夠?yàn)榧‰旒?xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)提供良好的生長(zhǎng)空間，促進(jìn)肌腱細(xì)胞的生長(zhǎng)或再生，減少肌腱黏連，促進(jìn)肌腱愈合［8］。PLGA在力學(xué)性能上的單軸拉伸性能、壓縮性能、三點(diǎn)彎曲性能測(cè)試等方面上比PLA更能體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)［9］。

本研究采用3D打印技術(shù)制備PLA支架，使用浸涂法在支架表面修飾了PLGA涂層。研究了包覆溶液濃度對(duì)PLA/PLGA復(fù)合支架的斷面微觀形貌、力學(xué)性能、親水性和表面細(xì)胞活性性能等方面的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料

PLA線材，直徑為1.75 mm，深圳光華偉業(yè)股份有限公司；

PLGA，摩爾比為1∶9，中科院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所；

六氟異丙醇，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

胰酶，143188，蘭杰柯科技有限公司；

磷酸鹽緩沖液（PBS），WH0112201911XP，武漢普諾賽生命科技有限公司 ；

αMEM培養(yǎng)基，C12571500BT，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；

胎牛血清，04?007?1A，廣州一科生物科技有限公司；

小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，MC3T3?E1，賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；

活細(xì)胞染色試劑盒，BB?4126，上海貝博生物科技有限公司。

1.2 主要設(shè)備及儀器

3D打印機(jī)，RAISE3D N2，上海復(fù)志信息技術(shù)有限公司；

萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)，XJF?5，承德市金建檢測(cè)儀器有限公司；

磁力攪拌器，ZNCL?TS500，上海興創(chuàng)儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡（SEM），Quanta FEG 250，上海鑄金分析儀器有限公司；

視頻光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x，OCA35，北京奧德利諾儀器有限公司；

CO2恒溫培養(yǎng)箱，WIGGENSWCI?180，北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所；

超凈工作臺(tái)，SW?CJ?2FD，上海篤特科學(xué)儀器有限公司；

離心機(jī)，TD5，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；酶標(biāo)儀，SPARK 10M，帝肯貿(mào)易有限公司；激光共聚焦顯微鏡，F(xiàn)V1200，奧林巴斯有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒?8（CCK?8），IV08?100，上海創(chuàng)凌生物科技有限公司。

1.3 樣品制備

使用Solid Works（3D）繪制3D支架模型，采用Idea Maker軟件對(duì)3D模型進(jìn)行切片，打印速度為50 mm/s，噴頭溫度為 215 ℃，熱床溫度為 60 ℃，支架填充率為100 %，支架體積為12 mm×12 mm×8 mm。稱取不同質(zhì)量的PLGA放入六氟異丙醇（CH3COOC2H5）溶劑中，用磁力攪拌器在30 r/min轉(zhuǎn)速下、50 ℃下攪拌120 min，待PLGA完全溶解，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2 %、4 %、6 %、8 %的PLGA溶液。PLGA溶液在PLA支架上均勻地淋灑2次，將支架放入真空干燥箱中，50 ℃下干燥48h得到不同濃度PLGA包覆的支架。

1.4 性能測(cè)試與結(jié)構(gòu)表征

壓縮性能測(cè)試：按照GB/T 1041—2008進(jìn)行測(cè)試，加載速度為 1 mm/min，定量壓縮4 mm，每種濃度包覆支架選取 5個(gè)樣品，樣品壓縮方向?yàn)?D打印模型的Z軸方向；

SEM測(cè)試：各支架通過(guò)液氮脆斷獲得橫截面，將樣品的斷面置于15 kV的工作電壓下進(jìn)行噴金處理，測(cè)試脆斷斷面的表面形貌，加速電壓為10 kV，放大倍率為50倍和1 000倍；

表面水接觸角測(cè)試：采用表面接觸測(cè)定儀測(cè)量樣品的靜態(tài)水接觸角，將檢測(cè)支架樣本放在試樣臺(tái)上，將1 μL蒸餾水滴落在待測(cè)支架樣本上，每個(gè)樣本選取5個(gè)測(cè)試點(diǎn)位，測(cè)3個(gè)樣品，取平均值作為測(cè)定結(jié)果；

