徐 冰，馮 濤

（上海應用技術大學香料香精化妝品學部，上海 201418）

桃（Prunus persicaL.）是薔薇科（Rosaceae）桃屬（AmycdalusL.）植物，是世界廣為熟知的重要水果之一，也是重要的經濟作物，其種植歷史可追溯到4 000 年以前，原產自中國，在北緯23～45°范圍內有廣泛的栽培[1]。香氣作為桃果實風味的重要組成部分，它的缺失極大地影響桃的感官品質，且降低人們的喜愛程度，從而影響其經濟價值。有研究證明低溫生產可以延長桃果實的保質期，但對果品的傷害比較明顯，常見的有冷害，從而間接導致某些重要香氣化合物的損失，影響桃果實的質量[2]。因此，在避免桃果實重要風味物質和感官特征損失的前提下，提高桃果實風味品質質量，調控桃揮發(fā)性風味物質的產生途徑，是桃育種栽培的一個重要環(huán)節(jié)。

代謝組學是20 世紀后期發(fā)展起來的一門新技術，用于對動物、植物和微生物細胞中所有分子量小于1 ku 的代謝物進行定性和定量分析，是繼基因組學[3]、轉錄組學[4]和蛋白質組學[5]之后系統(tǒng)生物學的又一研究重點，同時也是當前代謝組學研究領域的一個熱點[6]。鑒于桃果實的質量對其感官品質有著重要的作用，研究者嘗試將代謝組學與桃果實香氣研究相結合，通過對其香氣揮發(fā)物代謝途徑及機理的研究，鑒定出香氣物質合成途徑中的關鍵酶基因，并在2011 年就已經完善了全套桃基因的草圖[7]。本文通過總結桃果實在風味代謝組學研究方向的相關進展，以期推動代謝組學技術在桃果實風味領域的發(fā)展，并提供相關理論依據(jù)。

1 桃的分類及研究方法

桃是一種果實可食用的落葉小喬木，花可供觀賞，果實多汁，可以生食或成制桃脯、罐頭等，核仁也可以食用?！皦厶摇焙汀跋商摇倍际菤v年來桃所獲得的美稱，因其果肉鮮美，被譽為“天下第一果”。桃有黃肉桃和白肉桃之分，富含蛋白質、脂肪、碳水化合物、粗纖維、鈣、磷、鐵、胡蘿卜素、維生素B1、有機酸（主要是蘋果酸和檸檬酸）、糖分（主要是葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖）和揮發(fā)油等，適合低血鉀和缺鐵性貧血患者食用[8]。

1.1 桃的分類

中國是桃產量最大的國家，其次為美國、日本和意大利。據(jù)統(tǒng)計，中國的桃樹品種可達上千個[9]。根據(jù)桃的使用目的可分為可食用類和觀賞類，如蟠桃和油桃為可食用類，壽星桃和碧桃為觀賞類。目前研究桃果實香氣物質的品種大多為可食用類，對觀賞類的桃品種研究較少。

1.2 桃基因組建立

基于桃基因組不是很大，染色體數(shù)量又相對偏少（2n=16），其由單基因控制的性狀相對較多，且目前我們已在桃果實的基因組學研究領域獲得相當大的進步，測得桃基因組大小約為224.6 Mb，基因組覆蓋深度為8.5倍，通過高通量測序共得到3 729 679 條測序編碼，27 852 個蛋白編碼基因和28 689 個蛋白編碼轉錄本[10]。目前，在對桃香氣物質的合成以及冷害造成的相關遺傳機制的研究中，已經應用到全基因組重測序和高密度SNP（single nucleotide polymorphisms）芯片構建。Eduardo等[11]通過鑒定“Bolero”（B）和“OroA”（O）雜交的126 株幼苗的F1 代的果實揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds，VOC）的數(shù)量性狀基因位點（quantitative trait loci，QTL），以了解其遺傳基礎，使用International Peach SNP Consortium peach SNP array v1 芯片，構建了覆蓋桃基因組8 個連鎖群的密集SNP 和SSR 圖譜，獲得了23 種具有高“氣味活性值”的VOCs，其中主要QTL 為壬醛、芳樟醇及1-對薄荷烯-9-醛，且找到了2 個萜烯類合成酶基因和1 個脂氧合酶基因。同時，已有相關研究報道了桃可溶性糖和有機酸方面的代謝途徑及相關質地轉變的代謝組學進展[12]。

