李秀萍，張葦莉，劉琨毅，黎粵悅，吳決連，李楠*

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644003；2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.廣西益譜檢測技術(shù)有限公司，廣西 南寧 530007）

青錢柳（Cyclocarya paliurus），因其果實(shí)長得如同一串串的銅錢，所以又稱為金錢柳。青錢柳含有植物多糖、黃酮、多酚、萜類、皂苷等多種活性物質(zhì)，因此青錢柳能明顯降低機(jī)體膽固醇、甘油三酯，可用于糖尿病、高血壓、高血脂等疾病的預(yù)防和治療[1-3]。青錢柳多糖具抗癌[4]和抗氧化[5]的作用。巴拉吉紅米為主要生長于貴州黔東南高山梯田上的一種紅米，其含花色苷，故其顏色紅如瑪瑙。巴拉吉紅米營養(yǎng)價(jià)值極高，含有多酚、維生素、黃酮、γ-氨基丁酸等活性物質(zhì)[6-7]，且富含硒、鋅、鐵等微量元素[8]，所以具有抗氧化[9]、改善腦血流通[10]、預(yù)防癌癥[11]等功效。由此可見，青錢柳和巴拉吉紅米均具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

目前，對于青錢柳的研究主要為多糖[12-13]和黃酮[14-15]的提取與功效[16-17]，還有少量以青錢柳為原輔料進(jìn)行發(fā)酵食品的研究，如趙立春等[18-19]研制的青錢柳無糖茶凍和青錢柳雜糧代餐粉；魯青等[20]研究的青錢柳-葛根復(fù)合發(fā)酵型飲料；黃元河等[21]研究的青錢柳速溶茶等。然而，以青錢柳為原輔料釀酒，以及青錢柳經(jīng)發(fā)酵成為發(fā)酵食品后對其進(jìn)行成分分析的報(bào)道較少。本研究以巴拉吉紅米為主料，配以青錢柳為輔料，經(jīng)過浸漬、蒸煮，再添加微生物復(fù)合菌種發(fā)酵得到青錢柳紅米復(fù)合酒，并初步探討發(fā)酵生產(chǎn)工藝，分析復(fù)合酒的成分，從而證明利用青錢柳復(fù)合紅米可以制備富含營養(yǎng)成分的發(fā)酵型復(fù)合酒，以期為青錢柳的開發(fā)利用及青錢柳發(fā)酵食品的成分分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴拉吉紅米、青錢柳樣品：貴州雷山縣瑞康生態(tài)農(nóng)業(yè)投資有限公司；微生物復(fù)合菌種：廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)，主要由根霉、米曲霉和酵母組成。

γ-氨基丁酸（分析純）：美國SIGMA公司；葡萄糖（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆?。ǚ治黾儯荷锕こ躺虾Ｓ邢薰?；氫氧化鈉、亞硝酸鈉（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；苯酚、硫酸、硝酸鋁、無水乙醇、四硼酸鈉、次氯酸鈉（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101-2-BS-Ⅱ）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；酒精計(jì)：廣州市銘睿電子科技有限公司；分析天平（PL303）：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；雷磁pH計(jì)（PSH-3C）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250A）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋（TW-12）：重慶雅馬拓科技有限公司；分光光度計(jì)（uv1800）：日本株式會(huì)社島津制作所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青錢柳紅米復(fù)合酒生產(chǎn)工藝流程

青錢柳加水煮沸→制備青錢柳浸提液→浸提液浸泡紅米→米飯蒸煮→冷卻→接種→發(fā)酵→過濾→青錢柳紅米復(fù)合酒

1.3.2 青錢柳紅米復(fù)合酒生產(chǎn)工藝操作要點(diǎn)

青錢柳浸提液的制備：青錢柳葉與水料液比1∶1.5（g/mL），100℃下加熱 20 min，過濾，制成青錢柳浸提液備用。

浸泡紅米：利用制備的青錢柳浸提液浸泡紅米12 h。

米飯蒸煮：浸泡的紅米隔水蒸30 min，要求米粒完整、熟而不糊、透而不爛、疏松均勻。

冷卻：蒸煮成熟的紅米飯，攤開冷卻，攤涼至30℃左右。

接種：按試驗(yàn)要求的接種量，稱取微生物復(fù)合菌種，均勻撒于攤涼的米飯上，攪拌，使飯粒和菌種完全混勻。

發(fā)酵：將拌好的紅米飯移入三角瓶中，壓實(shí)不留縫隙，保鮮膜封口，橡皮筋包扎，置于生化培養(yǎng)箱中，28℃發(fā)酵至酒精度穩(wěn)定。

