韋錦源，劉丹，楊靜賢，李孜，鐘青萍

（廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

食源性疾病是一類通過(guò)攝取食物使致病因子進(jìn)入體內(nèi)而引起感染或中毒的常見(jiàn)人類疾病[1-2]，其在全球范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，對(duì)經(jīng)濟(jì)及社會(huì)發(fā)展均造成了不利影響[3-4]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2020年數(shù)據(jù)顯示，全世界每年有5.5億人因食用受污染的食物而患病，其中約23萬(wàn)人死亡[5]。食源性致病菌是引起食源性疾病的一大原因[6-7]，其中單增李斯特氏菌是常見(jiàn)致病菌，它廣泛存在于環(huán)境、食品、人和動(dòng)物宿主中，可以在極端條件下生存并引起食物污染，食用被該菌污染的食物會(huì)引起李斯特菌病，致死率高達(dá)20%～30%，對(duì)公共衛(wèi)生安全危害較大[8-9]。對(duì)于常見(jiàn)致病菌的檢測(cè)，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法仍是公認(rèn)且可靠的方法，但需要經(jīng)過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定等多個(gè)步驟，較為繁瑣[10-12]；常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法因檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)而受限?；诿庖邔W(xué)技術(shù)的檢測(cè)不能區(qū)分死活細(xì)胞[13]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是由 Notomi等[14]于 2000 年提出的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，可在恒溫的條件下對(duì)靶基因進(jìn)行檢測(cè)[15-16]，但是常規(guī)的LAMP方法需要擴(kuò)增完成后進(jìn)行染色，容易形成氣溶膠污染[17]；依靠對(duì)反應(yīng)過(guò)程或終點(diǎn)進(jìn)行熒光染色的熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（real-time loopmediated isothermal amplification，real-time LAMP）可較好地解決此問(wèn)題[18]，但熒光染料染色易造成假陽(yáng)性，因此尋求一種更精準(zhǔn)、便捷的染色方法顯得至關(guān)重要。基于淬滅基團(tuán)釋放環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（detection of amplification by release of quenching-LAMP，DARQLAMP）是在一條內(nèi)引物的5’端修飾熒光基團(tuán)（或淬滅基團(tuán)），并加入一條與上游內(nèi)引物（forward inner primer，F(xiàn)IP）中的F1c部分互補(bǔ)且3’端修飾淬滅基團(tuán)（或熒光基團(tuán)）的探針，該探針在反應(yīng)前需預(yù)先與內(nèi)引物進(jìn)行孵育，使探針與內(nèi)引物雜交形成淬滅探針雙鏈（quenching probe double chain，QPD），使得熒光處于淬滅狀態(tài)，當(dāng)聚合酶遇到雙鏈，探針就會(huì)移位并產(chǎn)生熒光信號(hào)[19]。DARQ-LAMP方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速的特點(diǎn)，但未有檢測(cè)單增李斯特菌的研究報(bào)道[20-22]。本文針對(duì)單增李斯特氏菌的特異性基因hlyA設(shè)計(jì)引物[23]，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立real-time LAMP方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立DARQ-LAMP方法，提高檢測(cè)效率，為L(zhǎng)AMP檢測(cè)食源性致病菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

目標(biāo)菌株：?jiǎn)卧隼钏固鼐↙isteria monocytogenes ATCC 19115），以及非目標(biāo)菌株：斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri ATCC 35967）、英諾克李斯特菌（Listeria innocua ATCC 33090）、伊氏利斯特菌（Listeria ivanovii ATCC19119）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 25922）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri ATCC 12022）、屎腸球菌（Enterococcus faecium ATCC 29212）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis CGMCC 26069）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes ATCC 13048）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis CGMCC 1.1869）、馬紅球菌（Rhodococcus equi ATCC 6939），均于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室保藏。

柱式細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（B518255）、溶菌酶、Bst DNA 聚合酶、Taq PCR Master Mix、Bst LF DNA Polymerase、10×ThermoPol緩沖液、MgCl2溶液、dNTP Mixture、滅菌雙蒸水：中國(guó)上海生工（生物工程）股份有限公司；Eve Green（20×水溶液）：中國(guó)翌圣生物科技（上海）有限公司；胰蛋白胨、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)、PALCAM瓊脂粉、腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基、大豆蛋白胨：中國(guó)廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FormaClassⅡ生物安全柜：美國(guó)Thermo公司；THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CFX 96TM熒光定量PCR儀：伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；SP-02生化培養(yǎng)箱：廣州市綠向生物科技有限公司；VORTEX-3渦旋振蕩器：上海金鵬分析儀器有限公司；TP600梯度PCR儀：日本Ta-KaRa儀器有限公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì)、5417R高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；AF100制冰機(jī)：意大利SCOTSMAN公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

