吳崢，雷敏，蔡俊

（發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北工業(yè)大學，湖北 武漢 430068）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）即 γ-谷氨酸-L-半胱氨酸-甘氨酸，是由3種氨基酸（谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸）在谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合酶的連續(xù)作用下合成的非蛋白硫醇三肽[1]，具有保護細胞抵抗氧化性損害，維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要作用[2-4]。GSH廣泛應(yīng)用于食品[5-7]、化妝品[8]和醫(yī)藥[9-12]等工業(yè)領(lǐng)域，可作為抗氧化劑和調(diào)味劑，能夠有效防止食品的褐變、保持食品獨特風味[13-16]，也可以作為自由基清除劑，具有保護腎臟、增強肝臟解毒能力的功效[17-18]。

微生物發(fā)酵法是目前工業(yè)化生產(chǎn)GSH最普遍的方法[19-20]，然而GSH作為一種胞內(nèi)產(chǎn)物，在發(fā)酵下游提取GSH的生產(chǎn)力和經(jīng)濟效益無法有效滿足市場需求，在一定程度上制約其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，若發(fā)酵菌株胞內(nèi)GSH能有效分泌至胞外，則可以在發(fā)酵液中直接制備純化GSH，簡化提取工藝，降低下游分離純化GSH的難度，從而提高GSH的生產(chǎn)力。近年來，如何獲得產(chǎn)胞外GSH的發(fā)酵菌株受到國內(nèi)外學者的關(guān)注[21]。如利用基因工程技術(shù)來增強發(fā)酵菌株對GSH的胞外運輸作用[22-24]，或是通過改善細胞膜通透性促進谷胱甘肽的外泌與積累。但構(gòu)建胞外發(fā)酵谷胱甘肽工程菌的改造成本和技術(shù)要求較高，且細胞膜通透性的調(diào)節(jié)為有機試劑化學滲透法[25]，考慮到對菌株生長活性和環(huán)境的影響，此方法不宜應(yīng)用在工業(yè)化生產(chǎn)。

利用傳統(tǒng)紫外誘變育種技術(shù)，不僅能簡便快速地篩選得到目的菌株，而且能確保突變株遺傳穩(wěn)定性[26]，然而目前研究報道中，通過紫外誘變只篩選出胞內(nèi)高產(chǎn)谷胱甘肽的突變株，未得到產(chǎn)胞外谷胱甘肽的突變株[27-29]。因此，本研究以釀酒酵母（Saccharmyces Cerevisiae）GAQ4為出發(fā)菌株，采用紫外迭代誘變，選育出發(fā)酵產(chǎn)胞外谷胱甘肽且遺傳穩(wěn)定的突變株，并通過優(yōu)化其發(fā)酵條件進一步提高胞外GSH產(chǎn)量，為GSH胞外發(fā)酵策略和實現(xiàn)GSH胞外發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GAQ4：湖北工業(yè)大學教育部重點實驗室工業(yè)發(fā)酵，湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心A610實驗室保藏菌株。

葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、瓊脂粉、磷酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；1-庚烷磺酸鈉、谷胱甘肽（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜級）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZSD-12全自動生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器有限公司；ZHWY系列雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器：中國科學院武漢科學儀器廠；LC-20AD型高效液相色譜儀：日本島津公司；Sartorius普及型PH計（PB-10）：賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH值自然。

種子固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸銨8 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，硫酸鎂0.15 g/L，pH值自然。

種子培養(yǎng)：取甘油管保藏的菌懸液接入種子培養(yǎng)基中，于溫度30℃、搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min條件下進行培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)：取處于對數(shù)生長期的種子液，以體積分數(shù)為10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于溫度30℃、搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)。

1.3.2 紫外誘變

誘變過程：將15 W紫外燈預(yù)熱20 min。取處于對數(shù)生長期的種子菌懸液，將菌懸液稀釋至細胞數(shù)為107CFU/mL～108CFU/mL，取 200 μL 稀釋液涂布至種子固體培養(yǎng)基后，立即將培養(yǎng)基平板放置距離紫外燈30cm處進行紫外照射，照射時間分別為10、20、30、40、50、60 s，每組設(shè)置3個平行，照射結(jié)束后立即將平板倒置于30℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，統(tǒng)計各平板生長的單菌落數(shù)。將未經(jīng)紫外照射的稀釋菌懸液涂布在固體培養(yǎng)基后避光培養(yǎng)，作為對照組。計算紫外誘變致死率，以紫外照射時間為橫坐標，紫外誘變致死率為縱坐標，繪制紫外誘變致死曲線。誘變致死率計算公式如下。

