許 瀅，馮 濤，王化田，宋詩(shī)清，姚凌云，孫 敏，柳 倩，于 闖

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香精香料化妝品學(xué)院，上海 201400）

佛手柑（Citrus medicaL.var.sarcodactylis Swingle）又稱(chēng)佛手、佛手香櫞、蜜筩柑、蜜羅柑、福壽柑、五指柑等，是柑橘屬香櫞種植物[1]，主要種植在我國(guó)的浙江、江西、福建、廣東、廣西、四川、云南等地。佛手柑果實(shí)形狀呈卵形或長(zhǎng)圓形，果實(shí)前端分裂如拳狀，或張開(kāi)似指尖[2]。佛手柑具有一定的藥理價(jià)值，對(duì)腸道、脾胃和心血管疾病等有一定的治療作用，兼具一定的抗炎、抗病毒作用[3-7]。

佛手柑因其特殊的香氣和藥理作用被廣泛研究。Song 等[8]通過(guò)頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microe-xtraction，SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對(duì)金華佛手柑果肉和果皮的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)最小偏二乘法進(jìn)行分析，確定金華佛手的主要香氣物質(zhì)是檸檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、辛酸乙酯、芳樟醇、檸檬醛、葉醇和香茅醇等。目前對(duì)于佛手柑的研究主要涉及對(duì)單一產(chǎn)地或品種佛手柑香氣成分的分析與鑒定，及其抗菌等藥理特性研究[3,9-10]，而對(duì)佛手柑不同產(chǎn)地不同品種不同香氣質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究鮮有報(bào)道。因此，研究不同產(chǎn)地佛手柑的特征香氣，對(duì)今后佛手柑的育種栽植和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有一定的理論支持。

目前，物質(zhì)香氣提取的方法有很多，常見(jiàn)的有液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）[11]、溶劑輔助蒸發(fā)萃?。╯olvent-assisted flavor evaporation，SAFE）[12]、頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）[13]等。其中LLE 可以較全面地提取香氣成分，但存在樣品用量大、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)；SAFE 是一種在真空低溫條件下的提取方法，能對(duì)低揮發(fā)性成分進(jìn)行高效提取，可以真實(shí)反映原有的風(fēng)味組分，但是存在操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。而HS-SPME 技術(shù)是佛手柑香氣物質(zhì)提取的常用技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便快捷、香氣成分損失較少、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[13-15]，再通過(guò)相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）公式，可以快速篩選檢測(cè)物質(zhì)的關(guān)鍵揮發(fā)性成分。郝旭東等[16]采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME-GC-MS）、ROAV 分析確定大紅袍花椒的主體風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果表明烴類(lèi)、醇類(lèi)和酯類(lèi)對(duì)四種花椒主體香氣貢獻(xiàn)最大，芳樟醇、3-蒈烯、乙酸香葉酯、月桂烯對(duì)大紅袍花椒整體香氣貢獻(xiàn)度最大。因此，本研究采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)對(duì)佛手柑的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析，同時(shí)結(jié)合ROAV 分析方法確定佛手柑的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。

本試驗(yàn)首先通過(guò)HS-SPME-GC-MS 檢測(cè)鑒定佛手柑的揮發(fā)性物質(zhì)成分，隨后查閱相關(guān)物質(zhì)的閾值和香氣特征，通過(guò)ROAV 計(jì)算，快速篩選出佛手柑中的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)，通過(guò)主成分分析討論不同地區(qū)佛手柑揮發(fā)性物質(zhì)的香氣特征，為不同產(chǎn)地佛手柑篩選提供理論依據(jù)，同時(shí)為各地佛手柑產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料全部由金華農(nóng)業(yè)科學(xué)院finger citron 研究所提供，是在成熟期采摘的新鮮佛手柑。試驗(yàn)的佛手柑品種有三種，分別是浙江金華佛手柑（金佛手，JFC）、廣東佛手柑（廣佛手，GFC）、云南佛手柑（滇佛手，DFC）。

C8～C30系列烷烴，分析純，美國(guó)Sigma Aldrich 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7000D 三重四級(jí)桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國(guó)色譜科公司；30/50 CAR/DVB/PDMS 萃取頭，美國(guó)色譜科公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HS-SPME

為保證萃取頭的可靠性，先將萃取頭在250 ℃下老化30 min。將新鮮的佛手柑切碎，每個(gè)品種稱(chēng)取一定量樣品于20mL頂空瓶中，約占瓶身1/3 處，隨后密封置于60℃恒溫水浴鍋中，用萃取頭吸附30 min。最后將萃取頭插入GC-MS 進(jìn)樣口解析5 min。

1.3.2 GC-MS

采用HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速保持在1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲5 min。升溫過(guò)程：初始溫度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min 升溫至100 ℃，最后以5℃/min 升溫至230℃，保持20min。

質(zhì)譜條件：采用電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，采用全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍20～3 350m/z。