保藏于-80℃的單增李斯特菌在腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基中，150 r/min活化16 h備用，其余菌株于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中37℃、150 r/min活化16 h。

1.3.2 DNA模板的制備

采用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取模板DNA，具體步驟按照柱式細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（B518255）說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.3 LAMP引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得單增李斯特菌（GenBank：HM589597.1）的基因序列，基于序列信息和相關(guān)前期研究，使用LAMP引物設(shè)計(jì)工具Primer Explorer V5（https：//primerexplorer.jp/e/）針對(duì)特異性基因hlyA進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。最終確定的引物和探針由上海生工生物有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。熒光基團(tuán)為FAM、淬滅基團(tuán)為BHQ-1、熒光最大激發(fā)波長(zhǎng)為494 nm、熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)為518 nm、淬滅劑的淬滅范圍為480 nm～580 nm。

表1 LAMP引物和探針序列Table 1 LAMP primers and probe sequences

1.3.4 以hlyA為靶基因建立檢測(cè)單增李斯特菌的real-time LAMP

以單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行real-time LAMP反應(yīng)，以非目標(biāo)菌株做陰性對(duì)照。優(yōu)化前的real-timeLAMP反應(yīng)體系（25 μL）包括：F3 與 B3 各 0.2 μmol/L，F(xiàn)IP 與下游內(nèi)引物（backward inner primer，BIP）各 1.6 μmol/L，脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTPs）1.6 mmol/L，Mg2+6 mmol/L，Bst DNA 聚合酶 8 U，10×Reation Buffer 2.5 μL，20×EvaGreen 水溶液 1 μL，DNA模板1 μL，空白對(duì)照以等量ddH2O代替，補(bǔ)充無(wú)菌ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件：65℃1 min，共60個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)；反應(yīng)結(jié)束后80℃滅酶2 min；并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。

1.3.4.1 反應(yīng)溫度優(yōu)化

分別將反應(yīng)溫度設(shè)置為61、63、65、67℃，其他條件保持不變，進(jìn)行real-time LAMP反應(yīng)。

1.3.4.2 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化

將外引物濃度固定為0.2 μmol/L，根據(jù)內(nèi)外引物濃度比為 4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1共設(shè)置 5組試驗(yàn)組，反應(yīng)體系中的其他成分保持不變，進(jìn)行real-time LAMP反應(yīng)。

1.3.4.3 Mg2+濃度優(yōu)化

將 Mg2+濃度分別設(shè)定為 2、4、6、8 mmol/L，其他條件保持不變，進(jìn)行real-time LAMP反應(yīng)。

1.3.5 real-time LAMP檢測(cè)方法特異性驗(yàn)證

分別以單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株以及12株非目標(biāo)菌株對(duì)所建立的real-time LAMP體系進(jìn)行特異性的驗(yàn)證。熒光擴(kuò)增曲線為“S”型或類“S”型則判定為陽(yáng)性。

1.3.6 real-time LAMP檢測(cè)方法靈敏度

以10倍梯度稀釋單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA為模板，以dd H2O作為空白對(duì)照，根據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行real-time LAMP，確定方法的靈敏度。

1.3.7 DARQ-LAMP方法的建立

QPD探針的孵育：20 μmol/L內(nèi)引物/探針與20 μmol/L標(biāo)記的探針/內(nèi)引物等體積混合均勻，用錫紙避光包裹，98℃恒溫金屬浴2 min，自然冷卻至室溫26℃，分裝于1.5 mL離心管中，于-20℃冰箱保存。

優(yōu)化前DARQ-LAMP反應(yīng)體系（20μL）：1.6 μmol/L BIP（0.8 μmol/L BIP 和 0.8 μmol/L QPD），1.6 μmol/L FIP，F(xiàn)3 與 B3 各 0.2 μmol/L，Bst DNA 聚合酶 0.32 U/μL，10×Reation Buffer 2 μL，dNTPs 1.4 mmol/L，Mg2+8 mmol/L，DNA模板1.6 μL，補(bǔ)充無(wú)菌蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為65℃1 min，共60個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)；反應(yīng)結(jié)束后80℃滅酶2 min。