過濾：用小型空壓過濾機(jī)進(jìn)行膜過濾，制得青錢柳紅米復(fù)合酒。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以酒精度為指標(biāo)，考察青錢柳紅米復(fù)合酒發(fā)酵工藝中的紅米與青錢柳浸漬液料液比[1 ∶0、1 ∶0.5、1 ∶1.0、1∶1.5、1 ∶2.0（g/mL）]、微生物復(fù)合菌種接種量（0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%）、發(fā)酵溫度（26、28、30、32、34 ℃）和發(fā)酵時(shí)間（4、6、8、10、12 d）對酒精度的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以微生物復(fù)合菌種接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、紅米與青錢柳浸漬液的料液比（D）進(jìn)行L16（44）的正交試驗(yàn)，分別測定酒精度確定青錢柳紅米復(fù)合酒的最佳發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of orthogonal test

1.3.5 理化指標(biāo)測定

酒精度參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》中的第二法測定，再換算成20℃時(shí)樣品的酒精度；還原糖采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid method，DNS）法[22]測定；總酸參照GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測定》中的方法進(jìn)行測定；總酯采用酸堿滴定法[23]測定。

1.3.6 成分測定

植物多糖采用苯酚-硫酸法[24]測定；黃酮采用紫外分光光度法[25]測定；總酚采用福林-酚法[26]測定；γ-氨基丁酸參照文獻(xiàn)[27]測定；氨基酸參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》，采用氨基酸分析儀測定；微量元素參照GB 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測定》，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS）法測定。

1.3.7 安全性指標(biāo)檢測

菌落總數(shù)的測定參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》；大腸桿菌數(shù)參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》測定；鉛、無機(jī)砷、鎘、錫參照NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》中要求的GB 5009系列方法，采用ICP-MS法測定。黃曲霉毒素B1參照GB 5009.22—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》中的酶聯(lián)免疫法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用Microsoft Office Excel 2019和origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 紅米與青錢柳浸漬液料液比對酒精度的影響

紅米與青錢柳浸漬液料液比對酒精度的影響見圖1。

圖1 紅米與青錢柳浸漬液料液比對酒精度的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio of red rice to C.paliurus extract on alcohol content

由圖1可知，隨著紅米與青錢柳浸漬液料液比的增加，青錢柳紅米復(fù)合酒酒精度先增加后減少，當(dāng)紅米與青錢柳浸漬液的料液比為1∶1.0時(shí)，酒精度最高，為16.3%vol。當(dāng)紅米與青錢柳浸漬液料液比低于1∶1.0時(shí)，隨著青錢柳浸提液添加量的增加，浸泡和蒸煮時(shí)紅米的含水量增大，紅米中的淀粉水解和糖化增強(qiáng)，并且該作用在紅米與青錢柳浸漬液料液比為1∶1.0時(shí)達(dá)到最大；但當(dāng)紅米與青錢柳浸漬液料液比超過1∶1.0時(shí)，酒精度又明顯下降，這可能是高濃度青錢柳中的黃酮對混合微生物菌株中某種菌株生長具有抑制作用，與相關(guān)報(bào)道[28]一致，青錢柳黃酮含量達(dá)到一定濃度時(shí)可以抑制霉菌或細(xì)菌的生長。

2.1.2 微生物復(fù)合菌種接種量對酒精度的影響

不同微生物復(fù)合菌種接種量對酒精度的影響見圖2。

圖2 微生物復(fù)合菌種接種量對酒精度的影響Fig.2 Effect of inoculation amount of microbial strains on alcohol content