2 桃代謝組學研究方法

自20 世紀70 年代，Devaux 等[13]首次基于代謝輪廓分析（metabolic profiling）提出代謝組學（metabolomics）釋義后，代謝組學經過多年發(fā)展逐漸成熟，形成metabomics和metabonomics 兩種概念。其中metabonomics 是一種對代謝物相關信息的動態(tài)研究，而metabolomics 是對單個代謝體系的靜態(tài)研究[14]。代謝組學是一門基于多種分析技術的快速發(fā)展的學科，各種來自動物、植物和微生物的小分子代謝產物都可以成為其研究對象。由于研究對象的質量和方向的不同，其實驗前處理、測試和分析方法也隨之變化。本文就代謝組學在桃果實風味研究領域中的應用情況作一綜述，代謝組學的研究步驟分為樣本收集、代謝物提取、檢測分析鑒定以及數(shù)據(jù)處理。

2.1 樣品收集

桃樣品在栽培過程中容易受到植株品質和生長環(huán)境的限制。為了避免在分析過程中出現(xiàn)較大誤差，需要手動嚴格控制培養(yǎng)條件，減少樣品之間的差異。為了增加樣品數(shù)量并減少檢測誤差，應盡可能選擇外觀和輪廓相同的平行樣品。取樣后應及時對樣品進行滅活。滅活是指細胞內代謝酶活性迅速降低或停止，使代謝反應停止，并確保樣本中實時代謝信息能夠被有效反應。理想的滅活效果是使酶迅速失活和保證細胞不被破壞。桃果實代謝組學研究中主要使用的兩種滅活方法為液氮冷凍和高氯酸滅活[15]。

2.2 代謝物提取

為了代謝物分析結果的有效性能夠得到最大保證，理想狀態(tài)下的代謝物提取過程應達到包含提取完整、無偏向、不能破壞代謝物的物理化學和生物學特性的效果[16]。常見的桃果實代謝物萃取方法有固相微萃取法、超臨界流體萃取法、溶劑輔助風味蒸發(fā)法等[17]。酸、堿提取方法是常用的方法，其中甲醇-氯仿法對非極性代謝物的提取效果較好，因為極性高的代謝物不易溶于甲醇和氯仿，從而間接影響了提取效果，此外，該方法還存在操作時間長、氯仿毒性大等缺點[18]。Lillocarmona 等[19]采用甲醇-氯仿法對冷藏前后桃子的代謝物進行提取分析，共鑒定出119 種代謝物和189 種脂類，其豐度差異顯著的主要是氨基酸、糖和脂類。而桃果實風味主要與有機酸等非揮發(fā)性有機物和部分VOCs 有關，說明桃風味易受低溫的影響。

2.3 代謝物分離鑒定

代謝組學研究的核心組成包括代謝物的分離鑒定和分析。由于不同物種的代謝物的多樣性相異，且植物代謝物的多樣性遠遠高于動物和微生物的，因此分析桃風味相關代謝物的分析平臺就需要具備靈敏度高、效率高、分辨率高、高通量的四高特點[20]。對樣品進行代謝組學分析的完整步驟應包含代謝物的分離、檢測分析、數(shù)據(jù)處理[21]。桃樣品處理之后，最重要的就是選出能夠將所有代謝物都分析出來的技術手段[22]。氣相色譜法（gas chromatogram，GC）、毛 細 管 電 泳 法（capillary electrophoresis，CE）和液相色譜法（liquid chromatogram，LC）是常用的分離方法[21]。代謝組學常用的檢測手段是質譜（mass spectrometry，MS）和NMR。GC-MS 是常應用于桃果實代謝組學領域的分離檢測技術，靈敏度高、分辨率高，且自帶數(shù)據(jù)庫，可以減少檢測過程有關數(shù)據(jù)匹配搜索的繁瑣步驟，但它的缺點同樣也十分明顯，不能對非揮發(fā)性、熱敏感、極性過強和分子量過大的物質進行有效的檢測[23]，而LC-MS 則可以彌補這一缺點，因為其對非揮發(fā)性物質特別是酚酸等桃果實風味代謝物的分離優(yōu)勢更明顯[24]。目前集成的核磁共振平臺已經開發(fā)出來，可以監(jiān)測初級代謝產物和次生代謝產物的變化，并可用于研究桃果實在成熟前后的代謝變化[25]。除了以上方法外，還有光譜法結合多種分析法進行的代謝組學研究，如傅里葉紅外光譜法（fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）分析桃果實中的有機酸和糖[26]。