1.3.7.1 Bst DNA聚合酶的篩選

選擇Bst DNA聚合酶（大片段）、Bst DNA 2.0聚合酶和Bst DNA 3.0聚合酶進(jìn)行DARQ-LAMP反應(yīng)，考察DARQ-LAMP擴(kuò)增曲線和擴(kuò)增效率。

1.3.7.2 QPD探針濃度優(yōu)化

由于加入熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，使整個(gè)反應(yīng)體系更為復(fù)雜，QPD在一定的濃度下會(huì)抑制LAMP擴(kuò)增，因此，分別將QPD探針濃度設(shè)置為體系的0%、10%、25%、50%、75%、100%，以確定適宜的濃度。

1.3.7.3 Mg2+濃度優(yōu)化

將 Mg2+濃度分別設(shè)定為 2、4、6、8 mmol/L，反應(yīng)體系中其他組成保持不變，進(jìn)行實(shí)時(shí)DARQ-LAMP反應(yīng)。

1.3.8 DARQ-LAMP特異性的評(píng)價(jià)

以單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株以及12株非目標(biāo)菌株進(jìn)行DARQ-LAMP反應(yīng)，對(duì)方法的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。熒光擴(kuò)增曲線為“S”型或類“S”型則判定為陽(yáng)性。

1.3.9 DARQ-LAMP靈敏度的評(píng)價(jià)

分別以10倍梯度稀釋的目標(biāo)菌株DNA為模板，以ddH2O為空白對(duì)照，根據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行DARQLAMP反應(yīng)，確定方法的靈敏度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)平行進(jìn)行3次，熒光定量PCR儀中導(dǎo)出LAMP反應(yīng)擴(kuò)增曲線，利用GraphPad Prism 8和Origin進(jìn)行圖像處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立檢測(cè)單增李斯特菌的real-time LAMP

2.1.1 反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果

基于hlyA的real-time LAMP的反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 基于hlyA的real-time LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the reaction temperature for real-time LAMP based on hlyA

由圖1可知，在63℃時(shí)循環(huán)數(shù)閾值（cycle threshold，Ct）值最小，且熒光值最大，為檢測(cè)單增李斯特菌的最適宜溫度，此外，溫度為67℃時(shí)反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。

a、b、c、d 分別為 61、63、65、67 ℃下的反應(yīng)結(jié)果。

2.1.2 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化結(jié)果

基于hlyA的real-time LAMP內(nèi)外濃度比的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 基于hlyA的real-time LAMP反應(yīng)內(nèi)外引物比的優(yōu)化Fig.2 Optimization of inner to outer primer ratio for real-time LAMP based on hlyA

由圖2可知，當(dāng)內(nèi)外引濃度物比為6∶1時(shí)，反應(yīng)的Ct值最小，擴(kuò)增產(chǎn)物熒光值最高，因此該方法的適宜內(nèi)外引物濃度比為6∶1。

2.1.3 Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果

基于hlyA的real-time LAMP的Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于hlyA的real-time LAMP反應(yīng)Mg2+濃度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of Mg2+concentration for real-time LAMP based on hlyA

由圖 3 可知，當(dāng) Mg2+濃度在 4、6、8 mmol/L 時(shí)，realtime LAMP反應(yīng)有擴(kuò)增，Mg2+濃度在2 mmol/L時(shí)反應(yīng)不能正常進(jìn)行，隨著Mg2+濃度的增加，Ct值變小，且熒光值增強(qiáng)。當(dāng)Mg2+濃度為6mmol/L時(shí)，Ct值最小且熒光值最大，擴(kuò)增曲線形狀也更好。當(dāng)Mg2+濃度為8 mmol/L時(shí)，Ct值增加，熒光值也減小，由此可見(jiàn)Mg2+濃度過(guò)低時(shí)反應(yīng)不能正常進(jìn)行，而濃度過(guò)高則抑制LAMP反應(yīng)，即基于hlyA的real-time LAMP反應(yīng)的適宜Mg2+濃度為6 mmol/L。