紫外迭代誘變：以菌株胞外GSH含量為篩選指標，對出發(fā)菌株GAQ4進行紫外迭代誘變處理，即下一次誘變以上一次誘變后篩選得到符合篩選指標的突變株為出發(fā)菌株，再次進行誘變篩選。每次誘變的試驗組設(shè)置3個平行，以獲得足夠突變株數(shù)量，提高正向突變率。每一次紫外誘變均需繪制紫外誘變致死曲線，以便選擇各代誘變菌株最適誘變劑量。

遺傳穩(wěn)定性試驗：為確認獲得的目的菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，將篩選得到的目的菌株連續(xù)傳代8次，并對第1代、第4代和第8代進行發(fā)酵培養(yǎng)，以出發(fā)菌株GAQ4為對照，檢測對比發(fā)酵產(chǎn)胞外谷胱甘肽含量。

1.3.3 發(fā)酵條件單因素試驗

以胞外GSH含量為指標，采用單因素試驗研究發(fā)酵周期、搖瓶裝液量、初始pH值和發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速對突變株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)胞外GSH含量的影響，試驗水平分別為發(fā)酵周期 24、36、48、60、72 h；搖瓶裝液量50、75、100、125、150 mL/300 mL；初始 pH 值 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；發(fā)酵溫度 26、30、34、38、42 ℃；搖瓶轉(zhuǎn)速 120、140、160、180、200 r/min。對突變株搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，各因素設(shè)置3個平行，取平均值，確定最優(yōu)搖瓶發(fā)酵條件。

1.3.4 生物量的測定

取一定體積菌懸液于8 000 r/min離心5 min后收集濕菌體，用無菌水洗滌菌體3次后，置于65℃烘箱烘干至恒重，稱量得到細胞干重，生物量計算公式如下。

生物量/（g/L）=細胞干重（g）/菌懸液體積（L）

1.3.5 谷胱甘肽的測定

利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定 GSH 含量[30]，色譜條件：色譜柱Inertsil ODS-SP C18，流動相為庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液（1-庚烷磺酸鈉6.8 g，磷酸二氫鉀2.2 g，用磷酸調(diào)節(jié)pH 3.0，超純水定容至1 L）和甲醇（磷酸鹽緩沖液與甲醇體積比為90∶10），流速為1.0 mL/min，進樣量20 μL，紫外檢測波長為210 nm。

稱取谷胱甘肽標品10 mg，用超純水定容至10 mL，分別稀釋到濃度為 200、400、600、800、1 000 mg/L，用HPLC法檢測出不同GSH溶液濃度對應(yīng)的峰面積，以GSH濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制HPLC法檢測標準曲線（如圖1），得到標準曲線回歸公式為y=18 045x+168 919，R2=0.999 3，以此進行 GSH 含量的計算。

圖1 HPLC法檢測谷胱甘肽的標準曲線Fig.1 Standard curve of glutathione determined by HPLC

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變育種結(jié)果

2.1.1 出發(fā)菌株GAQ4胞外GSH含量

對出發(fā)菌株GAQ4進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，檢測得到其胞外谷胱甘肽含量為7.37 mg/L，以出發(fā)菌株胞外谷胱甘肽含量為指標，與誘變得到突變株產(chǎn)胞外谷胱甘肽含量進行對照。

2.1.2 紫外誘變篩選結(jié)果

以胞外GSH含量為篩選指標，根據(jù)1.3.2的方法對出發(fā)菌株GAQ4進行紫外迭代誘變處理。第1次紫外誘變篩選結(jié)果見圖2。

圖2 第1次紫外誘變結(jié)果Fig.2 Results of first UV mutagenesis

如圖2A所示，根據(jù)第1次紫外誘變致死曲線，隨著紫外照射時間的延長，誘變致死率逐漸升高。在紫外照射時間為30 s時，出發(fā)菌株致死率達到74.5%，處于高概率正向突變的致死率范圍內(nèi)，選擇紫外照射30 s作為第1次紫外誘變的劑量。

第1次紫外照射處理后共挑取出200個單菌落，以發(fā)酵后具有較高胞外谷胱甘肽含量為指標，從初篩菌株中挑選出15株突變株（圖2B），其中突變株UV1-6胞外谷胱甘肽含量為13.87 mg/L，相比出發(fā)菌株胞外谷胱甘肽含量提高了88.20%，選擇突變株UV1-6繼續(xù)進行紫外誘變篩選。