由圖2可知，青錢柳紅米復(fù)合酒的酒精度隨著微生物復(fù)合菌種接種量的增加，呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，當(dāng)微生物復(fù)合菌種接種量（體積分?jǐn)?shù)）為1.2%時(shí)，酒精度最高，達(dá)到15.8%vol。隨著微生物復(fù)合菌種接種量的增加，混合菌株中相應(yīng)的霉菌和酵母菌數(shù)量均有所增加，微生物對淀粉的水解和糖化作用增強(qiáng)，從而有更多的底物被酵母菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精，使酒精度增加。但是微生物復(fù)合菌種接種量超過1.2%時(shí)，發(fā)酵液中的微生物濃度過高，需要消耗更多的底物用于維持菌種生長，造成可用于酒精發(fā)酵的底物反而減少，從而導(dǎo)致酒精的生成量減少。

2.1.3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響

不同發(fā)酵溫度對酒精度的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，青錢柳紅米復(fù)合酒中酒精度呈先上升后下降的趨勢。發(fā)酵溫度為30℃時(shí)酒精度最高，為16.5%vol。當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，微生物復(fù)合菌種中的霉菌和酵母菌不僅生長受到抑制，而且用于淀粉水解、糖化和酒精發(fā)酵的酶的活性也減弱，使得底物轉(zhuǎn)化效率不高，導(dǎo)致糖化作用和酒精發(fā)酵進(jìn)行得緩慢，酒精得率低；當(dāng)發(fā)酵溫度適宜時(shí)，微生物生長、發(fā)酵旺盛，酒精度高。當(dāng)發(fā)酵溫度過高，微生物菌株的生長受到抑制甚至死亡，從而導(dǎo)致酒精產(chǎn)量下降。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對酒精度的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，青錢柳紅米復(fù)合酒的酒精度呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。發(fā)酵到第10天時(shí)，酒精度最高，為15.6%vol。發(fā)酵時(shí)間過短，混合微生物菌株濃度不高，有很多底物未被轉(zhuǎn)化完全，致使底物轉(zhuǎn)化率低，從而酒精得率低；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過10 d后，隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長，酒精度不再增加而趨于平穩(wěn)，結(jié)果說明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，培養(yǎng)基中用于酒精發(fā)酵的原料物質(zhì)耗盡而影響酒精的增加。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L16（44）正交試驗(yàn)確定青錢柳紅米復(fù)合酒發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，結(jié)果如表2所示。對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Orthogonal test analysis of variance

由表2和3可知，影響青錢柳紅米復(fù)合酒發(fā)酵的主次因素為C（發(fā)酵時(shí)間）＞B（發(fā)酵溫度）＞A（微生物復(fù)合菌種接種量）＞D（紅米與青錢柳浸漬液料液比），其中發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對青錢柳紅米復(fù)合酒酒精度有顯著影響（P＜0.05）；最佳的工藝組合為 A2B3C2D3，即微生物復(fù)合菌種接種量0.8%、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間10 d、紅米與青錢柳浸漬液料液比為1∶1.0（g/mL）。為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，按照最優(yōu)組合，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的青錢柳紅米復(fù)合酒的平均酒精度為16.3%vol，與正交試驗(yàn)中最高的第5組結(jié)果相近（相對偏差0.613%），說明正交試驗(yàn)的可靠性。

2.3 青錢柳紅米復(fù)合酒成分分析

2.3.1 理化指標(biāo)與微量元素分析

對青錢柳紅米復(fù)合酒理化指標(biāo)和微量元素進(jìn)行分析可知，青錢柳紅米復(fù)合酒的酒精度為16.3%vol、還原糖為9.1 g/L、總酸為6.1 g/L、總酯為0.71 g/L。此外，青錢柳紅米復(fù)合酒中含有鐵、銅、鋅、錳和硒微量元素，尤其是青錢柳紅米復(fù)合酒還含有0.039 mg/kg的硒元素，可認(rèn)為該復(fù)合酒為含硒食品。

2.3.2 安全性指標(biāo)

復(fù)合酒安全性指標(biāo)見表4。

表4 復(fù)合酒安全性指標(biāo)Table 4 Security indexes of compound wine

由表4可知，青錢柳紅米復(fù)合酒菌落總數(shù)和大腸桿菌數(shù)均未檢出，微生物符合NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》標(biāo)準(zhǔn)的要求；有毒有害物質(zhì)中，錫未檢出，黃曲霉毒素B1未檢出，鉛≤0.3 mg/kg，無機(jī)砷≤0.15 mg/kg，鎘≤0.2 mg/kg，有毒有害物質(zhì)未超標(biāo)。以上結(jié)果說明，青錢柳紅米復(fù)合酒是一種安全的發(fā)酵食品。