2.1.4 real-time LAMP檢測(cè)方法的特異性

基于hlyA的real-time LAMP的特異性見(jiàn)圖4。

圖4 基于hlyA的real-time LAMP方法的特異性Fig.4 Specificity of the hlyA-based real-time LAMP

由圖4a可知，建立的real-time LAMP檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)菌的DNA模板均呈陽(yáng)性擴(kuò)增，而12株非目標(biāo)菌株均無(wú)擴(kuò)增。由圖4b可知，該檢測(cè)方法中單增李斯特菌的特征熔解峰的熔解溫度（melting temperature，Tm）為85℃左右。結(jié)果表明，以hlyA為靶基因的real-time LAMP方法具有較好的特異性，引物設(shè)計(jì)可行。

2.1.5 real-time LAMP檢測(cè)方法的靈敏度結(jié)果

以 10倍梯度稀釋（7.3×100copies/mL～7.3×107copies/mL）的單增李斯特菌的DNA模板進(jìn)行real-time LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖5。

圖5 基于hlyA的real-time LAMP檢測(cè)方法靈敏度Fig.5 Sensitivity of the real-time LAMP based on hlyA

由圖5可知，該方法的檢測(cè)限為7.3×101copies/mL。

PCR的靈敏度結(jié)果如圖6所示。

圖6 基于hlyA的PCR靈敏度Fig.6 Sensitivity of PCR based on hlyA

由圖6可知，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR的靈敏度為7.3×103copies/mL。real-time LAMP方法是PCR檢測(cè)靈敏度的100倍。

2.2 DARQ-LAMP方法的建立

2.2.1 Bst DNA聚合酶的篩選結(jié)果

已有研究表明，在反應(yīng)體系中Bst DNA聚合酶活性會(huì)受到熒光劑、淬滅劑的影響，因此Bst DNA聚合酶的選擇對(duì)DARQ-LAMP的反應(yīng)體系有很大的影響。Bst DNA聚合酶的篩選見(jiàn)圖7。

圖7 Bst DNA聚合酶的篩選Fig.7 Screening of Bst DNA polymerases

如圖7所示，以hlyA基因進(jìn)行DARQ-LAMP反應(yīng)，Bst DNA LF聚合酶幾乎無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，Bst DNA 2.0聚合酶雖然有擴(kuò)增反應(yīng)，但是其擴(kuò)增效率太低，而Bst DNA 3.0聚合酶擴(kuò)增效率高、擴(kuò)增曲線好，故選擇Bst DNA 3.0聚合酶。

2.2.2 QPD探針濃度優(yōu)化結(jié)果

QPD探針濃度設(shè)置為體系的0%、10%、25%、50%、75%、100%，結(jié)果見(jiàn)圖 8。

圖8 QPD探針濃度優(yōu)化Fig.8 Optimization of QPD concentration

由圖8可知，反應(yīng)在10%、50%的QPD探針濃度下均可擴(kuò)增，25%的QPD探針濃度下hlyA基因雖有擴(kuò)增反應(yīng)，但是擴(kuò)增效率低。從整體上看，在50%的QPD探針濃度下雖然熒光值很高，但是基因擴(kuò)增效率偏低，10%的QPD探針濃度下熒光值在2 000 RFU左右，擴(kuò)增效率較高，因此選擇10%的QPD探針濃度。

2.2.3 Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果

DARQ-LAMP反應(yīng)Mg2+濃度優(yōu)化見(jiàn)圖9。

圖9 DARQ-LAMP反應(yīng)Mg2+濃度優(yōu)化Fig.9 Optimization of Mg2+concentration in DARQ-LAMP

由圖9可知，以hlyA為靶基因建立的單重DARQLAMP反應(yīng)中，Mg2+濃度為6 mmol/L時(shí)，DARQ-LAMP擴(kuò)增效率最高。因此，DARQ-LAMP反應(yīng)體系的適宜Mg2+濃度為 6 mmol/L。

2.2.4 DARQ-LAMP特異性的評(píng)價(jià)結(jié)果

DARQ-LAMP反應(yīng)的特異性見(jiàn)圖10。

圖10 DARQ-LAMP反應(yīng)的特異性Fig.10 Specificity of DARQ-LAMP

由圖10可知，以hlyA基因建立的DARQ-LAMP方法只對(duì)靶標(biāo)反應(yīng)，非目標(biāo)菌株均無(wú)擴(kuò)增，表明所建立的DARQ-LAMP方法具有較好的特異性。

2.2.5 DARQ-LAMP靈敏度的評(píng)價(jià)結(jié)果

對(duì)DARQ-LAMP方法進(jìn)行靈敏度分析，結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖11 DARQ-LAMP的靈敏度Fig.11 Sensitivity of DARQ-LAMP