2.4 數(shù)據(jù)分析

化學物質的定性定量和統(tǒng)計學分析是對樣品代謝物相關數(shù)據(jù)處理及分析的主要手段，可以通過標準品的保留時間和數(shù)據(jù)庫檢索來對分離所得到的化學物質進行定性，通過譜圖中色譜峰的峰面積來進行定量，多維數(shù)據(jù)分析法（multivariate data analysis，MVDA）為代謝組學數(shù)據(jù)分析的常用手段[27]，包括以主成分分析法（principal component analysis，PCA）為主，非線形映射法（nonlinear mapping，NLM）、聚 類 分 析 法（hierarchical cluster analysis，HCA）等為輔的非監(jiān)督學習方法和以偏最小二乘分析法（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）為主，軟獨立建模法（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）和神經網絡法（artificial neural network，ANN）等為輔的監(jiān)督學習方法[28]。BioCyc、EMP、MctaCyc 等都是用來對代謝物信息分析的常用數(shù)據(jù)庫，常用分析軟件有MATLAB、SAS、SPSS、SIMCA 等[29]。但是目前仍然缺乏一個標準系統(tǒng)性的代謝物數(shù)據(jù)庫，還需研究人員共同推進代謝物數(shù)據(jù)庫的建立。

3 桃果實香氣化合物的主要合成代謝途徑

根據(jù)香氣形成的前體物質不同，將果實中揮發(fā)性和非揮發(fā)性風味物質的代謝合成途徑分為碳水化合物代謝途徑、脂肪酸代謝途徑和氨基酸代謝途徑，其中碳水化合物代謝又分為呋喃酮代謝和萜烯代謝，呋喃酮代謝合成的香氣，多是一些味道較為甜膩的水果中產生，而萜烯代謝合成的香氣物質多為柑橘類水果所有[30]。由于桃果實中呋喃酮類的香氣成分較少，本文不予討論。

3.1 脂肪酸途徑

脂肪酸代謝主要分為兩條途徑，一條是脂類物質，主要是亞油酸和亞麻酸在脂氧合酶（lipoxidase，LOX）的作用下直接生成六碳化合物和醇，其次是酯類物質經由β-氧化生成酮酸、酰基輔酶A，再生成醇類和醛類物質[31]。有相關研究證明，六碳化合物主要是用來體現(xiàn)桃果實中青草香的揮發(fā)性物質，如戊醛、庚烯醛等的合成都是通過以脂肪酸為前體物質，經脂肪酸途徑和β-氧化等一步步氧化、裂解和還原而形成[32]。作為對脂肪酸代謝起關鍵作用的酶，酶反應底物如亞油酸和亞麻酸濃度的高低會直接影響LOX 反應活性，從而間接影響香氣物質的釋放量[33]。LOX 途徑的特定反應始于甘油酯和其他物質與脂肪酶反應中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的釋放。六碳醛和醇的產生是受到過氫過氧化物裂解酶（HPL）和乙醇脫氫酶等一系列酶催化的，最后在醇?；D移酶（alcohol acyltransferase，AAT）催化下形成酯。在將醇類物質轉化為酯類物質的過程中，AAT 功不可沒。它催化?；鸵圆煌绞胶铣傻母鞣N醇類物質之間形成各種酯類物質。因此，其含量會影響桃果實中酯類芳香物質的形成，LOX途徑在催化酯類物質合成的過程中的酰基主要來自?；o酶a。

已知羥基脂肪酸作為內酯類物質的生物合成來源，其通過β-氧化形成4-或5-羥基酸，再經過自環(huán)化或在AAT 的催化下形成相應的內酯。而合成內酯類物質的另一個途徑是飽和脂肪酸的β-氧化，乙酰輔酶A 是參與該過程的關鍵酶，其中體現(xiàn)桃果實香氣的γ-癸內酯就是在該酶的輔助下逐漸形成的。目前已知，許多芳香環(huán)氧化物都是可以經過環(huán)氧化物水解酶（epoxide hydrolase，EH）水解產生的。且在內酯類物質的相關代謝中，脂肪酸經過環(huán)氧化后，通過EH 來進一步掌握對環(huán)氧化物環(huán)的裂解，從而形成羥基脂肪酸，然后再由β-羥基脂肪酸加工、β-氧化等一系列反應，最終得到內酯類物質。