1.4 香氣成分的定性和定量分析

1.4.1 定性分析

原始數(shù)據(jù)在Nist11 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行匹配定性，選擇匹配度大于90%的揮發(fā)性物質(zhì)[17]。計(jì)算化合物的保留指數(shù)值，與查詢(xún)的保留指數(shù)記錄進(jìn)行對(duì)比定性。保留指數(shù)計(jì)算如公式（1）所示。

式中，ta為色譜峰a的保留時(shí)間；tn、tn＋1為正構(gòu)烷烴Cn和Cn＋1的保留時(shí)間。

1.4.2 定量分析

根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算佛手柑中各揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量[18]。計(jì)算公式見(jiàn)式（2）。

式中，M為單個(gè)組分香氣物質(zhì)的峰面積；N為總體峰面積。

1.5 ROAV 法確定佛手柑主體風(fēng)味物質(zhì)

參照ROAV 法對(duì)佛手柑中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的貢獻(xiàn)大小進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)而確定主體風(fēng)味物質(zhì)[19]。定義對(duì)佛手柑樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分：ROAVmax＝100，其他的組分a。計(jì)算公式見(jiàn)式（3）。

式中，Ca為揮發(fā)性組分的相對(duì)含量，%；Ta為揮發(fā)性組分的感覺(jué)閾值，μg/kg；Cmax為對(duì)樣品總體香氣貢獻(xiàn)度最大揮發(fā)性組分的相對(duì)含量，%；Tmax為對(duì)樣品總體香氣貢獻(xiàn)度最大揮發(fā)性組分的風(fēng)味閾值，μg/kg。

1.6 數(shù)據(jù)分析

氣相色譜分析采用Nist11 數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用TBtools 進(jìn)行熱圖繪制，采用Origin 2022 繪制PCA 圖和雷達(dá)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 佛手柑揮發(fā)性成分分析

采用HS-SPME 提取佛手柑的揮發(fā)性物質(zhì)，并用GC-MS 分析，結(jié)果表明3 個(gè)地區(qū)的佛手柑品種共檢出77 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表1，將這些數(shù)據(jù)篩選處理，繪制成分含量熱圖（圖1），以便直觀(guān)地進(jìn)行比較分析。

圖1 佛手柑揮發(fā)性物質(zhì)含量熱圖Fig.1 Heat map of volatile substance content of finger citron

由表1 可知，烴類(lèi)物質(zhì)在佛手柑中含量占比較大，共檢測(cè)出49 種烴類(lèi)物質(zhì)，其次是醛類(lèi)和醇類(lèi)，分別檢測(cè)出10 種和8 種。這與Wang 等[20]對(duì)佛手柑的檢測(cè)基本一致。金佛手中檢測(cè)出48 種揮發(fā)性物質(zhì)，d-檸檬烯的含量最高（35.55%）；廣佛手中檢測(cè)出31 種揮發(fā)性物質(zhì)，d-檸檬烯（11.06%）和雙戊烯（11.59%）含量最高；滇佛手中檢測(cè)出47 種揮發(fā)性物質(zhì)，d-檸檬烯（23.84%）和雙戊烯（24.87%）含量最高。廣佛手的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)顯著少于另外兩種佛手柑。

表1 佛手柑揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Table 1 Relative content of volatile substances in finger citron

續(xù)表

續(xù)表

14 種揮發(fā)性物質(zhì)在三個(gè)產(chǎn)地的佛手柑中均被檢測(cè)出，分別是α-蒎烯、β-蒎烯、d-檸檬烯、雙戊烯、香樹(shù)烯、(-)-α-蓽澄茄油烯、石竹烯、金合歡烯、δ-杜松烯、壬醛、橙花醛、十一醛、香葉醇、異亞丙基丙酮。16 種揮發(fā)性物質(zhì)僅在金佛手中檢測(cè)出，其中羅勒烯（1.773%）、左旋-α-蒎烯（4.196%）含量相對(duì)較高，高于1%；11 種揮發(fā)性物質(zhì)僅在廣佛手中檢測(cè)出，物質(zhì)百分含量普遍較低，全部低于1%；17 種揮發(fā)性物質(zhì)僅在滇佛手中檢測(cè)出，其中，3-蒈烯（5.799%）、1,5-二甲基-1,5-環(huán)辛二烯（5.063%）含量相對(duì)較高。

2.2 佛手柑關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

2.2.1 ROAV 分析

前期在佛手柑中檢測(cè)出了多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中一部分關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)佛手柑的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，其余揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)佛手柑整體風(fēng)味的呈現(xiàn)只起到修飾和協(xié)同作用。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)佛手柑風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)大小主要由其相對(duì)含量和香氣閾值決定。所以，查詢(xún)了77 種揮發(fā)性成分的風(fēng)味閾值，共找到37 個(gè)化合物的閾值，對(duì)查詢(xún)到閾值的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了ROAV 計(jì)算（見(jiàn)下頁(yè)表2）。ROAV≥1 的物質(zhì)對(duì)樣品香氣貢獻(xiàn)較大，為關(guān)鍵性香氣化合物，并且ROAV 值越大的物質(zhì)對(duì)樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)也越大[16]。