以突變株UV1-6為第2次紫外誘變的出發(fā)菌株，第2次紫外誘變篩選結(jié)果見圖3。

圖3 第2次紫外誘變結(jié)果Fig.3 Results of second UV mutagenesis

由圖3A可知，突變株在紫外照射30 s時菌體致死率為78.6%，在相同誘變劑量下與前一次誘變效果相比，致死率提高，仍選取紫外照射30 s誘變劑量進行第二次誘變處理。

由圖3B可知，經(jīng)第2次紫外誘變篩選，從中挑選出胞外谷胱甘肽含量相對較高的14株突變株，其中篩選得到的突變株UV2-2胞外谷胱甘肽含量為16.10 mg/L，比出發(fā)菌株GAQ4和突變株UV1-6胞外谷胱甘肽含量分別提高了118.45%、16.08%。

繼續(xù)對突變株UV2-2進行第3次紫外誘變處理，結(jié)果見圖4。

圖4 第3次紫外誘變結(jié)果Fig.4 Results of third UV mutagenesis

由圖4A可知，相同誘變劑量作用后，第3次紫外誘變的致死率明顯提高，當紫外照射10 s時致死率達到69.5%，紫外照射20s時致死率為81.9%，因此選取照射15 s作為第3次誘變處理時間。經(jīng)過篩選得到11株胞外GSH含量較高突變株。由圖4B可知，第3次誘變篩選得到的突變株UV3-10胞外GSH含量為19.08 mg/L，相比出發(fā)菌株、突變株UV1-6和突變株UV2-2胞外GSH含量分別提高了158.89%、37.56%和18.51%。

通過以上分析，第3次誘變的正向突變效果不如前兩次明顯，篩選出的突變株中僅有少量突變株的胞外谷胱甘肽含量提高，部分突變株含量甚至低于第3次誘變前，且在相同誘變劑量作用下的紫外誘變致死率逐漸提升，超出處于高概率正向突變的致死率范圍內(nèi)，因此不再進行第4次誘變篩選，選取3次紫外誘變篩選得到的突變株UV1-6、UV2-2、UV3-10進行下一步試驗。

2.1.3 遺傳穩(wěn)定性結(jié)果

將3次紫外誘變篩選獲得的突變株UV 1-6、UV 2-2、UV 3-10連續(xù)傳代8次，分別測定第1代、第4代和第8代發(fā)酵培養(yǎng)后胞外谷胱甘肽含量，結(jié)果見表1。

表1 突變株遺傳穩(wěn)定性檢測結(jié)果Table 1 Genetic stability determination of mutants

在突變株傳至第8代時，突變株UV 3-10胞外谷胱甘肽含量最高，為18.56 mg/L，且突變株UV 3-10發(fā)酵產(chǎn)胞外谷胱甘肽的性能具有一定的遺傳穩(wěn)定性，因此選擇突變株UV 3-10作為目的菌株。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

突變株UV3-10在原始搖瓶發(fā)酵條件，即搖瓶裝液量100 mL/300 mL、發(fā)酵初始pH值為自然、發(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的發(fā)酵條件下，突變株胞外GSH含量為18.56 mg/L，生物量為5.64 g/L。分別對突變株發(fā)酵條件的發(fā)酵周期、搖瓶裝液量、初始pH值、發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速進行單因素優(yōu)化試驗。發(fā)酵周期對目的菌株UV3-10產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵周期對目的菌株UV3-10產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響Fig.5 Effect of fermentation cycle on extracellular GSH production by UV3-10

由圖5可知，突變株胞外谷胱甘肽含量隨著發(fā)酵時間的延長呈先上升后下降的趨勢。在發(fā)酵時間為48 h時，胞外谷胱甘肽含量為18.97 mg/L，隨著發(fā)酵時間繼續(xù)延長，胞外谷胱甘肽含量開始下降，因此選取48h為發(fā)酵時間，在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化其他發(fā)酵條件。

搖瓶裝液量對目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響見圖6。

圖6 搖瓶裝液量對目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響Fig.6 Effect of shake flask volume on extracellular GSH production by UV3-10

由圖6可知，當搖瓶裝液量為75 mL/300 mL時，目的菌株胞外谷胱甘肽含量最高，隨著搖瓶裝液量逐漸增加，胞外谷胱甘肽含量開始下降，搖瓶裝液量過高，影響搖瓶中的溶氧量從而影響目的菌株的發(fā)酵性能，故選擇最佳搖瓶裝液量為75 mL/300 mL。

突變株搖瓶初始pH值優(yōu)化結(jié)果見圖7。

圖7 初始pH值對目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響Fig.7 Effect of initial pH on extracellular GSH production by UV3-10