3.2 萜類合成途徑

萜烯類揮發(fā)性化合物作為一大類植物芳香物質，許多植物香氣的成分都包括單萜類和少數(shù)倍半萜類物質。五碳前體物質異戊二烯的形成是受到萜類合酶的作用，所以異戊二烯途徑是萜類合成途徑的一種另稱，萜烯類物質也叫類異戊二烯化合物[34]。酮類香氣物質也是通過這種代謝途徑合成。香葉基焦磷酸（geranyl geranylpyrophosphate，GPP）是所有單萜的前體物質，而合成GPP 則需要異戊烯焦磷酸（isoprene pyrophosphate，IPP）或其異構體二甲基烯丙基焦磷酸（dimethyl allyl pyrophosphate，DMAPP）為前體。根據(jù)異戊二烯結構骨架的數(shù)量，將這些產生五碳前體的途徑分為兩條：一條是發(fā)生在細胞質中的甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑，該途徑中的關鍵酶是乙酰輔酶A；另一條途徑則為甲基赤蘚糖醇磷酸途徑（methyl erythriotl phosphate，MEP），MEP途徑從丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸縮合，形成1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸開始，最終得到這些五碳化合物包括單萜、倍半萜、三萜類。在受萜類合成酶催化的過程中，研究人員對單萜類形成起到催化作用的各種酶類物質的關注度不斷提高，其中就有形成芳樟醇的芳樟醇合成酶，而其則是桃果實的特征香氣中的一種[35]；類胡蘿卜素是作為β-紫羅蘭酮等物質的合成前體的，且給桃果實倍半萜揮發(fā)物的合成帶來促進作用的關鍵酶就是類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（carotenoid cleaving dioxygenase，CCD）。

3.3 氨基酸途徑

氨基酸途徑是以芳香氨基酸為合成前體物質，是桃果實中芳香特征香氣揮發(fā)性化合物合成的主要方式。桃中富含的氨基酸種類有很多，目前有相關研究證明纈氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸等物質含量的變化與芳香物質呈正相關。它是一種合成前體物質，對桃果實的風味成分影響很大。首先L-苯丙氨酸作為苯丙氨酸解氨酶催化的主要底物，經過酰基化、甲基化、羥基化等反應，最終生成苯乙醛、苯乙醇等揮發(fā)性香氣化合物[36]?？赡軈⑴c合成的酶包括丙酮酸脫羧酶、芳香族氨基酸氨基轉移酶、芳香族氨基酸脫羧酶等[37]。桃果實中的香氣成分大部分是醇、酸、酯類化合物，這些化合物合成的很大一部分香氣前體物質來自氨基酸，常見的氨基酸代謝香氣前體物質是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等，在轉氨酶和丙酮酸脫氫酶作用下，經轉氨基和脫羧兩步反應得到香氣物質[38]。

4 代謝組學在桃果實香氣物質研究領域的相關應用

代謝組學作為應用驅動的一個新的研究方向，在藥物毒理學與動物模型、食品營養(yǎng)與安全、疾病診斷與治療、植物育種與抗性研究等方面具有較高的研究價值，而在植物果實香氣分析方面研究較少。

4.1 桃果實遺傳基因的代謝組學研究

桃風味物質的組成和含量高低會受遺傳因素的影響，且不同品種其基因的變化也會間接影響到其它風味物質的相關指標。謝凱麗[39]采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）聯(lián)合氣相色譜質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）并結合轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-Seq）的方法對128 種不同種資源的桃果實香氣物質進行PCA 和聚類分析發(fā)現(xiàn)，這128 種桃可分為5 類，A 類桃的香氣物質主要以內酯類物質為主，含量占比約為44%，特征香型為“桃香型”，入選的桃品種大多為蟠桃；B 類桃的香氣物質主要以萜類物質為主，含量占比約為57%，特征香型為“花香”，入選的桃品種大多為水蜜桃；C 類桃的香氣物質主要以酯類物質為主，含量占比約為34%，特征香型為“果香”，入選的桃品種大多為黃桃；D 類桃的香氣物質種類較為復雜，包括C6化合物、萜烯類、酯類、醇類物質，特征香型為“混合香”，入選的桃品種也比較分散；E 類桃的香氣物質主要以C6化合物為主，含量占比高達56%，特征香型為“青香”；由此可見，品種不同導致基因表達相異，從而桃果實的香氣物質種類和含量也大有不同。