2 結(jié)果與討論

2.1 表面形貌分析

組織工程支架的孔結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的黏附、遷移和增殖有重要的影響，尤其孔徑大小和分布在很大程度上決定了細(xì)胞在支架材料中遷移和生長(zhǎng)的活性［10］。圖1（a）、（c）、（e）、（g）分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %、4 %、6 %、8 %PGLA溶液包覆后支架的斷面形貌，圖1（b）、（d）、（f）、（h）是相應(yīng)的局部放大1 000倍的形貌?？梢郧逦赜^察到支架內(nèi)部通孔在包覆后連通性良好，支架孔徑可在1 200 μm左右，由于宿主細(xì)胞從骨髓遷移和鄰近成骨細(xì)胞遷移，需要一個(gè)相互連接的通道結(jié)構(gòu)以允許組織在其上生長(zhǎng)［11］。較大的孔徑支架具有良好的血管化，涂覆均勻且不會(huì)阻塞孔隙［12］。這為細(xì)胞在支架材料中遷移、生長(zhǎng)以及動(dòng)物體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的可行性提供保障。包覆溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的PLA支架如圖1（a）所示，支架已經(jīng)被包覆，因?yàn)槿芤簼舛鹊?、黏度較低，包覆溶液在支架表面明顯分層，黏附力較差；包覆溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的PLA支架如圖1（c）所示，有局部分層；包覆溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 %的PLA支架，如圖1（e）所示，可觀察到支架和涂層黏結(jié)較緊，未見(jiàn)明顯邊界；包覆溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 %的PLA支架，如圖1（g）所示，沒(méi)有分層。圖1（b）和（d）中涂層與支架表面存在明顯的間距；圖1（f）中隨著溶液濃度的升高，黏度變大，包覆溶液與支架表面無(wú)開裂現(xiàn)象，縫隙間距減??；圖1（h）中因黏度適中包覆溶液與支架表面未有明顯兩相，PLA與PLGA相容性較好，其相界面結(jié)合緊密，支架的整體性最佳。

圖1 PLGA溶液包覆PLA支架的SEM照片F(xiàn)ig.1 Surface section morphology of PLA scaffold coated with PLGA solution

圖2 （a）、（c）、（e）、（g）分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %、4 %、6 %、8 %PGLA溶液包覆后支架壓縮后的斷面形貌，圖2（b）、（d）、（f）、（h）是其相應(yīng)放大的1 000倍的局部圖。包覆溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %、4 %的PLA支架壓縮后，如圖2（b）、（d）所示，涂層與支架有明顯的剝離現(xiàn)象，在應(yīng)力集中的地方出現(xiàn)了一些細(xì)小的裂紋；包覆溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 %、8 %的PLA支架壓縮后，如圖2（e）所示，涂層與支架表面未發(fā)生剝離現(xiàn)象，包覆溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 %的PLA支架壓縮后，如圖2（g）所示，由于支架力學(xué)性能的降低，支架產(chǎn)生較大裂紋。綜上所述，包覆溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 %的PLA支架，包覆效果最好。