由圖11可知，以7.3×100copies/mL～7.3×107copies/mL的10倍梯度稀釋的單增李斯特菌DNA模板進(jìn)行DARQ-LAMP反應(yīng)，方法的檢測(cè)限為7.3×101copies/mL。

3 討論與結(jié)論

食源性致病菌一直是引發(fā)食品安全事件的重要因素。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法雖具有較高的準(zhǔn)確性，但需培養(yǎng)及生化實(shí)驗(yàn)，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)且操作較復(fù)雜。近年來(lái)一些新方法、新技術(shù)逐漸被運(yùn)用，其中LAMP技術(shù)因其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、成本低且不依賴精密儀器的特點(diǎn)，已經(jīng)成為檢測(cè)困難樣品的有效分析方法，廣泛應(yīng)用于食源性疾病的檢測(cè)。目前已有較多的傳統(tǒng)LAMP技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)中，但因其需要在反應(yīng)終點(diǎn)開蓋對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行染色，無(wú)法完全做到特異性識(shí)別，且容易造成氣溶膠污染。本研究建立的real-time LAMP方法對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行快速檢測(cè)，可避免此問(wèn)題，從而提高特異性。但real-time LAMP技術(shù)由于使用的熒光染料易造成假陽(yáng)性問(wèn)題，給實(shí)際檢測(cè)造成不便。

因此，本研究在real-time LAMP方法的基礎(chǔ)上建立DARQ-LAMP方法，分別在對(duì)應(yīng)一條內(nèi)引物的5’端修飾熒光基團(tuán)（或淬滅基團(tuán)），并加入一條與F1c（或B1c）部分互補(bǔ)且3’端修飾淬滅基團(tuán)（或熒光基團(tuán)）的探針。此時(shí)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離相近使熒光淬滅，當(dāng)目的基因存在時(shí)，反應(yīng)擴(kuò)增，內(nèi)引物與探針?lè)珠_，淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)分開，激發(fā)熒光基團(tuán)發(fā)光，從而進(jìn)行快速檢測(cè)。本方法的適宜反應(yīng)溫度為63℃、Mg2+濃度為6 mmol/L；通過(guò)篩選確定Bst 3.0 DNA聚合酶作為擴(kuò)增酶，其具有擴(kuò)增效率高和穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)；QPD探針濃度為10%，在此濃度下，單增李斯特菌的擴(kuò)增效率較高，熒光值較大。研究表明，建立的單增李斯特菌DARQ-LAMP檢測(cè)方法具有較好的特異性和靈敏度，檢測(cè)限為7.3×101copies/mL，靈敏度是普通PCR的100倍。

在DARQ-LAMP方法的探針幫助下，能快速準(zhǔn)確地對(duì)致病菌進(jìn)行檢測(cè)，本研究的結(jié)果證明了DARQLAMP方法的可行性，后續(xù)可嘗試建立多重DARQLAMP方法，利用分子拉鏈?zhǔn)窖h(huán)擴(kuò)增，將探針與內(nèi)引物分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，雜交形成淬滅探針雙鏈，實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)管中對(duì)多個(gè)目的基因的快速、高效檢測(cè)。未來(lái)可將DARQ-LAMP方法應(yīng)用于更多種類的食源性致病菌檢測(cè)，建立更多的反應(yīng)體系從而拓寬其在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用范圍。以DARQLAMP方法為基礎(chǔ)的延伸技術(shù)在食品安全監(jiān)管領(lǐng)域前景廣闊。然而，單種檢測(cè)方法有其局限性，未來(lái)可嘗試將這種方法與其他方法結(jié)合，將不同方法的優(yōu)勢(shì)整合。例如與微流控技術(shù)、芯片實(shí)驗(yàn)室等微型實(shí)驗(yàn)室技術(shù)相結(jié)合，由于其能分隔成多個(gè)反應(yīng)單元，避免了開蓋可能形成的氣溶膠污染等，同時(shí)滿足多樣本、多菌種同步定性檢測(cè)及鑒定的需求，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)技術(shù)的微型化、自動(dòng)化。未來(lái)可研發(fā)試劑消耗少、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)小以及更適合對(duì)較多靶標(biāo)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的DARQ-LAMP方法，使其具有更廣闊的適用范圍和更強(qiáng)的應(yīng)用潛力，能快速、精準(zhǔn)地檢測(cè)食源性致病菌。