4.2 桃果實采前采后風味物質變化的代謝組學研究

桃果實采摘前栽培管理措施對桃果實香氣物質形成的影響也比較突出，比如灌溉和光照，不同冠層位置的果實暴露在不同的光照環(huán)境中，影響其成熟過程和內部品質發(fā)育。Anthony 等[40]通過采用GC-MS 聯(lián)用技術，對同樣成熟的桃果實樣品的中果皮和外果皮進行了非靶向代謝物圖譜分析。來自不同冠層位置同樣成熟果實的中果皮代謝產物圖譜顯示，其代謝變化最小。然而，HV品種的外果皮冠層代謝產物存在顯著差異。一般而言，蔗糖、山梨醇和兒茶素質量較高，而天冬氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、檸檬酸、單糖（山梨糖和果糖）、丁酸和莽草酸在低光環(huán)境果實中質量較低?？傊@種生理和代謝組學的分析提供了深入了解冠層位置的真實影響，并強調了光環(huán)境相關的促進桃果實品質發(fā)育的代謝調控。采后貯藏過程中的果實呼吸直接影響主要的代謝途徑，如糖酵解、淀粉代謝和三羧酸循環(huán)，這些途徑解釋了糖、氨基酸和有機酸水平的變化。事實上，碳水化合物、有機酸、蛋白質和脂肪是水果貯藏過程中主要的呼吸底物，而消費者對水果的接受程度則直接受到糖和酸含量以及兩組初級代謝物比例的影響[41]。

4.3 桃果實成熟度的代謝組學研究

成熟是一個在分子水平上高度調控的過程，顯著影響果實質量[42]。Liu 等[43]發(fā)現(xiàn)對不同成熟期的水蜜桃用于果酒制備的質量指標和香氣特征之間存在顯著差異，試驗將采收時的水蜜桃按照成熟度分為四組，并對四組酒樣的理化性質、生物活性成分、顏色、透光率、揮發(fā)性風味成分和感官接受度進行了考察，結果表明，水蜜桃成熟度越高，顏色強度、單寧含量、酯類含量也就越高，而果酒的總酚含量、總黃酮含量和透光率卻偏低。且隨著蜜桃成熟度的增加，風味和口感上的平衡得到改善，而過熟的水蜜桃產生的一些腐敗酸是導致果酒產生不愉快味道的主要原因。綜上所述，水蜜桃制備果酒的最佳采收期為90%～100%成熟度的時期。這些結果表明，水蜜桃成熟度可能影響最終的果酒成分和質量，應在制備時加以考慮。桃子加工類的產品（如果酒、果汁、果醬和果凍）的質量在很大程度上取決于酚類化合物的含量和多酚氧化酶的活性，因為桃子在加工過程中很容易受到不良酶促褐變的影響[44]。

4.4 桃果實貯藏條件的代謝組學研究

桃是世界上第三大重要的溫帶水果作物。由于出口市場的長途性質，桃子的出口是一個挑戰(zhàn)。這需要對桃進行長時間的冷藏，易導致一種被稱為寒傷的生理紊亂現(xiàn)象。Brizzolara 等[45]對三個品種桃在采摘后低溫儲存4周后，采用GC-MS 對三種桃果實的代謝物進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)在三個品種中，棉子糖、葡萄糖-6p、聚焦糖、木糖、山梨醇、GABA、表兒茶素、兒茶素和腐胺在冷藏過程中顯著增加，而檸檬酸、葡萄糖醛酸、芥子酸和莽草酸則降低。在冷藏過程中香氣化合物含量及種類也有顯著的變化，例如，醛類和醇類在冷藏過程中通常積累更多，而酯類和內酯的產生受到強烈抑制。在冷藏后的貨架期過程中，能檢測到更具體的反應，每個品種都以特定的方式表現(xiàn)，可檢測到一些常見的反應，如乙酸乙酯的產量增加。

5 展望

桃果實芳香品質研究已取得深入進展，當前已鑒定出大量與揮發(fā)性物質有關的桃果實香氣特征，并通過不斷加快對合成相關生物代謝途徑的探索和桃果實全基因組測序的步伐，將會促進分離鑒定與桃香氣化合物代謝有關的基因的發(fā)展，但相比較其他科的植物，桃果實作為薔薇科植物的一種，還有相當多的研究工作需要進行補充和完善。由于桃果實香氣化合物合成多樣性太繁雜，且相關代謝物調控的機制過于復雜，所以目前我們還需就控制相關酶的活性出發(fā)，來進一步調整桃果實的香氣產生，為這些與代謝相關的酶和基因是如何對外界帶來的刺激產生一系列反應的行為，為快速掌握桃果實香氣化合物的合成代謝途徑，特別是有關轉錄和翻譯水平的調控作進一步的探索。開展桃果實香氣合成代謝組學的研究，可迎合消費市場需求，通過分子輔助的手段為桃新品種的培育提供相關理論依據(jù)。