由表2 可以看出，三個(gè)產(chǎn)地佛手柑共有的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)有α-蒎烯、β-蒎烯、d-檸檬烯、雙戊烯、石竹烯、壬醛、橙花醛、十一醛和香葉醇。α-蒎烯和β-蒎烯主要表現(xiàn)為木香和草香，d-檸檬烯、雙戊烯和橙花醛表現(xiàn)為柑橘檸檬類(lèi)香氣，石竹烯和香葉醇主要為佛手柑主體香氣提供花香和蜜甜香，十一醛和壬醛則具有一定油脂氣息。此外，金佛手特有的關(guān)鍵香氣物質(zhì)有蒎烯、左旋-α-蒎烯和癸醛；廣佛手特有的關(guān)鍵香氣物質(zhì)有(Z)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯醛；滇佛手中沒(méi)有找到特有的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。金佛手中，d-檸檬烯的ROAV 值最高，為100，其次是香葉醇、芳樟醇和月桂烯，主要香氣特征表現(xiàn)為柑橘果香，輔助香氣為花香、木青香和辛香；廣佛手中，香葉醇的ROAV 是主要風(fēng)味貢獻(xiàn)物，其次是d-檸檬烯，ROAV值為38.178，主要香氣特征表現(xiàn)為濃郁的柑橘果香，輔以花香修飾；滇佛手中，香葉醇是最大的風(fēng)味貢獻(xiàn)化合物，同時(shí)芳樟醇的ROAV 值也高達(dá)76.950，提供木香和草香的青氣。

表2 佛手柑中揮發(fā)性物質(zhì)及其ROAV 值Table 2 Volatile substances and their ROAV values in finger citron

2.2.2 PCA 和風(fēng)味雷達(dá)圖

為進(jìn)一步研究關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)佛手柑風(fēng)味的影響，對(duì)佛手柑中ROAV≥1 的16 種香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖2（見(jiàn)第41 頁(yè)）所示。PC1（60.5%）和PC2（39.5%）的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，月桂烯（F6）和萜品烯（F7）是PC1 中正向載荷值最高的，香葉醇（F27）是PC1 中負(fù)載荷值最高的，α-蒎烯（F3）是PC2 中正向載荷值最高的，萜品油烯（F11）是PC2 中負(fù)載荷值最高的，說(shuō)明這些化合物對(duì)佛手柑的主體香氣貢獻(xiàn)最大。對(duì)這16 種關(guān)鍵香氣物質(zhì)進(jìn)行風(fēng)味雷達(dá)圖構(gòu)建（見(jiàn)第41 頁(yè)圖3），金佛手的主體香氣是柑橘香，修飾香氣是花香、木青香和香脂氣息；廣佛手的主體香氣是花香，修飾香氣是柑橘香；滇佛手主體香氣是花香和木青香，修飾香氣是柑橘香。

圖2 佛手柑關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)主成分載荷圖Fig.2 Principal component loadings for key volatiles in finger citron

圖3 不同產(chǎn)地佛手柑的香氣雷達(dá)圖Fig.3 Aroma radar map of finger citron from different regions

3 結(jié)論

本文采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)對(duì)三個(gè)不同產(chǎn)地佛手柑的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在篩選佛手柑的關(guān)鍵香氣揮發(fā)物。研究共檢測(cè)出揮發(fā)性物質(zhì)77 種，發(fā)現(xiàn)佛手柑中烴類(lèi)化合物占比最大，其次是醛類(lèi)和醇類(lèi)，其中有14 種共有成分。通過(guò)查找閾值對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行ROAV 計(jì)算，篩選出ROAV 值≥1 的關(guān)鍵香氣成分，共找到22 種關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)，其中佛手柑中共有的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)有α-蒎烯、β-蒎烯、d-檸檬烯等。佛手柑的主體香氣主要是柑橘果香、蜜甜香、花香和青香。金佛手特有的關(guān)鍵香氣有蒎烯、左旋-α-蒎烯和癸醛；廣佛手特有的關(guān)鍵香氣有(Z)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯醛；而滇佛手中沒(méi)有找到特有的關(guān)鍵香氣，這些特征香氣物質(zhì)可以作為區(qū)分不同產(chǎn)地佛手柑的參考依據(jù)。最后對(duì)16 個(gè)關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)月桂烯、萜品烯、香葉醇、α-蒎烯和萜品油烯對(duì)佛手柑的主體香氣貢獻(xiàn)最大。通過(guò)香氣雷達(dá)圖確定金佛手的主體香氣是柑橘香，廣佛手的主體香氣是花香，而滇佛手主體香氣是花香和木青香。本研究為三個(gè)產(chǎn)地佛手柑的篩選區(qū)分以及后續(xù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。