當發(fā)酵初始pH值從5.0升至6.0時，胞外谷胱甘肽含量變化不大，而pH值增至6.5時胞外谷胱甘肽含量迅速增高到36.42 mg/L，隨著pH值上升胞外谷胱甘肽含量又開始下降，在pH 6.5時胞外谷胱甘肽含量達到最大值，因此選擇最佳初始pH值為6.5。

發(fā)酵溫度對目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響見圖8。

圖8 發(fā)酵溫度對目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on extracellular GSH production by UV3-10

由圖8可知，發(fā)酵溫度對目的菌株胞外谷胱甘肽含量的影響高于其他因素，發(fā)酵溫度適當升高對突變株分泌胞外谷胱甘肽有促進作用[31]。隨著發(fā)酵溫度的升高，胞外谷胱甘肽含量也在不斷增加，當發(fā)酵溫度升至34℃時，胞外谷胱甘肽含量達到40.63 mg/L，是發(fā)酵溫度30℃時胞外谷胱甘肽含量的1.68倍。若發(fā)酵溫度繼續(xù)升高，胞外谷胱甘肽含量不再增加，溫度升至42℃時突變株胞外谷胱甘肽含量僅為17.15 mg/L，此時生物量降至最低，僅有3.16 g/L。因此，選擇發(fā)酵溫度34℃為最優(yōu)發(fā)酵溫度。

搖瓶轉(zhuǎn)速對目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響見圖9。

圖9 搖瓶轉(zhuǎn)速對目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽的影響Fig.9 Effect of shaking speed on extracellular GSH production by UV3-10

搖瓶溶氧量受到搖瓶裝液量和轉(zhuǎn)速的影響，搖瓶轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力、傳質(zhì)速度以及裝液量的大小對菌株的接種量、生長狀態(tài)和發(fā)酵產(chǎn)物的合成與積累均有影響，由圖9可知，當搖瓶轉(zhuǎn)速為140 r/min時，胞外谷胱甘肽含量最高，目的菌株產(chǎn)胞外谷胱甘肽含量為52.05 mg/L，是優(yōu)化前胞外谷胱甘肽含量的2.80倍。

經(jīng)上述搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化后，突變株在搖瓶裝液量75 mL/300 mL、發(fā)酵初始pH值6.5、發(fā)酵溫度34℃、轉(zhuǎn)速140 r/min時，發(fā)酵48 h后，胞外GSH含量達到52.05 mg/L，是優(yōu)化前胞外GSH含量的2.80倍。

3 討論與結(jié)論

本研究利用紫外迭代誘變法，篩選出能產(chǎn)胞外GSH的突變株UV3-10，其胞外GSH含量為18.56 mg/L，通過單因素試驗得到其最優(yōu)搖瓶發(fā)酵條件為發(fā)酵周期48 h、裝液量75 mL/300 mL、發(fā)酵初始pH值6.5、發(fā)酵溫度34℃、轉(zhuǎn)速140 r/min，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化后突變株胞外GSH含量為52.05 mg/L，是優(yōu)化前胞外GSH含量的2.80倍。

關(guān)于突變株UV3-10的胞外分泌機制提出以下猜想：誘變處理后的突變株細胞通透性發(fā)生改變，即誘變后使某種GSH輸出蛋白的活性得到加強，或者抑制了某種GSH降解蛋白的活性，使酵母細胞胞內(nèi)物質(zhì)向胞外特異性溢出，在正常發(fā)酵條件下產(chǎn)生了GSH胞外積累的現(xiàn)象。后續(xù)研究可探究突變株的谷胱甘肽運輸?shù)鞍准癎SH合成酶系的活性與其胞外分泌機制的關(guān)聯(lián)性，另外，在發(fā)酵下游如何維持胞外GSH穩(wěn)定性也是有待研究的問題。

突變株UV3-10能將胞內(nèi)合成的GSH分泌至胞外，實現(xiàn)了胞外GSH的有效積累，使在發(fā)酵液中進行GSH工業(yè)化制備的可能性大大提升，相較于胞內(nèi)GSH的提取，其純化分離難度降低，節(jié)省生產(chǎn)成本和能源消耗。另外，釀酒酵母又是食品安全生產(chǎn)菌株，備受食品研發(fā)者們的青睞，釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)胞外GSH的研究結(jié)果為其在食品加工、貯藏保鮮以及功能性調(diào)味品等方面的應(yīng)用提供了新前景和經(jīng)濟效益。