2.3.3 活性成分分析

活性成分分別以植物多糖、黃酮、總酚和γ-氨基丁酸作為測定指標(biāo)，利用單純紅米發(fā)酵酒和青錢柳紅米復(fù)合酒進(jìn)行比對試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 復(fù)合酒活性成分分析Table 5 Functional component analysis of compound wine mg/100 g

由表5可知，添加青錢柳可以使紅米酒中4種活性成分的含量均增加，其中植物多糖含量達(dá)到573.2 mg/100g，比紅米酒增加6倍多；黃酮含量為196.3mg/100 g，增幅達(dá)到1.7倍；總酚含量為201.2 mg/100 g，比未添加青錢柳的紅米酒增加近1倍；相對于紅米酒，青錢柳紅米復(fù)合酒中γ-氨基丁酸略有增加。通過試驗(yàn)證明利用青錢柳紅米復(fù)合發(fā)酵可以生產(chǎn)富含活性成分的復(fù)合酒。

2.3.4 氨基酸成分分析

復(fù)合酒氨基酸成分分析見表6。

表6 復(fù)合酒氨基酸成分分析Table 6 Amino acid composition analysis of compound wine

由表6可知，紅米酒和青錢柳紅米復(fù)合酒中均含16種氨基酸，其中必需氨基酸均為5種，氨基酸總含量分別為3 871.6 mg/L、7 976.4 mg/L，由此可見添加青錢柳后，青錢柳紅米復(fù)合酒中的總氨基酸得到了成倍增加，提高了青錢柳紅米復(fù)合酒的營養(yǎng)價(jià)值。根據(jù)蔣瀅等[29]的報(bào)道，不同的氨基酸呈現(xiàn)不同的味覺，可將氨基酸分為甜味、苦味、酸味、鮮味氨基酸，本研究中添加青錢柳后，青錢柳紅米復(fù)合酒中的每種氨基酸含量均高于紅米酒，因此添加青錢柳會(huì)使青錢柳紅米復(fù)合酒的甜味、苦味、酸味、鮮味得到提升，使青錢柳紅米復(fù)合酒的口感更加豐富。

3 結(jié)論

本研究通過制備青錢柳浸提液，巴拉吉紅米浸泡、蒸煮，再添加微生物復(fù)合菌種進(jìn)行發(fā)酵，以微生物復(fù)合菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、紅米與青錢柳浸漬液料液比為考察對象進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，測定發(fā)酵液酒精度，確定了青錢柳紅米復(fù)合酒發(fā)酵的最佳工藝為紅米與青錢柳浸漬液料液比為1∶1.0（g/mL）、微生物復(fù)合菌種接種量0.8%、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間10 d。在最優(yōu)條件下，得到的青錢柳紅米復(fù)合酒的酒精度為16.3%vol、還原糖為9.1 g/L、總酸為6.1 g/L、總酯為0.71 g/L，含有鐵、銅、鋅、錳和硒等微量元素。經(jīng)過安全性指標(biāo)分析表明，該青錢柳紅米復(fù)合酒中的微生物符合要求，有毒有害物質(zhì)未超標(biāo)。成分分析表明，青錢柳紅米復(fù)合酒含植物多糖573.2 mg/100 g、黃酮196.3mg/100g、總酚 201.2mg/100g、γ-氨基丁酸 24.2mg/100 g；含有16種氨基酸，其中5種為必需氨基酸，氨基酸總含量為7 976.4 mg/L；此外還含有0.039 mg/kg的硒元素。通過試驗(yàn)證明，青錢柳復(fù)合紅米發(fā)酵生產(chǎn)的青錢柳紅米復(fù)合酒是一種富含營養(yǎng)成分的發(fā)酵食品。此外，本研究發(fā)現(xiàn)青錢柳紅米復(fù)合酒含有黃酮、多酚，今后可對其抗氧化功能進(jìn)行研究。