2.2 力學(xué)性能分析

相界面結(jié)合在復(fù)合材料中具有相當(dāng)重要的意義，其對(duì)材料性能有直接的影響，若界面結(jié)合不好，復(fù)合材料很容易形成局部松弛而導(dǎo)致應(yīng)力集中和材料的強(qiáng)度性能降低［13］。實(shí)驗(yàn)制備了PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、2 %、4 %、6 %、8 %的PLA/PLGA復(fù)合支架進(jìn)行壓縮試驗(yàn)，壓縮強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果如圖3所示，包覆了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的PLGA的PLA支架與未包覆PLGA的PLA支架相比，支架的壓縮強(qiáng)度從29.2 MPa下降至22.9 MPa。當(dāng)包覆溶液濃度為4 %時(shí)，溶液黏度提高，支架表面PLGA涂層包覆更加均勻，試樣壓縮強(qiáng)度較2 %溶液包覆略有上升；當(dāng)包覆溶液濃度增加至6 %和8 %時(shí)，溶液黏稠，表面包覆均勻，但溶劑揮發(fā)更加困難，8 %溶液壓縮強(qiáng)度最低為21.6 MPa，但仍高于人體松質(zhì)骨最高承載要求12 MPa。PLA支架包覆不同濃度的PLGA溶液后其壓縮強(qiáng)度都有所下降，這是由于在制備支架過(guò)程中無(wú)法完全除去有機(jī)溶劑［14］，造成PLGA涂層力學(xué)性能下降，且PLGA和PLA的界面表現(xiàn)出大尺寸的宏觀分離，界面黏結(jié)松散，導(dǎo)致PLA/PLGA復(fù)合支架壓縮強(qiáng)度有所降低。

圖3 不同濃度PLGA溶液包覆PLA支架的壓縮強(qiáng)度Fig.3 Compression strength of the PLA scaffold coated with different concentrations of PLGA solution

2.3 表面親水性分析

親水性是反應(yīng)物質(zhì)表面性質(zhì)的重要性能，研究固體材料親疏水性時(shí)，接觸角測(cè)試法是一種常見(jiàn)的表征方法［15］。

支架表面的親水性是影響材料與細(xì)胞支架最初相互作用行為的關(guān)鍵因素之一，研究表面支架表面的親水性是細(xì)胞依附和蛋白質(zhì)通過(guò)的重要屬性［16］。接觸角廣泛用于評(píng)估支架的表面親水性，對(duì)PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、2 %、4 %、6 %、8 %5組支架分別進(jìn)行接觸角測(cè)試，結(jié)果如圖4所示。由圖可知，PLGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %、4 %、6 %、8 %的復(fù)合支架接觸角均低于70 °，相對(duì)于PLA支架接觸角降低。隨著包覆溶液濃度的升高，接觸角有下降的趨勢(shì)，其中，包覆質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6 %PLGA的支架接觸角為（64.7±1.1） °，包覆溶液濃度為8 %時(shí)，由于溶液較黏稠影響了表面包覆質(zhì)量，接觸角有所升高。PLA由單體乳酸聚合而成，其分子骨架中富含疏水性的酯鍵，缺乏親水性基團(tuán)，因而PLA的疏水性較強(qiáng)［17］。說(shuō)明表面包覆處理提高了支架材料表面的親水性能。原因之一可能是包覆處理對(duì)支架表面形貌的改變；從圖1中發(fā)現(xiàn)，表面包覆后的支架表面變得粗糙不平，引起的比表面積增大，表面能增大，表面吸附能力增大，從而表現(xiàn)出對(duì)水分子更強(qiáng)的吸附能力［18］。其次，表面包覆賦予了表面有更多的親水性官能團(tuán)—OH的改善。因此復(fù)合材料的親水性得到提高，材料具有更好的親水性，有利于細(xì)胞的黏附。

圖4 不同濃度PLGA溶液包覆PLA支架的水接觸角Fig.4 Water contact angles of the PLA scaffold coated with different concentrations of PLGA solution

2.4 支架表面的細(xì)胞活性及黏附

圖5 支架表面的細(xì)胞活性及細(xì)胞Live染色Fig.5 Cell activity and adhesion on the scaffold surface

3 結(jié)論

（1）相比未包覆的PLA支架，PLGA涂層質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 6 %的支架接觸角由（81.1±0.4） °降至（64.7±1.1） °，親水性有明顯提升，有利于成骨細(xì)胞的增殖、依附和蛋白質(zhì)的交換；

（2）包覆不同濃度PLGA的支架整體壓縮強(qiáng)度減小，但壓縮強(qiáng)度均大于人體松質(zhì)骨最高承載要求12 MPa；

（3）PLA/PLGA復(fù)合支架表面涂層促進(jìn)了支架表面的細(xì)胞增殖，且6 %濃度的PLGA涂層細(xì)胞活性最高。